本發(fā)明涉及體外核酸檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種定性檢測CYP2D6基因分型的焦磷酸測序引物對及試劑盒。
背景技術(shù)：
：細(xì)胞色素P4502D6(CytochromeP4502D6，CYP2D6)是CYP酶系中一種非常重要的藥物代謝酶。在CYP450超家族中，CYP2是最大的家族，在人類又可分成5個亞家族，編號為A～E。CYP2D位于第22號染色體上，由CYP2D6、CYP2D7P和CYP2D8P共同組成，其中CYP2D7P和CYP2D8P是假基因，不表達(dá)。CYP2D6作為一個完整的功能基因，包含9個外顯子和8個內(nèi)含子，總長7kb左右。CYP2D6是最早發(fā)現(xiàn)的具有基因多態(tài)性的P450酶，目前，已發(fā)現(xiàn)CYP2D6有70多種突變基因，其中，超過15個譯成密碼后是無活性或非酶，另外一些分別譯成活性減少、“正?！被蚧钚栽鰪?qiáng)的酶。CYP2D6基因的主要突變方式是單個堿基的缺失或替換引起讀碼框架移位，或是大片段基因的丟失。CYP2D6酶主要分布于人體肝臟中，占肝臟酶總量的2％～9％，但卻參與20％～30％臨床常用藥物的代謝，包括抗抑郁藥、抗心律失常藥、抗精神病藥、抗腫瘤藥物等。CYP2D6的基因突變類型較多，其中CYP2D6*2、*3、*4、*5、*6、*10等位基因在高加索人中都有發(fā)現(xiàn)，CYP2D6*2和*17主要存在于非洲人中，而在亞洲人群中的突變類型主要是CYP2D6*10。與野生型CYP2D6相比，*10主要是外顯子1C188→T轉(zhuǎn)換，造成Pro(脯氨酸)34→Ser(絲氨酸)取代，導(dǎo)致編碼的酶不穩(wěn)定，降低CYP2D6的酶活性。按基因型可將CYP2D6*10分為：在外顯子1第188位點(diǎn)上攜帶兩個有活性等位基因的野生型純合子C/C(CYP2D6*1/*1)，攜帶兩個導(dǎo)致酶活性降低的等位基因的突變純合子T/T(CYP2D6*10/*10)和只含一個正常等位基因的雜合子C/T(CYP2D6*1/*10)。另一個亞洲人常見單核苷酸多態(tài)是CYP2D6外顯子9G4268→C顛換，造成了Ser(絲氨酸)486→Thr(蘇氨酸)取代，導(dǎo)致表達(dá)的酶活性降低。他莫昔芬是乳腺癌內(nèi)分泌治療應(yīng)用最為廣泛的藥物。4-羥-N-去甲基他莫昔芬是他莫昔芬代謝的主要活性物質(zhì)，能抑制激素依賴的乳腺癌細(xì)胞的擴(kuò)散，其生成主要依賴于CYP2D6的酶活性。多項(xiàng)研究表明其中CYP2D6*10/*10基因型導(dǎo)致酶活性下降或者抑制酶活性，從而影響他莫昔芬的代謝，進(jìn)而導(dǎo)致他莫昔芬的治療療效的差異。研究顯示，CYP2D6*10/*10基因型攜帶患者對他莫西芬的治療不敏感。β受體阻斷藥是臨床常用的一線抗高血壓藥物，其代表藥物有美托洛爾(Metoprolol)、普萘洛爾(Propranolol)、卡維地洛(Carvedilol)。普羅帕酮(Propafenone)為廣譜高效膜抑制性抗心律失常藥，具有膜穩(wěn)定作用及競爭性β受體阻滯作用。這些藥物大約70-80％在人體內(nèi)經(jīng)CYP2D6代謝。研究發(fā)現(xiàn)，不同個體中藥物的血藥濃度最多可相差20倍，因此CYP2D6的基因多態(tài)性從這些藥的藥代動力學(xué)和藥效動力學(xué)上影響其毒副反應(yīng)的發(fā)生。研究表明，在相同劑量條件下，PM(中國人群主要為CYP2D6*10/*10)患者的美托洛爾口服清除率比EM(CYP2D6*1/*1)患者低40％，代謝減慢，CYP2D6所介導(dǎo)代謝的美托洛爾的血藥濃度比EM患者高2～3倍，更易出現(xiàn)心率減慢、傳導(dǎo)阻滯、血壓降低、心力衰竭加重、外周血管痙攣導(dǎo)致的四肢冰冷或脈搏不能觸及、雷諾現(xiàn)象。如不根據(jù)基因型調(diào)整劑量，突變純合子患者可能發(fā)生嚴(yán)重的毒副反應(yīng)。也有研究表明，CYP2D6基因型在普羅帕酮血漿濃度和效應(yīng)中起著重要作用。450mg/d劑量組中具有CYP2D6*10突變純合子的病人，普羅帕酮血漿峰濃度約為野生基因型的2倍，而且室性早搏(VPC)抑制率也增加一倍。美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)建議：在使用心血管類藥物如美托洛爾、普萘洛爾、卡維地洛和普羅帕酮之前需要對患者的CYP2D6基因進(jìn)行檢測。精神分裂癥(Schizophrenia)是常見的精神疾病之一，發(fā)病率為1％左右。目前廣泛應(yīng)用的抗精神病藥物包括傳統(tǒng)抗精神分裂癥藥物如氟哌啶醇、奮乃靜等以及非典型抗精神分裂癥藥物如氯氮平、利培酮、阿立哌唑等。臨床治療中，發(fā)現(xiàn)同樣劑量下用藥有相當(dāng)一部分病人在服藥后發(fā)生椎體外系副反應(yīng)、粒細(xì)胞缺乏癥或體重增加等副作用。研究表明，氟哌啶醇、阿立哌唑、利培酮、奮乃靜、硫利達(dá)嗪、氯氮平、伊潘立酮、匹莫齊特等均由CYP2D6代謝，其副反應(yīng)均與此酶活性有關(guān)，而CYP2D6酶活性受其編碼基因的基因型影響。Kirchheiner等進(jìn)行了薈萃分析，揭示了大約50％的常用抗精神病藥物的劑量取決于CYP2D6基因型。在一項(xiàng)研究中對100名住院患者連續(xù)進(jìn)行CYP2D6表型的測定并給藥，在接受CYP2D6底物藥物治療的患者中具有PM表型的患者人群中不良反應(yīng)的發(fā)生率最高。而且在一項(xiàng)有關(guān)美國精神病治療的研究中顯示，CYP2D6多態(tài)性對患者的治療費(fèi)用有很大的影響。因此，對于接受單一或多重由CYP2D6代謝的藥物進(jìn)行治療的患者來說，基因型測定可以幫助臨床醫(yī)生在已知待選藥物的代謝的基礎(chǔ)上進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇，從而避免不良的藥物—藥物相互作用。通過恰當(dāng)?shù)膭┝空{(diào)節(jié)來防止不良反應(yīng)的發(fā)生，更好地進(jìn)行個體化藥物治療。焦磷酸測序(Pyrosequencing)是一種基于聚合原理的DNA測序(即，確定DNA中核苷酸的順序)方法，屬于新一代DNA序列分析技術(shù)，具備同時對大量樣品進(jìn)行測序分析的能力，并具有高通量、特異性高、快速、直觀及低成本的優(yōu)點(diǎn)。其基本原理為，由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，在每一輪測序反應(yīng)中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(tuán)(PPi)，PPi可最終轉(zhuǎn)化為可見光信號，并由PyrogramTM轉(zhuǎn)化為一個峰值，每個峰值的高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比；然后加入下一種dNTP，繼續(xù)DNA鏈的合成；最后通過分析岀峰值的情況，達(dá)到測定DNA序列的目的。不過，現(xiàn)有技術(shù)中還沒有利用焦磷酸測序技術(shù)檢測CYP2D6基因分型的產(chǎn)品。目前，在現(xiàn)有技術(shù)中，尤其是在醫(yī)院內(nèi)，采用有“金標(biāo)準(zhǔn)”之稱的PCR-直接測序法對CYP2D6基因進(jìn)行檢測，但該方法的敏感性不高，只能檢測出突變細(xì)胞比率在10-20％以上的腫瘤組織及外周血，對于突變細(xì)胞比率小于10％的腫瘤組織及外周血，常規(guī)PCR-直接測序法幾乎無能為力；此外，該方法還存在成本高、檢測周期長及操作繁瑣的缺點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決上述方法檢測CYP2D6基因分型過程中存在敏感性不高、檢測周期長、操作繁瑣及成本高的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種敏感性高、特異性強(qiáng)、檢測周期短、操作簡單并有效滿足臨床檢驗(yàn)要求的定性檢測CYP2D6基因分型的焦磷酸測序引物對及試劑盒。本發(fā)明提供了一種定性檢測CYP2D6基因分型的焦磷酸測序引物對，所述CYP2D6基因檢測的多態(tài)性位點(diǎn)為CYP2D6C188T和/或CYP2D6G4268C，所述引物對包括：(1)對于CYP2D6C188T等位基因，擴(kuò)增引物為：CYP2D6C188T正向擴(kuò)增引物：5’-GCCGTGATAGTGGCCATCTT-3’(SEQIDNO.1)；CYP2D6C188T反向擴(kuò)增引物：5’-TCGAAGCAGTATGGTGTGTTCT-3’(SEQIDNO.2)；CYP2D6C188T測序引物：5’-GGCAGGGGGCCTGGT-3’(SEQIDNO.3)；其中，所述CYP2D6C188T正向擴(kuò)增引物的5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記；(2)對于CYP2D6G4268C等位基因，擴(kuò)增引物為：CYP2D6G4268C正向擴(kuò)增引物：5’-CATGGTGTCTTTGCTTTCCT-3’(SEQIDNO.4)；CYP2D6G4268C反向擴(kuò)增引物：5’-GGCACAGCACAAAGCTCAT-3’(SEQIDNO.5)；CYP2D6G4268C測序引物：5’-CTCATAGGGGGATGG-3’(SEQIDNO.6)；其中，所述CYP2D6G4268C正向擴(kuò)增引物的5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記。本發(fā)明還提供了一種定性檢測CYP2D6基因分型的焦磷酸測序試劑盒，所述CYP2D6基因檢測的多態(tài)性位點(diǎn)為CYP2D6C188T和/或CYP2D6G4268C，所述試劑盒包括：(1)對于CYP2D6C188T等位基因，CYP2D6C188T正向擴(kuò)增引物：5’-GCCGTGATAGTGGCCATCTT-3’；PCR反應(yīng)液1，所述PCR反應(yīng)液1含有CYP2D6C188T反向擴(kuò)增引物：5’-TCGAAGCAGTATGGTGTGTTCT-3’；CYP2D6C188T測序引物：5’-GGCAGGGGGCCTGGT-3’；其中，所述CYP2D6C188T正向擴(kuò)增引物的5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記；(2)對于CYP2D6G4268C等位基因，CYP2D6G4268C正向擴(kuò)增引物：5’-CATGGTGTCTTTGCTTTCCT-3’；PCR反應(yīng)液2，所述PCR反應(yīng)液2含有CYP2D6G4268C反向擴(kuò)增引物：5’-GGCACAGCACAAAGCTCAT-3’；CYP2D6G4268C測序引物：5’-CTCATAGGGGGATGG-3’；其中，所述CYP2D6G4268C正向擴(kuò)增引物的5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記。在本發(fā)明提供的所述試劑盒的一種較佳實(shí)施例中，所述試劑盒還包括：CYP2D6C188T陽性對照品1，其為插有SEQIDNO.8所示核苷酸序列的CYP2D6C188T野生純合子質(zhì)粒；SEQIDNO.8：5’-TGCCCCTGGCCGTGATAGTGGCCATCTTCCTGCTCCTGGTGGACCTGATGCACCGGCGCCAACGCTGGGCTGCACGCTACCCACCAGGCCCCCTGCCACTGCCCGGGCTGGGCAACCTGCTGCATGTGGACTTCCAGAACACACCATACTGCTTCGACCAGGTGAGGGAGGAGGT-3’；CYP2D6C188T陽性對照品2，其為所述CYP2D6C188T野生純合子質(zhì)粒與插有SEQIDNO.9所示核苷酸序列的CYP2D6C188T突變純合子質(zhì)粒組成的質(zhì)?；旌衔铮籆YP2D6C188T陽性對照品3，其為插有SEQIDNO.9所示核苷酸序列的CYP2D6C188T突變純合子質(zhì)粒；SEQIDNO.9：5’-TGCCCCTGGCCGTGATAGTGGCCATCTTCCTGCTCCTGGTGGACCTGATGCACCGGCGCCAACGCTGGGCTGCACGCTACTCACCAGGCCCCCTGCCACTGCCCGGGCTGGGCAACCTGCTGCATGTGGACTTCCAGAACACACCATACTGCTTCGACCAGGTGAGGGAGGAGGT-3’；CYP2D6G4268C陽性對照品1，其為插有SEQIDNO.10所示核苷酸序列的CYP2D6G4268C野生純合子質(zhì)粒；SEQIDNO.10：5’-AGTCTTGCAGGGGTATCACCCAGGAGCCAGGCTCACTGACGCCCCTCCCCTCCCCACAGGCCGCCGTGCATGCCTCGGGGAGCCCCTGGCCCGCATGGAGCTCTTCCTCTTCTTCACCTCCCTGCTGCAGCACTTCAGCTTCTCGGTGCCCACTGGACAGCCCCGGCCCAGCCACCATGGTGTCTTTGCTTTCCTGGTGAGCCCATCCCCCTATGAGCTTTGTGCTGTGCCCCGCTAGAATGGGGTACCTAGTCCCCAGCCTGCTCCCTAGCCAG-3’；CYP2D6G4268C陽性對照品2，其為所述CYP2D6G4268C野生純合子質(zhì)粒與插有SEQIDNO.11所示核苷酸序列的CYP2D6G4268C突變純合子質(zhì)粒組成的質(zhì)粒混合物；CYP2D6G4268C陽性對照品3，其為插有SEQIDNO.11所示核苷酸序列的CYP2D6G4268C突變純合子質(zhì)粒；SEQIDNO.11：5’-AGTCTTGCAGGGGTATCACCCAGGAGCCAGGCTCACTGACGCCCCTCCCCTCCCCACAGGCCGCCGTGCATGCCTCGGGGAGCCCCTGGCCCGCATGGAGCTCTTCCTCTTCTTCACCTCCCTGCTGCAGCACTTCAGCTTCTCGGTGCCCACTGGACAGCCCCGGCCCAGCCACCATGGTGTCTTTGCTTTCCTGGTGACCCCATCCCCCTATGAGCTTTGTGCTGTGCCCCGCTAGAATGGGGTACCTAGTCCCCAGCCTGCTCCCTAGCCAG-3’；其中，質(zhì)粒載體為pMD18-T質(zhì)粒；所述CYP2D6C188T陽性對照品2中所述CYP2D6C188T突變純合子質(zhì)粒和所述CYP2D6C188T野生純合子質(zhì)粒的數(shù)量比為1:1；所述CYP2D6G4268C陽性對照品2中所述CYP2D6G4268C突變純合子質(zhì)粒和所述CYP2D6G4268C野生純合子質(zhì)粒的數(shù)量比為1:1。在本發(fā)明提供的所述試劑盒的一種較佳實(shí)施例中，所述試劑盒還包括：質(zhì)控品(controloligo)和空白對照品，所述質(zhì)控品的序列為：TAYGGTTTGCA(SEQIDNO.7)；所述空白對照品為超純水；質(zhì)控品的序列是由QIAGEN設(shè)計(jì)合成的一段寡聚核苷酸鏈，用于檢測PyroMarkQ24測序儀的各項(xiàng)性能指標(biāo)。所述的PCR反應(yīng)液1和PCR反應(yīng)液2中其他組分為常規(guī)的10xPCRBuffer、dNTPS和H2O，各組分按常規(guī)體積比配置(10xPCRBuffer、dNTPs、H2O和反應(yīng)液中引物的體積比為5:3:37.5:1)。所述試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規(guī)試劑，如由DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶組成的酶混合物，由5'-磷酰硫酸和熒光素組成的底物混合物，尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶等。本發(fā)明還提供了如上所述的引物對在制備用于檢測CYP2D6基因分型的試劑中的應(yīng)用。相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供的定性檢測CYP2D6基因分型的焦磷酸測序引物對及試劑盒具有以下有益效果：一、通過利用焦磷酸測序法技術(shù)設(shè)計(jì)了靈敏度高和特異性好的引物對及其試劑盒，使得所述試劑盒在檢測CYP2D6基因分型時，具有定性準(zhǔn)確，靈敏度高及特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)；此外，還具有樣品處理簡單、測序步驟簡單、測序速度快、半個小時完成一次上機(jī)反應(yīng)、直接給出檢測位點(diǎn)頻率分析及結(jié)果直觀的優(yōu)點(diǎn)；二、通過利用焦磷酸測序法技術(shù)設(shè)計(jì)了靈敏度高和特異性好的引物對及其試劑盒，使得所述試劑盒在檢測CYP2D6基因分型時，可實(shí)時監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程、反應(yīng)時間短、PCR產(chǎn)物簡單處理即可上焦磷酸測序儀測序、操作簡便及高通量樣品檢測，并比金標(biāo)準(zhǔn)方法，即毛細(xì)管電泳測序法靈敏度更高，更適合用于突變分析及臨床檢驗(yàn)；三、通過在所述試劑盒中設(shè)置了空白對照品、陽性對照品和質(zhì)控品，使得所述試劑盒在檢測CYP2D6基因分型時，可以更好的確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。附圖說明圖1為臨床樣品CYP2D6C188T野生型的焦磷酸測序圖；圖2為臨床樣品CYP2D6C188T突變雜合型的焦磷酸測序圖；圖3為臨床樣品CYP2D6C188T突變純合型的焦磷酸測序圖；圖4為臨床CYP2D6C188T空白對照品的焦磷酸測序圖；圖5至圖7為CYP2D6C188T多組設(shè)計(jì)引物的焦磷酸測序圖；其中圖5和圖6的測序結(jié)果不準(zhǔn)確，圖7的測序結(jié)果真實(shí)可靠。圖8為臨床樣品CYP2D6G4268C野生型的焦磷酸測序圖；圖9為臨床樣品CYP2D6G4268C突變雜合型的焦磷酸測序圖；圖10為臨床樣品CYP2D6G4268C突變純合型的焦磷酸測序圖；圖11為臨床CYP2D6G4268C空白對照品的焦磷酸測序圖；圖12至圖14為CYP2D6G4268C多組設(shè)計(jì)引物的焦磷酸測序圖；其中圖12和圖13的測序結(jié)果不準(zhǔn)確，圖14的測序結(jié)果真實(shí)可靠。圖15為臨床質(zhì)控品controloligo的焦磷酸測序圖。具體實(shí)施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實(shí)施例1：試劑盒的制備一、引物和探針的設(shè)計(jì)與合成針對人CYP2D6基因的多態(tài)性位點(diǎn)CYP2D6C188T和CYP2D6G4268C等位基因，選擇特異的突變位點(diǎn)，使用PyroMarkAssayDesign2.0軟件，設(shè)計(jì)引物；其中擴(kuò)增引物和測序引物先經(jīng)過PAGE純化，再經(jīng)HPLC純化，其中SEQIDNO.1和SEQIDNO.4的5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記。表1.突變位點(diǎn)與類型MutationBasechangeCYP2D6C188TACGCTAC[C/T]CACCAGCYP2D6G4268CCTGGTGA[C/G]CCCATCC擴(kuò)增序列如表2：表2.特異性擴(kuò)增引物及引物序列二、對照品選擇使用人工合成的一段寡聚核苷酸鏈TAYGGTTTGCAcontrololigo為質(zhì)控品；DNase/RNase-Free水為空白對照品。三、PCR反應(yīng)液組成表3.PCR反應(yīng)液1組成原料名稱體積(μL)10xPCRBuffer5dNTP3CYP2D6C188T反向擴(kuò)增引物1H2O37.5總體積46.5μL表4.PCR反應(yīng)液2組成原料名稱體積(μL)10xPCRBuffer5dNTP3CYP2D6G4268C反向擴(kuò)增引物1H2O37.5總體積46.5μL由于針對兩個檢測位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，所以有2種不同的PCR反應(yīng)液，分別對CYP2D6C188T和CYP2D6G4268C位點(diǎn)進(jìn)行檢測。實(shí)施例2：試劑盒的使用一、樣品檢測溶解引物干粉(引物溶解后有效期為1個月)。按照模板數(shù)配制體系：取PCR反應(yīng)液，加入溶好的引物、尿嘧啶DNA糖基化酶、TaqDNA聚合酶，分裝體系，加入樣品DNA、空白對照品或陽性對照品為模板，組成PCR反應(yīng)體系。按照PCR反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。CYP2D6C188T和CYP2D6G4268C體系各主要成分分別如下：表5.CYP2D6C188T體系各主要成分表6.CYP2D6G4268C體系各主要成分該體系反應(yīng)程序如下：表7.PCR反應(yīng)程序擴(kuò)增完成之后，瓊脂糖凝膠檢驗(yàn)PCR結(jié)果，以進(jìn)行下一步程序。二、焦磷酸測序按照焦磷酸測序標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行測序操作，主要步驟為：樣品的制備和純化，然后將純化后的樣品加入含有退火液和測序引物的MIX中上機(jī)測序。焦磷酸測序儀試劑倉中加入運(yùn)行程序相應(yīng)的dATP、dTTP、dCTP、dGTP、酶混合物、底物混合物。質(zhì)控品controloligo自帶測序引物，最終濃度為0.2μM。三、結(jié)果判斷質(zhì)控品堿基檢出率為100％；空白對照品檢出率為0。四、質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)各類對照質(zhì)控品判斷結(jié)果如下表：表8.質(zhì)控品標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果對照品標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)結(jié)果1質(zhì)控品峰高峰型正常、序列準(zhǔn)確2空白對照品堿基檢出率為0五、結(jié)果報(bào)告：結(jié)果如圖1、圖2、圖3、圖8、圖9及圖10所示，樣品結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：表9.報(bào)告樣品檢測結(jié)果圖1及圖8分別顯示的是臨床樣品檢測結(jié)果中CYP2D6C188T及CYP2D6G4268C的野生型，圖2及圖9分別顯示的是臨床樣品檢測結(jié)果中CYP2D6C188T及CYP2D6G4268C的突變雜合型，圖3及圖10分別顯示的是臨床樣品檢測結(jié)果中CYP2D6C188T及CYP2D6G4268C的突變純合型，圖4、圖11及圖15分別顯示的是臨床檢測結(jié)果中CYP2D6C188T空白對照品、CYP2D6G4268C空白對照品及質(zhì)控品controloligo的焦磷酸測序圖。圖5至圖7為CYP2D6C188T多組設(shè)計(jì)引物的焦磷酸測序圖；其中圖5和圖6的測序結(jié)果不準(zhǔn)確，圖7的測序結(jié)果真實(shí)可靠。圖12至圖14為CYP2D6G4268C多組設(shè)計(jì)引物的焦磷酸測序圖；其中圖12和圖13的測序結(jié)果不準(zhǔn)確，圖14的測序結(jié)果真實(shí)可靠。本發(fā)明提供的定性檢測CYP2D6基因分型的焦磷酸測序引物對及試劑盒具有以下有益效果：一、通過利用焦磷酸測序法技術(shù)設(shè)計(jì)了靈敏度高和特異性好的引物對及其試劑盒，使得所述試劑盒在檢測CYP2D6C188T及CYP2D6G4268C位點(diǎn)時，具有定性準(zhǔn)確，靈敏度高及特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)；此外，還具有樣品處理簡單、測序步驟簡單、測序速度快、半個小時完成一次上機(jī)反應(yīng)、直接給出檢測位點(diǎn)頻率分析及結(jié)果直觀的優(yōu)點(diǎn)；二、通過利用焦磷酸測序法技術(shù)設(shè)計(jì)了靈敏度高和特異性好的引物對及其試劑盒，使得所述試劑盒在檢測CYP2D6C188T及CYP2D6G4268C位點(diǎn)時，可實(shí)時監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程、反應(yīng)時間短、PCR產(chǎn)物簡單處理即可上焦磷酸測序儀測序、操作簡便及高通量樣品檢測，并比金標(biāo)準(zhǔn)方法，即毛細(xì)管電泳測序法靈敏度更高，更適合用于突變分析及臨床檢驗(yàn)；三、通過在所述試劑盒中設(shè)置了空白對照品、陽性對照品和質(zhì)控品，使得所述試劑盒在檢測CYP2D6C188T及CYP2D6G4268C位點(diǎn)時，可以更好的確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書內(nèi)容所作的等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其它相關(guān)的
技術(shù)領(lǐng)域：
，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>長沙三濟(jì)生物科技有限公司<120>定性檢測CYP2D6基因分型的焦磷酸測序引物對及試劑盒<130>2016<160>11<170>PatentInversion3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1gccgtgatagtggccatctt20<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2tcgaagcagtatggtgtgttct22<210>3<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>3ggcagggggcctggt15<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4catggtgtctttgctttcct20<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>5ggcacagcacaaagctcat19<210>6<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>6ctcatagggggatgg15<210>7<211>11<212>DNA<213>人工序列<400>7tayggtttgca11<210>8<211>175<212>DNA<213>人工序列<400>8tgcccctggccgtgatagtggccatcttcctgctcctggtggacctgatgcaccggcgcc60aacgctgggctgcacgctacccaccaggccccctgccactgcccgggctgggcaacctgc120tgcatgtggacttccagaacacaccatactgcttcgaccaggtgagggaggaggt175<210>9<211>175<212>DNA<213>人工序列<400>9tgcccctggccgtgatagtggccatcttcctgctcctggtggacctgatgcaccggcgcc60aacgctgggctgcacgctactcaccaggccccctgccactgcccgggctgggcaacctgc120tgcatgtggacttccagaacacaccatactgcttcgaccaggtgagggaggaggt175<210>10<211>275<212>DNA<213>人工序列<400>10agtcttgcaggggtatcacccaggagccaggctcactgacgcccctcccctccccacagg60ccgccgtgcatgcctcggggagcccctggcccgcatggagctcttcctcttcttcacctc120cctgctgcagcacttcagcttctcggtgcccactggacagccccggcccagccaccatgg180tgtctttgctttcctggtgagcccatccccctatgagctttgtgctgtgccccgctagaa240tggggtacctagtccccagcctgctccctagccag275<210>11<211>275<212>DNA<213>人工序列<400>11agtcttgcaggggtatcacccaggagccaggctcactgacgcccctcccctccccacagg60ccgccgtgcatgcctcggggagcccctggcccgcatggagctcttcctcttcttcacctc120cctgctgcagcacttcagcttctcggtgcccactggacagccccggcccagccaccatgg180tgtctttgctttcctggtgaccccatccccctatgagctttgtgctgtgccccgctagaa240tggggtacctagtccccagcctgctccctagccag275當(dāng)前第1頁1 2 3