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      一種分子量范圍可控的多肽的制備方法及裝置與流程

      文檔序號(hào):11613137閱讀:373來源:國(guó)知局

      本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,涉及一種多肽的制備方法,具體地,涉及一種分子量范圍可控的多肽的制備方法及裝置。



      背景技術(shù):

      多肽是氨基酸以肽鍵連接在一起而形成的化合物,可從動(dòng)物或植物體內(nèi)直接提取,也可以蛋白質(zhì)為原料通過化學(xué)法或生物法降解獲得。多肽在人體內(nèi)具有易消化、吸收率快和利用率高等特點(diǎn),其吸收機(jī)制主要基于肽運(yùn)轉(zhuǎn)載體實(shí)現(xiàn)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的方式實(shí)現(xiàn),是傳統(tǒng)代謝模式認(rèn)為蛋白質(zhì)必須水解成游離氨基酸才能被吸收機(jī)制的重要補(bǔ)充。多肽吸收過程主要分為三種類型,包括依賴h+濃度或ca2+濃度的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過程、ph依賴性的非耗能性na+/h+交換轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和谷胱甘肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。多肽吸收特點(diǎn)主要包括:易消化吸收,該過程與多肽序列長(zhǎng)度、氨基酸組成密切相關(guān),部分多肽的吸收不受到人體內(nèi)的酶催化的二次水解過程影響,以完整肽的形式直接進(jìn)入人體循環(huán)系統(tǒng)并發(fā)揮其功能;吸收過程快,進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的時(shí)間短,可快速發(fā)揮作用;吸收效率高,部分肽可100%吸收且沒有任何廢物及排泄物;主動(dòng)吸收,迫使活性肽吸收入體內(nèi);吸收過程能耗極低,不會(huì)增加胃腸功能負(fù)擔(dān);具有一定的載體作用,將部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)載輸送到人體的細(xì)胞或組織。此外,多肽作為食品其安全性高,針對(duì)營(yíng)養(yǎng)不良或消化吸收有問題的病人,配方食品中的多肽或蛋白質(zhì)水解物已經(jīng)逐漸成為補(bǔ)充氮源的重要原料,提供人體生長(zhǎng)發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。多肽作為一種新興的功能性蛋白配料近年來在國(guó)內(nèi)外發(fā)展迅速,在功能性食品、飲料、化妝品以及藥品等領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛。

      蛋白質(zhì)的多樣性和復(fù)雜性使其降解形成的多肽功能肽及其活性種類十分豐富,目前已被證明的生物活性包括保護(hù)胃黏膜及抗?jié)冏饔?、抗過敏、降血壓、降膽固醇、抗衰老、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)傷口愈合、增強(qiáng)骨強(qiáng)度和預(yù)防骨質(zhì)疏松、預(yù)防關(guān)節(jié)炎、促進(jìn)角膜上皮損傷的修復(fù)和促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)等。多肽的活性種類與其來源和分子量范圍密切相關(guān),研究表明扇貝酶解產(chǎn)物中存在抗氧化多肽,其中相對(duì)分子質(zhì)量為0.8-1kda范圍內(nèi)的多肽具有較強(qiáng)的抗氧化損傷作用并能清除超氧負(fù)離子和羥自由基,可顯著增強(qiáng)免疫細(xì)胞的代謝和增殖。鱈魚酶解產(chǎn)物中存在具有降低血壓活性的多肽,隨其相對(duì)分子質(zhì)量降低其活性助劑升高,其中在相對(duì)分子質(zhì)量為3k的多肽具有最強(qiáng)的ace抑制活性;以阿拉斯加狹鱈魚皮膠原蛋白為原料,酶解產(chǎn)物中存在相對(duì)分子質(zhì)量為0.9-1.9kda范圍內(nèi)具有較高ace抑制活性。海洋生物酶解產(chǎn)物中還存在抗菌肽,海洋生物亞洲鱟中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽分子量為2.3da,貽貝酶解產(chǎn)物中存在分子量為4.4kda的防御素,美洲擬鰈的皮膚黏液降解物中存在分子量2.7kda的線性抗菌肽;牡蠣酶解液經(jīng)柱層析分離后分子量低于5kda的多肽混合物中存在降血糖活性多肽;此外,許多蛋白降解物中還存在抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等生物活性多肽。可見,多肽的分子量范圍對(duì)其生物活性影響非常顯著,分子量范圍控制對(duì)于提高多肽的生物活性具有重要意義。

      傳統(tǒng)的控制多肽分子量的方法是首先將蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解,在采用膜分離技術(shù)對(duì)不同分子量的多肽進(jìn)行分離;一方面酶解過程可將蛋白質(zhì)降解成為不同分子量的多肽,另一方面膜分離過程可根據(jù)選擇不同類型的膜制備出低于截留分子量的多肽。201610298693.6公開了一種混合酶解-膜過濾制備中華鱉降壓肽的方法,該方法包括原料預(yù)處理、混合酶水解、滅酶、離心過濾、膜過濾、凍干等關(guān)鍵步驟;201510676592.3公開了基于二步酶解和酶膜反應(yīng)制備低致敏性乳清蛋白粉的方法,該方法以乳清為底物,利用二步蛋白酶解技術(shù)水解乳清蛋白中的致敏位點(diǎn),利用膜的選擇性透過作用,分離獲得分子量低于1kda的無致敏位點(diǎn)的蛋白水解物;201310004236.8公開了一種連續(xù)酶解與二級(jí)膜過濾提純制備大米蛋白活性多肽的方法,該方法以堿性蛋白酶和大米蛋白為主要原料進(jìn)行酶解反應(yīng),通過超濾膜、納濾膜和噴霧干燥等步驟制備大米蛋白活性多肽。類似的專利還有很多,201010188410.5公開了一種不補(bǔ)料酶解-膜分離耦合制備魚鱗膠原蛋白抗氧化肽的方法,200310107554.3公開了一種酶解與膜濾集成連續(xù)制取酪蛋白生物活性多肽的工藝,200810061920.9公開了一種利用酶解與膜濾耦合技術(shù)連續(xù)制備窄分子量分布燕窩提取物的方法,201010523747.7公開了一種酶解和膜分離制備免疫活性大豆肽的方法,201310137894.4公開了一種利用酶膜反應(yīng)器連續(xù)制備蠶蛹蛋白抗氧化肽的方法,201110112515.7公開了一種利用酶膜反應(yīng)器制備燕麥抗氧化肽的方法等。

      采用固定化酶耦合膜分離的方法也有文獻(xiàn)報(bào)道,但主要采用柱式固定化酶反應(yīng)器串聯(lián)膜分離技術(shù)實(shí)現(xiàn),或?qū)⒚钢苯庸潭ㄔ谥锌绽w維膜上實(shí)現(xiàn)。類似的研究或綜述報(bào)道包括,“化工時(shí)刊,2004,18(1):13-17”公開的酶膜反應(yīng)器及其工業(yè)應(yīng)用研究,“食品安全導(dǎo)刊,2014,11:76-78”公開的酶膜反應(yīng)器及其應(yīng)用,“化學(xué)與生物工程,2017,34(2):25-32”公開的酶膜耦合法制備均一分子量膠原蛋白多肽,“食品工業(yè)科技,2000,21(1):30-31”公開的牛乳蛋白在膜反應(yīng)器中的酶解,“食品工業(yè)科技,2010,31(8):208-212”公開的酶膜反應(yīng)器連續(xù)酶解花生蛋白的工藝研究,“2000,16(4):337-342”公開了動(dòng)態(tài)膜分離式固定化酶反應(yīng)器操作性能的研究等,其它類似的研究主要是采用酶反應(yīng)結(jié)合膜分離技術(shù)在多肽或糖水解產(chǎn)物制備領(lǐng)域的具體應(yīng)用。這些基于酶解并進(jìn)一步膜分離的多肽制備過程中,一方面蛋白質(zhì)酶解過程中釋放出的多肽在溶液中會(huì)被繼續(xù)酶解,膜分離后的多肽混合物中存在大量的分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于膜截留分子量的多肽,導(dǎo)致制備出的多肽分子量分布范圍過于寬泛;另一方面?zhèn)鹘y(tǒng)方法難于制備分子量范圍較高的多肽,尤其難于制備平均分子量高于酶的分子量的多肽,且容易導(dǎo)致酶解產(chǎn)物中存在一定的蛋白酶殘留。



      技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

      針對(duì)傳統(tǒng)的基于酶解和膜分離的多肽制備方法可能存在的問題,本發(fā)明旨在提供一種分子量范圍可控的多肽制備方法及裝置,所述方法步驟簡(jiǎn)單,制備的多肽分子量可控。

      為達(dá)此目的,本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案:

      第一方面,本發(fā)明提供了一種分子量范圍可控的多肽的制備方法,包括如下步驟:

      (1)酶固定化:將蛋白酶共價(jià)偶聯(lián)在多孔微球上;

      (2)裝膜:將負(fù)載固定化酶的多孔微球裝入管式陶瓷膜內(nèi),所述管式陶瓷膜的截留分子量范圍為1-800kda;

      (3)同步酶解-超濾:配制蛋白溶液,調(diào)節(jié)ph,調(diào)節(jié)蛋白液的溫度并導(dǎo)入步驟(2)的管式陶瓷膜內(nèi),收集陶瓷膜透過液;

      (4)濃縮和干燥:將步驟(3)收集的管式陶瓷膜透過液濃縮并干燥。

      優(yōu)選地,步驟(1)所述蛋白酶為胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶或枯草桿菌蛋白酶中的任意一種或至少兩種的組合。

      本發(fā)明中,通過酶解和超濾兩個(gè)步驟同時(shí)進(jìn)行協(xié)同作用,制備得到了一種分子量范圍可控的多肽,通過調(diào)節(jié)管式陶瓷膜的截留分子量,從而進(jìn)一步控制多肽的分子量范圍,且制備得到的多肽不含有蛋白酶等雜質(zhì)。

      優(yōu)選地,步驟(1)所述的蛋白酶的載量為0.1-50mg/g,例如可以是0.1mg/g、0.2mg/g、0.3mg/g、0.5mg/g、0.8mg/g、1mg/g、2mg/g、3mg/g、5mg/g、8mg/g、10mg/g、12mg/g、15mg/g、18mg/g、20mg/g、22mg/g、25mg/g、28mg/g、30mg/g、32mg/g、35mg/g、38mg/g、40mg/g、42mg/g、45mg/g、48mg/g或50mg/g,優(yōu)選為0.5-40mg/g,進(jìn)一步優(yōu)選為1-30mg/g。

      優(yōu)選地,步驟(1)所述多孔微球?yàn)槎嗫滋沾晌⑶颉⒍嗫撞A⑶蚧驘Y(jié)的多孔不銹鋼微球中的任意一種或至少兩種的組合。

      優(yōu)選地,步驟(1)所述多孔微球的內(nèi)部孔道的直徑為0.05-50μm,例如可以是0.05μm、0.08μm、0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.5μm、0.8μm、1μm、2μm、3μm、5μm、8μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm,優(yōu)選為0.1-20μm。

      優(yōu)選地,步驟(1)所述多孔微球的直徑為0.1-5mm,例如可以是0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.5mm、0.6mm、0.8mm、1mm、1.2mm、1.5mm、1.8mm、2mm、2.2mm、2.5mm、2.8mm、3mm、3.2mm、3.5mm、3.8mm、4mm、4.2mm、4.5mm、4.8mm或5mm,優(yōu)選為0.1-2mm。

      優(yōu)選地,所述多孔微球的球形度為0.5-1.5,例如可以是0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5,優(yōu)選為0.7-1.0。

      本發(fā)明中,通過調(diào)節(jié)多孔微球的直徑和球形度,不僅便于蛋白酶的偶聯(lián),同時(shí)降低酶解時(shí)的空間位阻,提高酶解效率,而在本申請(qǐng)范圍的球形度下,提高了管式陶瓷膜的單位裝載量,防止了微球泄露。

      優(yōu)選地,步驟(2)所述的管式陶瓷膜的內(nèi)孔直徑為1-30mm,例如可以是1mm、2mm、3mm、5mm、6mm、8mm、10mm、12mm、15mm、16mm、18mm、20mm、21mm、23mm、25mm、26mm、28mm或30mm,優(yōu)選為3-20mm。

      優(yōu)選地,步驟(2)所述的管式陶瓷膜包括進(jìn)口和出口,所述進(jìn)口和出口均設(shè)置有篩網(wǎng)。

      優(yōu)選地,所述篩網(wǎng)的直徑為小于0.1mm,例如可以是0.001mm、0.002mm、0.003mm、0.004mm、0.005mm、0.006mm、0.007mm、0.008mm、0.009mm、0.01mm、0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm或0.1mm,優(yōu)選為0.005-0.8mm。

      優(yōu)選地,所述負(fù)載固定化酶的多孔微球裝入管式陶瓷膜內(nèi)的裝填體積為管式陶瓷膜內(nèi)孔體積的60-100%,例如可以是60%、61%、62%、63%、65%、66%、68%、70%、72%、73%、75%、78%、80%、82%、85%、88%、90%、92%、95%、98%或100%,優(yōu)選為70-90%。

      優(yōu)選地,步驟(2)所述管式陶瓷膜的截留分子量范圍為1-800kda,例如可以是1kda、2kda、3kda、5kda、6kda、8kda、10kda、15kda、20kda、25kda、30kda、35kda、40kda、45kda、50kda、60kda、70kda、80kda、90kda、100kda、120kda、150kda、180kda、200kda、230kda、250kda、280kda、300kda、320kda、350kda、380kda、400kda、450kda、500kda、550kda、600kda、650kda、700kda、750kda或800kda,優(yōu)選為3-500kda,進(jìn)一步優(yōu)選為5-300kda。

      優(yōu)選地,步驟(3)所述的蛋白溶液的濃度為0.1-10%,例如可以是0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.8%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%。

      優(yōu)選地,步驟(3)所述的調(diào)節(jié)ph為2.5-10,例如可以是2.5、2.6、2.8、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10,優(yōu)選為3-8。

      優(yōu)選地,步驟(3)所述的調(diào)節(jié)蛋白液的溫度為15-60℃,例如可以是15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、35℃、36℃、38℃、40℃、41℃、42℃、43℃、45℃、46℃、48℃、50℃、51℃、53℃、55℃、56℃、58℃或60℃,優(yōu)選為30-50℃,優(yōu)選為35-45℃。

      優(yōu)選地,步驟(3)所述的管式陶瓷膜的截留液出口的壓力為0.05-0.2mpa,例如可以是0.05mpa、0.06mpa、0.07mpa、0.08mpa、0.09mpa、0.1mpa、0.12mpa、0.13mpa、0.15mpa、0.16mpa、0.18mpa或0.2mpa,優(yōu)選為0.1-0.15mpa。

      本發(fā)明中,控制溫度和壓力是為了保證酶解的效果,在本申請(qǐng)的溫度和壓力范圍內(nèi),酶解更完全,本申請(qǐng)?zhí)囟ǚ肿恿糠秶亩嚯牟拍苓M(jìn)行分離。

      優(yōu)選地,步驟(4)所述的濃縮為濃縮至原體積的5-30%,例如可以是5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%或30%,優(yōu)選為8-25%。

      優(yōu)選地,所述分子量范圍可控的多肽的制備方法,包括如下步驟:

      (1)酶固定化:將蛋白酶共價(jià)偶聯(lián)在直徑為0.1-5mm、球形度為0.5-1.5、內(nèi)部孔道的直徑為0.05-50μm的多孔微球上,所述的蛋白酶的載量為0.1-50mg/g;

      (2)裝膜:將負(fù)載固定化酶的多孔微球裝入內(nèi)孔直徑為1-30mm的管式陶瓷膜內(nèi),所述的管式陶瓷膜的進(jìn)口和出口均設(shè)置有篩網(wǎng),所述篩網(wǎng)的直徑為小于0.1mm,所述管式陶瓷膜的截留分子量范圍為1-800kda,所述負(fù)載固定化酶的多孔微球裝入管式陶瓷膜內(nèi)的裝填體積為管式陶瓷膜內(nèi)孔體積的60-100%;

      (3)同步酶解-超濾:配制濃度為0.1-10%蛋白溶液,調(diào)節(jié)ph為2.5-10,調(diào)節(jié)蛋白液的溫度為15-60℃并導(dǎo)入步驟(2)的管式陶瓷膜內(nèi),所述的管式陶瓷膜的截留液出口的壓力為0.05-0.2mpa,收集管式陶瓷膜透過液;

      (4)濃縮和干燥:將步驟(3)收集的管式陶瓷膜透過液濃縮至原體積的5-30%,干燥;

      其中,步驟(1)所述蛋白酶為胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶或枯草桿菌蛋白酶中的任意一種或至少兩種的組合,步驟(1)所述多孔微球?yàn)槎嗫滋沾晌⑶?、多孔玻璃微球或燒結(jié)的多孔不銹鋼微球中的任意一種或至少兩種的組合。

      作為優(yōu)選技術(shù)方案,所述分子量范圍可控的多肽的制備方法,包括如下步驟:

      (1)酶固定化:將蛋白酶共價(jià)偶聯(lián)在直徑為0.1-2mm、球形度為0.7-1、內(nèi)部孔道的直徑為0.05-20μm的多孔微球上,所述的蛋白酶的載量為3-30mg/g;

      (2)裝膜:將負(fù)載固定化酶的多孔微球裝入內(nèi)孔直徑為3-20mm的管式陶瓷膜內(nèi),所述的管式陶瓷膜的進(jìn)口和出口均設(shè)置有篩網(wǎng),所述篩網(wǎng)的直徑為0.005-0.8mm,所述管式陶瓷膜的截留分子量范圍為5-300kda,所述負(fù)載固定化酶的多孔微球裝入管式陶瓷膜內(nèi)的裝填體積為管式陶瓷膜內(nèi)孔體積的70-90%;

      (3)同步酶解-超濾:配制濃度為0.1-10%蛋白溶液,調(diào)節(jié)ph為3-8,調(diào)節(jié)蛋白液的溫度為35-45℃并導(dǎo)入步驟(2)的管式陶瓷膜內(nèi),所述的管式陶瓷膜的截留液出口的壓力為0.1-0.15mpa,收集管式陶瓷膜透過液;

      (4)濃縮和干燥:將步驟(3)收集的管式陶瓷膜透過液濃縮至原體積的8-25%,干燥;

      其中,步驟(1)所述蛋白酶為胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶或枯草桿菌蛋白酶中的任意一種或至少兩種的組合,步驟(1)所述多孔微球?yàn)槎嗫滋沾晌⑶?、多孔玻璃微球或燒結(jié)的多孔不銹鋼微球中的任意一種或至少兩種的組合。

      另一方面,本發(fā)明提供一種分子量范圍可控的多肽的制備裝置,所述裝置包括依次連接的蛋白質(zhì)溶液儲(chǔ)液瓶1、流體輸送泵2、換熱器3和管式陶瓷膜6。

      優(yōu)選地,所述換熱器3的出口與管式陶瓷膜6進(jìn)口連接;

      優(yōu)選地,所述管式陶瓷膜6中裝填負(fù)載了固定化酶的多孔微球7;

      優(yōu)選地,所述負(fù)載了固定化酶的多孔微球7的裝填體積為管式陶瓷膜6內(nèi)孔體積的60-100%,優(yōu)選為70-90%;

      優(yōu)選地,所述的管式陶瓷膜6的內(nèi)孔直徑為1-30mm,例如可以是1mm、2mm、3mm、5mm、6mm、8mm、10mm、12mm、15mm、16mm、18mm、20mm、21mm、23mm、25mm、26mm、28mm或30mm,優(yōu)選為3-20mm;

      優(yōu)選地,所述管式陶瓷膜6的截留分子量范圍為1-800kda,例如可以是1kda、2kda、3kda、5kda、6kda、8kda、10kda、15kda、20kda、25kda、30kda、35kda、40kda、45kda、50kda、60kda、70kda、80kda、90kda、100kda、120kda、150kda、180kda、200kda、230kda、250kda、280kda、300kda、320kda、350kda、380kda、400kda、450kda、500kda、550kda、600kda、650kda、700kda、750kda或800kda,優(yōu)選為3-500kda,進(jìn)一步優(yōu)選為5-300kda;

      優(yōu)選地,所述管式陶瓷膜6的進(jìn)口和出口均設(shè)置有篩網(wǎng);

      優(yōu)選地,所述篩網(wǎng)的直徑為小于0.1mm,優(yōu)選為0.005-0.8mm。

      優(yōu)選地,所述換熱器3與管式陶瓷膜6之間設(shè)置有溫度計(jì)4,用于監(jiān)控?fù)Q熱器出口的溫度;

      優(yōu)選地,所述管式陶瓷膜6的截留液出口與蛋白質(zhì)溶液儲(chǔ)液瓶1相連,所述蛋白質(zhì)溶液儲(chǔ)液瓶1用于收集通過管式陶瓷膜6的截留液;

      優(yōu)選地,所述蛋白質(zhì)溶液儲(chǔ)液瓶1與蛋白質(zhì)溶液儲(chǔ)液瓶1之間設(shè)置有壓力計(jì)8,用于監(jiān)測(cè)管式陶瓷膜截留液出口的壓力。

      本發(fā)明所述管式陶瓷膜6的透過液出口用于收集透過液,所述透過液用于濃縮干燥制備所述多肽。

      本發(fā)明所述一種分子量范圍可控的多肽的制備裝置的工作過程如下:

      所述配制的蛋白溶液從蛋白質(zhì)溶液儲(chǔ)液瓶1的出口流出,通過流體輸送泵2導(dǎo)入換熱器內(nèi),所述蛋白質(zhì)溶液從換熱器的出口流出,通過溫度計(jì)測(cè)量換熱器出口的蛋白質(zhì)溶液的溫度,保證蛋白質(zhì)溶液的溫度在15-60℃,從換熱器的出口流出蛋白質(zhì)溶液從管式陶瓷膜6的進(jìn)口流入,將通過陶瓷膜后的截留液返回至蛋白質(zhì)溶液儲(chǔ)液瓶1內(nèi),通過管式陶瓷膜透過液出口5收集管式陶瓷膜透過液,所述收集的管式陶瓷膜透過液用于后續(xù)的濃縮和干燥。

      與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明至少具有以下有益效果:

      (1)本發(fā)明制備方法可以制備質(zhì)量均一的多肽,且多肽的分子量可以進(jìn)行精準(zhǔn)的控制,控制在一定范圍內(nèi)的多肽的比例達(dá)到了70%以上;

      (2)本發(fā)明方法工藝簡(jiǎn)單,步驟少,容易操作,制備的多肽的分子量可大于蛋白酶的分子量,不含有蛋白酶等雜質(zhì),便于后續(xù)的運(yùn)用,能進(jìn)行工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

      附圖說明

      圖1為一種分子量范圍可控的多肽制備方法的流程圖,其中,1-蛋白質(zhì)溶液儲(chǔ)液瓶,2-流體輸送泵,3-換熱器,4-溫度計(jì),5-透過液出口,6-管式陶瓷膜,7-固定化酶的多孔微球,8-壓力表。

      具體實(shí)施方式

      為便于理解本發(fā)明,本發(fā)明列舉實(shí)施例如下。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了,所述實(shí)施例僅僅是幫助理解本發(fā)明,不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的具體限制。

      實(shí)施例1一種分子量范圍可控的多肽的制備裝置

      一種分子量范圍可控的多肽的制備裝置,如圖1所示,所述裝置包括依次連接的蛋白質(zhì)溶液儲(chǔ)液瓶1、流體輸送泵2、換熱器3和管式陶瓷膜6;

      所述管式陶瓷膜6中裝填負(fù)載了固定化酶的多孔微球7;

      所述負(fù)載了固定化酶的多孔微球7的裝填體積為管式陶瓷膜6內(nèi)孔體積的60-100%,優(yōu)選為70-90%;

      所述的管式陶瓷膜6的內(nèi)孔直徑為1-30mm,優(yōu)選為3-20mm;

      所述管式陶瓷膜6的截留分子量范圍為1-800kda,優(yōu)選為3-500kda,進(jìn)一步優(yōu)選為5-300kda;

      所述管式陶瓷膜6的進(jìn)口和出口均設(shè)置有篩網(wǎng);

      所述篩網(wǎng)的直徑為小于0.1mm,0.005-0.8mm。

      所述換熱器3與管式陶瓷膜6之間設(shè)置有溫度計(jì)4,用于監(jiān)控?fù)Q熱器出口的溫度;

      所述管式陶瓷膜6的截留液出口與蛋白質(zhì)溶液儲(chǔ)液瓶1相連,所述蛋白質(zhì)溶液儲(chǔ)液瓶1用于收集通過管式陶瓷膜6的截留液;

      所述蛋白質(zhì)溶液儲(chǔ)液瓶1與蛋白質(zhì)溶液儲(chǔ)液瓶1之間設(shè)置有壓力計(jì)8,用于監(jiān)測(cè)管式陶瓷膜截留液出口的壓力;

      所述管式陶瓷膜6的透過液出口用于收集透過液,所述透過液用于濃縮干燥制備所述多肽。

      所述一種分子量范圍可控的多肽的制備裝置的工作過程如下:

      所述配制的蛋白溶液從蛋白質(zhì)溶液儲(chǔ)液瓶1的出口流出,通過流體輸送泵2導(dǎo)入換熱器內(nèi),所述蛋白質(zhì)溶液從換熱器的出口流出,通過溫度計(jì)測(cè)量換熱器出口的蛋白質(zhì)溶液的溫度,保證蛋白質(zhì)溶液的溫度在15-60℃,從換熱器的出口流出蛋白質(zhì)溶液從管式陶瓷膜6的進(jìn)口流入,將通過陶瓷膜后的截留液返回至蛋白質(zhì)溶液儲(chǔ)液瓶1內(nèi),通過管式陶瓷膜透過液出口5收集管式陶瓷膜透過液,所述收集的管式陶瓷膜透過液用于后續(xù)的濃縮和干燥。

      實(shí)施例2

      原料為平均分子量大于23kda的大豆分離蛋白,蛋白質(zhì)含量超過93%(干基),稱取5kg大豆分離蛋白配置成濃度為6.25%的溶液80l:

      (1)酶固定化:將胃蛋白酶共價(jià)偶聯(lián)在直徑為0.5mm的多孔陶瓷微球上,所述胃蛋白酶的載量為10mg/g,陶瓷微球的球形度0.85,微球內(nèi)部孔道直徑的范圍為100nm-20μm;

      (2)裝膜:將擔(dān)載胃蛋白酶的陶瓷微球裝入內(nèi)孔直徑5mm的管式陶瓷膜內(nèi),陶瓷膜截留分子量為5kda,陶瓷膜進(jìn)口和出口使用孔徑為0.06mm的篩網(wǎng)將陶瓷微球封裝,陶瓷膜內(nèi)擔(dān)載胃蛋白酶的多孔陶瓷微球裝填體積為陶瓷膜內(nèi)孔道總體積的80%;

      (3)同步酶解-超濾過程:將80l濃度為5%的大豆分離蛋白溶液至于100l不銹鋼桶,調(diào)節(jié)蛋白溶液的ph至3.0,將蛋白溶液通過泵導(dǎo)入換熱器,換熱器出口連接至陶瓷膜入口,控制換熱器出口蛋白溶液的溫度為37℃,控制陶瓷膜截留液出口的壓力在0.1mpa,將通過陶瓷膜后的截留液返回至100l不銹鋼桶內(nèi),自動(dòng)補(bǔ)料使100l不銹鋼桶內(nèi)溶液ph穩(wěn)定在3.0;反復(fù)運(yùn)行,收集陶瓷膜透過液50l;

      (4)濃縮和干燥:將步驟(3)收集的陶瓷膜透過液50l濃縮至濃度為10%,使用naoh溶液將濃縮液ph調(diào)至6.8-7.1,然后將濃縮液干燥,獲得的粉末為超濾截留分子量5kda的多肽。

      凝膠過濾色譜分析結(jié)果表明制備的多肽分子量在3.0kda~6.5kda,其中分子量為4.5kda~5.5kda的多肽含量為85%。

      實(shí)施例3

      原料為平均分子量大于80kda的明膠,蛋白質(zhì)含量超過96%(干基),稱取10kg該明膠配置成濃度為10%的溶液100l:

      (1)酶固定化:將胰蛋白酶共價(jià)偶聯(lián)在直徑為1mm的多孔玻璃微球上,所述胰蛋白酶的載量為15mg/g,玻璃微球的球形度0.9,多孔玻璃微球內(nèi)部孔道直徑的范圍為200nm-10μm;

      (2)裝膜:將擔(dān)載胰蛋白酶的玻璃微球裝入內(nèi)孔直徑10mm的管式陶瓷膜內(nèi),陶瓷膜截留分子量為30kda,陶瓷膜進(jìn)口和出口均設(shè)置孔徑為0.02mm的篩網(wǎng),陶瓷膜內(nèi)擔(dān)載胰蛋白酶的多孔玻璃微球裝填體積為陶瓷膜內(nèi)孔道總體積的75%;

      (3)同步酶解-超濾過程:將100l濃度為10%的明膠溶液至于200l不銹鋼桶,調(diào)節(jié)蛋白溶液的ph至8.0,將蛋白溶液通過泵導(dǎo)入換熱器,換熱器出口連接至陶瓷膜入口,控制換熱器出口蛋白溶液的溫度為37℃,控制陶瓷膜截留液出口的壓力在0.12mpa,將通過陶瓷膜后的截留液返回至200l不銹鋼桶內(nèi),自動(dòng)補(bǔ)料法使200l不銹鋼桶內(nèi)溶液ph穩(wěn)定在8.0;反復(fù)運(yùn)行,收集陶瓷膜透過液70l;

      (4)濃縮和干燥:將步驟(3)收集的陶瓷膜透過液70l濃縮至濃度為20%,使用hcl溶液將濃縮液ph調(diào)至約7.0,然后將濃縮液干燥,干燥后的粉末為超濾截留分子量30kda的多肽。

      凝膠過濾色譜分析結(jié)果表明制備的多肽分子量在20kda~34kda,其中分子量為28kda~31kda的多肽含量為81%。

      實(shí)施例4

      原料為平均分子量大于80kda的明膠,蛋白質(zhì)含量超過96%(干基),稱取0.1kg該明膠配置成濃度為0.1%的溶液100l:

      (1)酶固定化:將糜蛋白酶共價(jià)偶聯(lián)在直徑為0.1mm的燒結(jié)的多孔不銹鋼微球上,所述糜蛋白酶的載量為50mg/g,玻璃微球的球形度0.5,多孔玻璃微球內(nèi)部孔道直徑的范圍為50nm-2μm;

      (2)裝膜:將擔(dān)載糜蛋白酶的多孔不銹鋼微球裝入內(nèi)孔直徑1mm的管式陶瓷膜內(nèi),陶瓷膜截留分子量為1kda,陶瓷膜進(jìn)口和出口均設(shè)置孔徑為0.005mm的篩網(wǎng),陶瓷膜內(nèi)擔(dān)載糜蛋白酶的多孔不銹鋼微球裝填體積為陶瓷膜內(nèi)孔道總體積的60%;

      (3)同步酶解-超濾過程:將100l濃度為0.1%的明膠溶液至于200l不銹鋼桶,調(diào)節(jié)蛋白溶液的ph至2.5,將蛋白溶液通過泵導(dǎo)入換熱器,換熱器出口連接至陶瓷膜入口,控制換熱器出口蛋白溶液的溫度為15℃,控制陶瓷膜截留液出口的壓力在0.05mpa,將通過陶瓷膜后的截留液返回至200l不銹鋼桶內(nèi),自動(dòng)補(bǔ)料法使200l不銹鋼桶內(nèi)溶液ph穩(wěn)定在2.5;反復(fù)運(yùn)行,收集陶瓷膜透過液50l;

      (4)濃縮和干燥:將步驟(3)收集的陶瓷膜透過液50l濃縮至濃度為5%,使用hcl溶液將濃縮液ph調(diào)至約7.0,然后將濃縮液干燥,干燥后的粉末為超濾截留分子量1kda的多肽。

      凝膠過濾色譜分析結(jié)果表明制備的多肽分子量在0.5kda~3kda,其中分子量為0.8kda~2kda的多肽含量為75%。

      實(shí)施例5

      原料為平均分子量大于80kda的明膠,蛋白質(zhì)含量超過96%(干基),稱取10kg該明膠配置成濃度為10%的溶液100l:

      (1)酶固定化:將木瓜蛋白酶共價(jià)偶聯(lián)在直徑為5mm的多孔玻璃微球上,所述木瓜蛋白酶的載量為0.1mg/g,玻璃微球的球形度1.5,多孔玻璃微球內(nèi)部孔道直徑的范圍為45-50μm;

      (2)裝膜:將擔(dān)載木瓜蛋白酶的玻璃微球裝入內(nèi)孔直徑30mm的管式陶瓷膜內(nèi),陶瓷膜截留分子量為800kda,陶瓷膜進(jìn)口和出口均設(shè)置孔徑為0.08mm的篩網(wǎng),陶瓷膜內(nèi)擔(dān)載木瓜蛋白酶的多孔玻璃微球裝填體積為陶瓷膜內(nèi)孔道總體積的100%;

      (3)同步酶解-超濾過程:將100l濃度為10%的明膠溶液至于200l不銹鋼桶,調(diào)節(jié)蛋白溶液的ph至10.0,將蛋白溶液通過泵導(dǎo)入換熱器,換熱器出口連接至陶瓷膜入口,控制換熱器出口蛋白溶液的溫度為60℃,控制陶瓷膜截留液出口的壓力在0.2mpa,將通過陶瓷膜后的截留液返回至200l不銹鋼桶內(nèi),自動(dòng)補(bǔ)料法使200l不銹鋼桶內(nèi)溶液ph穩(wěn)定在10.0;反復(fù)運(yùn)行,收集陶瓷膜透過液45l;

      (4)濃縮和干燥:將步驟(3)收集的陶瓷膜透過液45l濃縮至濃度為5%,使用hcl溶液將濃縮液ph調(diào)至約7.0,然后將濃縮液干燥,干燥后的粉末為超濾截留分子量800kda的多肽。

      凝膠過濾色譜分析結(jié)果表明制備的多肽分子量在780kda~810kda,其中分子量為790kda~805kda的多肽含量為72%。

      實(shí)施例6

      原料為平均分子量大于80kda的明膠,蛋白質(zhì)含量超過96%(干基),稱取8kg該明膠配置成濃度為8%的溶液100l:

      (1)酶固定化:將菠蘿蛋白酶共價(jià)偶聯(lián)在直徑為2mm的多孔玻璃微球上,所述菠蘿蛋白酶的載量為0.5mg/g,玻璃微球的球形度1,多孔玻璃微球內(nèi)部孔道直徑的范圍為5-20μm;

      (2)裝膜:將擔(dān)載菠蘿蛋白酶的玻璃微球裝入內(nèi)孔直徑30mm的管式陶瓷膜內(nèi),陶瓷膜截留分子量為300kda,陶瓷膜進(jìn)口和出口均設(shè)置孔徑為0.01mm的篩網(wǎng),陶瓷膜內(nèi)擔(dān)載菠蘿蛋白酶的多孔玻璃微球裝填體積為陶瓷膜內(nèi)孔道總體積的90%;

      (3)同步酶解-超濾過程:將100l濃度為8%的明膠溶液至于200l不銹鋼桶,調(diào)節(jié)蛋白溶液的ph至8.0,將蛋白溶液通過泵導(dǎo)入換熱器,換熱器出口連接至陶瓷膜入口,控制換熱器出口蛋白溶液的溫度為50℃,控制陶瓷膜截留液出口的壓力在0.15mpa,將通過陶瓷膜后的截留液返回至200l不銹鋼桶內(nèi),自動(dòng)補(bǔ)料法使200l不銹鋼桶內(nèi)溶液ph穩(wěn)定在8.0;反復(fù)運(yùn)行,收集陶瓷膜透過液60l;

      (4)濃縮和干燥:將步驟(3)收集的陶瓷膜透過液60l濃縮至濃度為25%,使用hcl溶液將濃縮液ph調(diào)至約7.0,然后將濃縮液干燥,干燥后的粉末為超濾截留分子量300kda的多肽。

      凝膠過濾色譜分析結(jié)果表明制備的多肽分子量在280kda~310kda,其中分子量為292kda~305kda的多肽含量為77%。

      實(shí)施例7

      原料為平均分子量大于80kda的明膠,蛋白質(zhì)含量超過96%(干基),稱取3kg該明膠配置成濃度為3%的溶液100l:

      (1)酶固定化:將枯草桿菌蛋白酶共價(jià)偶聯(lián)在直徑為2mm的多孔玻璃微球上,所述枯草桿菌蛋白酶的載量為40mg/g,玻璃微球的球形度0.7,多孔玻璃微球內(nèi)部孔道直徑的范圍為100nm-3μm;

      (2)裝膜:將擔(dān)載枯草桿菌蛋白酶的玻璃微球裝入內(nèi)孔直徑3mm的管式陶瓷膜內(nèi),陶瓷膜截留分子量為5kda,陶瓷膜進(jìn)口和出口均設(shè)置孔徑為0.04mm的篩網(wǎng),陶瓷膜內(nèi)擔(dān)載枯草桿菌蛋白酶的多孔玻璃微球裝填體積為陶瓷膜內(nèi)孔道總體積的70%;

      (3)同步酶解-超濾過程:將100l濃度為3%的明膠溶液至于200l不銹鋼桶,調(diào)節(jié)蛋白溶液的ph至6.0,將蛋白溶液通過泵導(dǎo)入換熱器,換熱器出口連接至陶瓷膜入口,控制換熱器出口蛋白溶液的溫度為35℃,控制陶瓷膜截留液出口的壓力在0.1mpa,將通過陶瓷膜后的截留液返回至200l不銹鋼桶內(nèi),自動(dòng)補(bǔ)料法使200l不銹鋼桶內(nèi)溶液ph穩(wěn)定在6.0;反復(fù)運(yùn)行,收集陶瓷膜透過液67l;

      (4)濃縮和干燥:將步驟(3)收集的陶瓷膜透過液67l濃縮至濃度為8%,使用hcl溶液將濃縮液ph調(diào)至約7.0,然后將濃縮液干燥,干燥后的粉末為超濾截留分子量5kda的多肽。

      凝膠過濾色譜分析結(jié)果表明制備的多肽分子量在2kda~10kda,其中分子量為3kda~7kda的多肽含量為78%。

      從實(shí)施例1-7可以看出,通過酶解和超濾同時(shí)進(jìn)行,本發(fā)明精準(zhǔn)的控制了多肽的分子量,控制在一定范圍內(nèi)的比例達(dá)到了70%以上,多肽分子量均一,不含有蛋白酶等雜質(zhì)。

      對(duì)比例1

      與實(shí)施例3相比,除酶解和超濾步驟分開進(jìn)行之外,其它與實(shí)施例3相同。

      凝膠過濾色譜分析結(jié)果表明制備的多肽分子量在15kda~50kda,其中分子量為28kda~31kda的多肽含量為35%。

      對(duì)比例2

      與實(shí)施例3相比,除管式陶瓷膜的截留分子量范圍為900kda之外,其它與實(shí)施例3相同。

      凝膠過濾色譜分析結(jié)果表明制備的多肽分子量在900kda以上,其中還含有蛋白酶,分子量不均衡。

      從對(duì)比例1-2和實(shí)施例2對(duì)比可以看出,本發(fā)明方法可以精準(zhǔn)的控制多肽的分子量范圍,制備得到的多肽質(zhì)量均一。

      綜上所述,本發(fā)明制備方法可以制備質(zhì)量均一的多肽,且多肽的分子量可以進(jìn)行控制,控制在一定范圍內(nèi)的多肽的比例達(dá)到了70%以上,不含有蛋白酶等雜質(zhì),不僅如此,從對(duì)比例可以看出,如果將酶解和過濾的步驟分開,其效果明顯不如本發(fā)明。

      申請(qǐng)人聲明,本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程,但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程,即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了,對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn),對(duì)本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等,均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。

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