本發(fā)明屬于生物體外診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種治療小腦萎縮的再生修復(fù)細(xì)胞的制備方法。
背景技術(shù)：
進(jìn)入新世紀(jì)，我國(guó)的老齡化問題日見突出，一些老年性疾病開始增多，小腦萎縮就是其中之一，目前的治療手段主要還是藥物治療，采用干細(xì)胞治療小腦萎縮的案例較少，多數(shù)采用的是細(xì)胞移植，目前還沒有采用純化細(xì)胞直接給病人注射的治療方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種治療小腦萎縮的再生修復(fù)細(xì)胞的制備方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
一種治療小腦萎縮的再生修復(fù)細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟：
步驟A，制備間充質(zhì)干細(xì)胞：通過選擇良好的臍帶、剪切、處理組織、消化、分離、培養(yǎng)進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞的制備；
步驟B，細(xì)胞的換液：取培養(yǎng)24小時(shí)以上的原代細(xì)胞按比例加入新的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)；
步驟C，細(xì)胞的傳代：置顯微鏡下觀察長(zhǎng)滿單層的細(xì)胞，可進(jìn)行傳代，傳代之后培養(yǎng)5天，期間換液一次；
步驟D，細(xì)胞的擴(kuò)增：在無菌條件下對(duì)步驟C的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，選出長(zhǎng)滿致密單層的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，培養(yǎng)4天收獲；
步驟E，收獲細(xì)胞：在無菌條件下將步驟D擴(kuò)增后的細(xì)胞，消化之后收集到1個(gè)離心管中；
步驟F，純化細(xì)胞：在無菌條件下將步驟E收獲的細(xì)胞，進(jìn)行離心；
步驟G，分裝：在無菌條件下將步驟F離心后的細(xì)胞進(jìn)行分裝，制成最終產(chǎn)品。
所述步驟A中的間充質(zhì)干細(xì)胞來源于剖腹產(chǎn)新生兒的臍帶，臍帶無菌保存于PBS溶液中。
所述步驟B中培養(yǎng)細(xì)胞的條件是37℃，5％CO2。
所述步驟C的細(xì)胞傳代的消化時(shí)間是3分鐘。
所述步驟F中的純化細(xì)胞是采用高速離心的方法進(jìn)行細(xì)胞純化。
所述步驟G中的分裝細(xì)胞按體積分裝在EP管中。
本發(fā)明的有益效果是按照本發(fā)明所述方法制備獲得的再生修復(fù)細(xì)胞的純度高，雜質(zhì)少，大大減小了細(xì)胞制劑對(duì)人體的副作用；從而大大提高了細(xì)胞制劑對(duì)小腦萎縮病人的療效，制備方法簡(jiǎn)單，容易實(shí)現(xiàn)，適合小規(guī)模治療，能夠通過改變?nèi)梭w內(nèi)細(xì)胞的大環(huán)境，提高體內(nèi)的細(xì)胞的質(zhì)量，使失去活性的細(xì)胞獲得新的生命。
具體實(shí)施方式
下面對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。
本發(fā)明公開一種治療小腦萎縮的再生修復(fù)細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟：
步驟A，制備間充質(zhì)干細(xì)胞：通過選擇良好的臍帶、剪切、處理組織、消化、分離、培養(yǎng)進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞的制備；
步驟B，細(xì)胞的換液：取培養(yǎng)24小時(shí)以上的原代細(xì)胞按比例加入新的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)；
步驟C，細(xì)胞的傳代：置顯微鏡下觀察長(zhǎng)滿單層的細(xì)胞，可進(jìn)行傳代，傳代之后培養(yǎng)5天，期間換液一次；
步驟D，細(xì)胞的擴(kuò)增：在無菌條件下對(duì)步驟C的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，選出長(zhǎng)滿致密單層的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，培養(yǎng)4天收獲；
步驟E，收獲細(xì)胞：在無菌條件下將步驟D擴(kuò)增后的細(xì)胞，消化之后收集到1個(gè)離心管中；
步驟F，純化細(xì)胞：在無菌條件下將步驟E收獲的細(xì)胞，進(jìn)行離心；
步驟G，分裝：在無菌條件下將步驟F離心后的細(xì)胞進(jìn)行分裝，制成最終產(chǎn)品。
所述步驟A中的間充質(zhì)干細(xì)胞來源于剖腹產(chǎn)新生兒的臍帶，臍帶無菌保存于PBS溶液中。
所述步驟B中培養(yǎng)細(xì)胞的條件是37℃，5％CO2。
所述步驟C的細(xì)胞傳代的消化時(shí)間是3分鐘。
所述步驟F中的純化細(xì)胞是采用高速離心的方法進(jìn)行細(xì)胞純化。
所述步驟G中的分裝細(xì)胞按體積分裝在EP管中。
詳細(xì)操作方法及步驟如下：
(1)細(xì)胞制備：選擇良好的臍帶：正常剖腹產(chǎn)新生兒臍帶一根，放入含有慶大霉素的PBS溶液中備用；剪切：先將臍帶取出，用剪刀把臍帶剪成幾段，用PBS清洗，洗掉血污，反復(fù)洗2次，再用眼科剪把臍帶切成1～2毫米大小的塊，以便于消化；消化：將已剪碎的組織塊倒入一個(gè)干凈的離心管中，其中加入I型膠原酶，膠原酶的體積沒過組織塊。將其置入37℃搖床中，消化100分鐘；離心：消化之后，將含有組織塊的離心管放入離心機(jī)中，低速(500～1000轉(zhuǎn)/分)離心8分鐘。離心之后倒掉上清；培養(yǎng)：用含10％FBS的培養(yǎng)液吹起沉淀，加入到兩個(gè)T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中37℃，5％CO2培養(yǎng)。
(2)細(xì)胞換液：培養(yǎng)24小時(shí)之后的原代細(xì)胞要進(jìn)行換液，先倒掉培養(yǎng)液，加入新鮮的含有10％FBS的培養(yǎng)液，放37℃，5％CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
(3)細(xì)胞傳代：將已培養(yǎng)5天的細(xì)胞，從培養(yǎng)箱中取出，將原來的培養(yǎng)液倒掉，加入PBS溶液洗細(xì)胞表面，倒掉PBS溶液，加入0.25％的胰酶3ml，消化細(xì)胞時(shí)間以細(xì)胞分裂為準(zhǔn)，用PBS液將細(xì)胞吹散，放入離心機(jī)中1500rpm，5min離心目的去除殘留的胰酶，用培養(yǎng)液吹起細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，吸取一管細(xì)胞懸液，放入另一個(gè)T75瓶中，就完成一次傳代，放37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。此細(xì)胞為P1代細(xì)胞。
(4)細(xì)胞擴(kuò)增：取來培養(yǎng)6天的P1代細(xì)胞，按照(2)的步驟進(jìn)行，細(xì)胞分裝入3-4個(gè)T75瓶中，即為P2代細(xì)胞，再生修復(fù)細(xì)胞為P5-P6代細(xì)胞，培養(yǎng)方式相同。
(5)細(xì)胞收獲：當(dāng)細(xì)胞傳到P5和P6代的時(shí)候就可以收獲了；消化：取來細(xì)胞倒掉原來的培養(yǎng)液，加入PBS溶液洗細(xì)胞表面，倒掉PBS溶液，加入0.25％的胰酶3ml，消化細(xì)胞時(shí)間大約2-3分鐘，待等細(xì)胞開始分散就可以吹打了；吹打：吸取PBS溶液，吹打細(xì)胞，使細(xì)胞分散，制成細(xì)胞懸液將細(xì)胞懸液放入50ml離心管中備用；離心：將離心管放入離心機(jī)中在1500rpm，5min的條件下離心，去除殘留的胰酶，棄去上清用PBS溶液吹起細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。
(6)細(xì)胞純化：先將細(xì)胞經(jīng)過0.22um的曬網(wǎng)過濾，然后進(jìn)行高速離心，離心轉(zhuǎn)速是2500rpm，10min，純化后準(zhǔn)備分裝。
(7)細(xì)胞分裝：將純化好的細(xì)胞按每2ml一個(gè)單位的體積加入到無菌的EP管中，封口貼簽。
實(shí)施例1
一、細(xì)胞制備：
選擇良好的臍帶：正常剖腹產(chǎn)新生兒臍帶一根，放入含有慶大霉素的PBS溶液中備用。剪切：先將臍帶取出，用剪刀把臍帶剪成幾段，用PBS清洗，洗掉血污，反復(fù)洗2次，再用眼科剪把臍帶切成1～2毫米大小的塊，以便于消化。消化：將已剪碎的組織塊倒入一個(gè)干凈的離心管中，其中加入I型膠原酶，膠原酶的體積沒過組織塊。將其置入37℃搖床中，消化100分鐘。離心：消化之后，將含有組織塊的離心管放入離心機(jī)中，低速(500～1000轉(zhuǎn)/分)離心8分鐘。離心之后倒掉上清。培養(yǎng)：用含10％FBS的培養(yǎng)液吹起沉淀，加入到兩個(gè)T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中37℃，5％CO2培養(yǎng)。
二、細(xì)胞換液：
培養(yǎng)24小時(shí)之后的原代細(xì)胞要進(jìn)行換液，先倒掉培養(yǎng)液，加入新鮮的含有10％FBS的培養(yǎng)液，放37℃，5％CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
三、細(xì)胞傳代：
將已培養(yǎng)5天的細(xì)胞，從培養(yǎng)箱中取出，將原來的培養(yǎng)液倒掉，加入PBS溶液洗細(xì)胞表面，倒掉PBS溶液，加入0.25％的胰酶3ml，消化細(xì)胞時(shí)間以細(xì)胞分裂為準(zhǔn)，用PBS液將細(xì)胞吹散，放入離心機(jī)中1500rpm，5min離心目的去除殘留的胰酶，用培養(yǎng)液吹起細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，吸取一管細(xì)胞懸液，放入另一個(gè)T75瓶中，就完成一次傳代，放37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。此細(xì)胞為P1代細(xì)胞。
四、細(xì)胞擴(kuò)增：
取來培養(yǎng)6天的P1代細(xì)胞，按照(2)的步驟進(jìn)行，細(xì)胞分裝入3-4個(gè)T75瓶中，即為P2代細(xì)胞，再生修復(fù)細(xì)胞為P7-P8代細(xì)胞，培養(yǎng)方式相同。
五、細(xì)胞收獲：
當(dāng)細(xì)胞傳到P7和P8代的時(shí)候就可以收獲了。消化：取來細(xì)胞倒掉原來的培養(yǎng)液，加入PBS溶液洗細(xì)胞表面，倒掉PBS溶液，加入0.25％的胰酶3ml，消化細(xì)胞時(shí)間大約2-3分鐘，待等細(xì)胞開始分散就可以吹打了。吹打：吸取PBS溶液，吹打細(xì)胞，使細(xì)胞分散，制成細(xì)胞懸液將細(xì)胞懸液放入50ml離心管中備用。離心：將離心管放入離心機(jī)中在1500rpm 5min的條件下離心，去除殘留的胰酶，棄去上清用PBS溶液吹起細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)：1X106/單位。
六、細(xì)胞純化：
先將細(xì)胞經(jīng)過0.22um的曬網(wǎng)過濾，然后進(jìn)行高速離心，離心轉(zhuǎn)速是2500rpm，10min，純化后準(zhǔn)備分裝。
七、細(xì)胞分裝：
將純化好的細(xì)胞按每2ml一個(gè)單位的體積加入到無菌的針管中。給小腦萎縮病人注射采用腰穿的方法。注射4次之后小腦萎縮患者改善效果一般。
實(shí)施例2
一、細(xì)胞制備：
選擇良好的臍帶：正常剖腹產(chǎn)新生兒臍帶一根，放入含有慶大霉素的PBS溶液中備用。剪切：先將臍帶取出，用剪刀把臍帶剪成幾段，用PBS清洗，洗掉血污，反復(fù)洗2次，再用眼科剪把臍帶切成1～2毫米大小的塊，以便于消化。消化：將已剪碎的組織塊倒入一個(gè)干凈的離心管中，其中加入I型膠原酶，膠原酶的體積沒過組織塊。將其置入37℃搖床中，消化100分鐘。離心：消化之后，將含有組織塊的離心管放入離心機(jī)中，低速(500～1000轉(zhuǎn)/分)離心8分鐘。離心之后倒掉上清。培養(yǎng)：用含10％FBS的培養(yǎng)液吹起沉淀，加入到兩個(gè)T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中37℃，5％CO2培養(yǎng)。
二、細(xì)胞換液：
培養(yǎng)24小時(shí)之后的原代細(xì)胞要進(jìn)行換液，先倒掉培養(yǎng)液，加入新鮮的含有10％FBS的培養(yǎng)液，放37℃，5％CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
三、細(xì)胞傳代：
將已培養(yǎng)5天的細(xì)胞，從培養(yǎng)箱中取出，將原來的培養(yǎng)液倒掉，加入PBS溶液洗細(xì)胞表面，倒掉PBS溶液，加入0.25％的胰酶3ml，消化細(xì)胞時(shí)間以細(xì)胞分裂為準(zhǔn)，用PBS液將細(xì)胞吹散，放入離心機(jī)中1500rpm，5min離心目的去除殘留的胰酶，用培養(yǎng)液吹起細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，吸取一管細(xì)胞懸液，放入另一個(gè)T75瓶中，就完成一次傳代，放37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。此細(xì)胞為P1代細(xì)胞。
四、細(xì)胞擴(kuò)增：
取來培養(yǎng)6天的P1代細(xì)胞，按照(2)的步驟進(jìn)行，細(xì)胞分裝入3-4個(gè)T75瓶中，即為P2代細(xì)胞，再生修復(fù)細(xì)胞為P5-P6代細(xì)胞，培養(yǎng)方式相同。
五、細(xì)胞收獲：
當(dāng)細(xì)胞傳到P5和P6代的時(shí)候就可以收獲了。消化：取來細(xì)胞倒掉原來的培養(yǎng)液，加入PBS溶液洗細(xì)胞表面，倒掉PBS溶液，加入0.25％的胰酶3ml，消化細(xì)胞時(shí)間大約2-3分鐘，待等細(xì)胞開始分散就可以吹打了。吹打：吸取PBS溶液，吹打細(xì)胞，使細(xì)胞分散，制成細(xì)胞懸液將細(xì)胞懸液放入50ml離心管中備用。離心：將離心管放入離心機(jī)中在1500rpm，5min的條件下離心，去除殘留的胰酶，棄去上清用PBS溶液吹起細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)：1X107/單位。
六、細(xì)胞純化：
先將細(xì)胞經(jīng)過0.22um的曬網(wǎng)過濾，然后進(jìn)行高速離心，離心轉(zhuǎn)速是2500rpm，10min，純化后準(zhǔn)備分裝。
七、細(xì)胞分裝：
將純化好的細(xì)胞按每2ml一個(gè)單位的體積加入到無菌的針管中。給小腦萎縮病人注射采用腰穿的方法。注射4次之后小腦萎縮患者改善明顯。
按照本發(fā)明所述方法制備獲得的再生修復(fù)細(xì)胞的純度高，雜質(zhì)少，大大減小了細(xì)胞制劑對(duì)人體的副作用；從而大大提高了細(xì)胞制劑對(duì)小腦萎縮病人的療效，制備方法簡(jiǎn)單，容易實(shí)現(xiàn)，適合小規(guī)模治療，能夠通過改變?nèi)梭w內(nèi)細(xì)胞的大環(huán)境，提高體內(nèi)的細(xì)胞的質(zhì)量，使失去活性的細(xì)胞獲得新的生命。
盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的實(shí)施例。