本發(fā)明涉及一種獲取參與細(xì)胞生物活動(dòng)的膜泡的方法，尤其涉及一種由人胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞分離并獲取外泌體(exosome)的方法，及其在細(xì)胞修復(fù)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

外泌體(exosome)是由活細(xì)胞分泌的膜泡，最早于1983年被發(fā)現(xiàn)。隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)其具有執(zhí)行蛋白、核酸的運(yùn)輸，特異靶定受體細(xì)胞，交換蛋白和脂類(lèi)或引發(fā)下游信號(hào)事件，參與細(xì)胞間的通訊等功能，而不斷受到重視。外泌體攜帶蛋白質(zhì)包括源細(xì)胞非特異性和源細(xì)胞特異性兩類(lèi)蛋白分子。前者可能與外泌體的生物發(fā)生和生物學(xué)作用有關(guān)，主要包括：細(xì)胞溶質(zhì)蛋白、參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白、各種代謝酶、熱休克蛋白和四跨膜蛋白；另一類(lèi)是特殊蛋白質(zhì)，這類(lèi)蛋白質(zhì)只存在于某種特殊的細(xì)胞分泌的exosome，而這些特定細(xì)胞源的exosome與其生物學(xué)功能有著密切聯(lián)系，例如：分子來(lái)源的exosome上含有MHCII類(lèi)分子。因此，不同細(xì)胞源的exosome所攜帶的信號(hào)分子不一樣，發(fā)揮的功能也不盡相同。例如：腫瘤細(xì)胞分泌的exosome能夠介導(dǎo)血管再生腫瘤細(xì)胞增殖及免疫逃逸，而樹(shù)突狀細(xì)胞源性exosome則能夠引起機(jī)體有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答。目前研究發(fā)現(xiàn)，exosome內(nèi)含有與細(xì)胞來(lái)源相關(guān)的蛋白質(zhì)rRNA和microRNA，并且exosome能夠通過(guò)生物屏障，在細(xì)胞間傳遞功能性核酸分子，從而發(fā)揮各種生物學(xué)功能，故exosome有望成為一種新型給藥途徑及基因治療載體。

人胎盤(pán)屬于醫(yī)療廢棄物，胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)分離來(lái)源于胎盤(pán)絨毛膜，胎盤(pán)絨毛膜富含間充質(zhì)干細(xì)胞，是一個(gè)可能優(yōu)于骨髓和其它組織的種子細(xì)胞源泉，目前報(bào)道的MSCs主要來(lái)源于骨髓，但骨髓中的含量很低，僅占骨髓中單個(gè)核細(xì)胞的1/10⁶～1/10⁵，使骨髓來(lái)源的MSCs受到了限制。另外的牙髓、脂肪和臍血源的間充質(zhì)干細(xì)胞也有報(bào)道，但它們的MSCs含量稀少，分離困難，不適合規(guī)?；僮鳌ＬケP(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于人胎盤(pán)，取材方便，可在較短的時(shí)間內(nèi)可獲得更多的細(xì)胞數(shù)量，能較好的滿足exosome的提取、富集和制備。

目前研究發(fā)現(xiàn)，胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的exosome攜帶有多種有效的細(xì)胞因子、蛋白和小分子核酸物質(zhì)，可有效介導(dǎo)細(xì)胞增殖、凋亡和功能調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，exosome中含有血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板增殖因子、腫瘤壞死因子和腫瘤生長(zhǎng)因子等，具有抑制細(xì)胞凋亡、細(xì)胞的纖維化程度，促進(jìn)血管發(fā)生有絲分裂和介導(dǎo)免疫反應(yīng)等功能。實(shí)驗(yàn)證明，在使用間充質(zhì)干細(xì)胞所分泌的exosome攜帶的胰島素樣生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子是治療急性腎損傷的關(guān)鍵主導(dǎo)因子。在免疫學(xué)方面，間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的exosome脂膜表面表達(dá)有多種膜蛋白，如：凝血因子、腫瘤壞死因子、MHC I/II分子以及CCR5趨化因子受體等，這些脂膜表面蛋白對(duì)抵抗炎癥具有重要的作用。

目前進(jìn)行exosome提取的方式和途徑也多種多樣，如：骨髓中提取、外周血中提取等，這些exosome獲取的途徑均需要有創(chuàng)傷性的細(xì)胞或組織來(lái)源。exosome提取方法主要采用超速離心法或昂貴的試劑盒過(guò)柱子法，然而超速離心法所獲取的exosome質(zhì)量不均一、不能保證exosome所獲取量、逐級(jí)離心時(shí)間冗長(zhǎng)，有時(shí)甚至離心時(shí)間或者離心速度原因而最終無(wú)法分離得到，浪費(fèi)時(shí)間及成本。而試劑盒過(guò)柱子法通常只能適用于較小量的exosome獲取，并且成本昂貴。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種人胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞源分離外泌體的方法，大幅度提高exosome的獲取量，并使得成本得以顯著下降。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種人胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞源分離外泌體的方法，操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，并使得成本得以顯著下降。

本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供一種分離自人胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞源的外泌體在細(xì)胞和組織修復(fù)中的應(yīng)用。

本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供一種分離自人胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞源的外泌體在對(duì)心肌細(xì)胞增殖和損傷修復(fù)中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的一種人胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞源分離外泌體的方法，其包括如下步驟：

P2～P3胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞匯合率達(dá)85％～90％時(shí)，收集培養(yǎng)基，獲取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，并進(jìn)行膜(如：0.22μm)過(guò)濾后，收集濾液；再將濾液離心(如：4℃，10,000g，30min-45min)，收集離心上清液，按離心上清液體積1∶1比例加入10w/v％～12w/v％聚乙二醇的溶液，并充分混勻后第二次離心(如：4℃，100,000g～120,000g，75min～85min)，最后所得沉淀即為exosome。

本發(fā)明所用的培養(yǎng)基如：CN103805562B。

本發(fā)明提供的人胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞源分離外泌體的方法，在獲取P2～P3胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞還包括：

步驟1：去除胎盤(pán)臍帶側(cè)的羊膜，分離得到絨毛膜；

步驟2：再去除絨毛膜表面黏附的結(jié)締組織；

步驟3：將絨毛膜剪碎成小塊(如；體積約為1mm³)，加入等體積II型膠原酶消化；

步驟4：離心去除組織塊、膠原酶分離得到胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞，接種(如：于T25cm²型細(xì)胞培養(yǎng)瓶中)，并進(jìn)行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。

步驟5：取P2～P3細(xì)胞進(jìn)行流式表面抗原鑒定；

步驟6：取P2～P3細(xì)胞接種并進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞；

步驟7：當(dāng)P2～P3胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞匯合率達(dá)85％～90％時(shí)收集。

本發(fā)明提供的獲取P2～P3胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，II型膠原酶的終濃度0.1w/v％～0.2w/v％，消化時(shí)間為90分鐘～100分鐘，消化溫度為37℃±1℃，還配合采用速率為200rpm～300rpm的振蕩。

本發(fā)明提供的獲取P2～P3胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中每隔3天更換一次培養(yǎng)基，直至細(xì)胞愈合度達(dá)到85-90％進(jìn)行培養(yǎng)基收集。

本發(fā)明提供的獲取P2～P3胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，流式表面抗原鑒定使用的抗體為下列鼠抗人單克隆抗體：CD90-FITC、CD105-PE、CD73-APC、CD14-/CD20-/CD34-/CD45-PerCP，以鼠抗人的IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-APC、IgG1-PerCP、IgG2a-PerCP作為同型對(duì)照。

本發(fā)明提供的另一種人胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞源分離外泌體的方法，其包括如下步驟：

步驟8：提取P2～P3胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞匯合率達(dá)85％～90％時(shí)收集的細(xì)胞培養(yǎng)基上清液，進(jìn)行膜過(guò)濾，并收集濾液；

步驟9：離心步驟8所得的濾液，棄沉淀，收集離心上清液；

步驟10：向離心上清液中按體積1∶1比例加入10w/v％～12w/v％聚乙二醇的培養(yǎng)基上清液溶液后，第二次離心，所得沉淀即為exosome。

本發(fā)明提供的上述人胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞源分離外泌體的方法，對(duì)于第二次離心所得的沉淀，還可使用緩沖液(如：PBS)進(jìn)行重懸后，實(shí)施第三次離心(如：4℃，100,000g～120,000g，75min～85min)，而獲取沉淀物，以進(jìn)一步純化exosome。

根據(jù)本發(fā)明提供的各種方法獲取的外泌體，具有細(xì)胞和組織修復(fù)的作用，可制成藥物或醫(yī)療器械用于細(xì)胞和組織修復(fù)，尤其是在心肌細(xì)胞增殖和損傷修復(fù)中的應(yīng)用。

本發(fā)明技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的有益效果：

本發(fā)明提供的人胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞源分離外泌體的方法，從組織或細(xì)胞來(lái)源方面，本發(fā)明技術(shù)方案充分利用醫(yī)療廢棄物——人胎盤(pán)作為exosome獲取的組織來(lái)源。在制備方法方面，綜合運(yùn)用膜過(guò)濾法(如：0.22μm)及在濾液離心的上清液中按體積1∶1比例加入10w/v％～12w/v％聚乙二醇的培養(yǎng)基上清液溶液等多種手段，不僅簡(jiǎn)化了操作，縮短了制取時(shí)間，還大幅度提高exosome的獲取量，進(jìn)而有效降低制取成本。

本發(fā)明方法的制取的exosome對(duì)細(xì)胞和組織具有修復(fù)作用，尤其是對(duì)心肌細(xì)胞增殖和損傷修復(fù)有重要的改善作用，可制造藥物或醫(yī)療器械用于細(xì)胞和組織修復(fù)。

附圖說(shuō)明

圖1為原代hPMSCs光學(xué)顯微鏡下形態(tài)；

圖2為hPMSCs表面抗原分子的流式細(xì)胞儀鑒定圖；

圖3為P0～P5胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞光學(xué)顯微鏡下形態(tài)圖；

圖4A為胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的exosome的高純度分析；

圖4B為胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的exosome的特異分子表達(dá)圖；

圖5為本發(fā)明加入不同濃度的聚沉物對(duì)胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的exosome得率影響的分析圖；

圖6為P0～P5胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的exosome對(duì)心肌細(xì)胞增殖作用的對(duì)比圖；

圖7為P0～P5胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的exosome的心肌細(xì)胞修復(fù)關(guān)鍵microRNAs表達(dá)的對(duì)比圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。本發(fā)明實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。

本發(fā)明實(shí)施例其它所用的試劑若未經(jīng)說(shuō)明，均購(gòu)自西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich)公司。

實(shí)施例1胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞分離制備及鑒定

使用經(jīng)產(chǎn)婦同意授權(quán)的新生兒胎盤(pán)作為間充質(zhì)干細(xì)胞的來(lái)源。

無(wú)菌條件下取產(chǎn)后新鮮胎盤(pán)，采用胎盤(pán)保存液(參見(jiàn)中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利第ZL201410028687.X號(hào))和胎盤(pán)采集保存裝置(參見(jiàn)中國(guó)實(shí)用新型專(zhuān)利第ZL2014203904164號(hào))進(jìn)行胎盤(pán)的保存運(yùn)輸。48h內(nèi)無(wú)菌條件下采用機(jī)械法將羊膜從胎盤(pán)組織上剝離，然后小心剪取胎盤(pán)絨毛膜，盡量多的去除掉黏附在絨毛膜上的結(jié)締組織，用含1v/v％P/S的PBS浸泡漂洗3次～5次，將漂洗后的絨毛膜用眼科剪剪成約1mm³碎塊，加入II型膠原酶(酶消化終濃度0.1％)37℃消化90min，并于200rpm振蕩。加入培養(yǎng)基500rpm離心5min(去除組織塊和膠原酶)，取上清加入培養(yǎng)基2,000rpm離心10min(進(jìn)一步去除膠原酶)，棄上清，加入培養(yǎng)基2,000rpm離心10min(更進(jìn)一步去除膠原酶)，棄上清，加入培養(yǎng)基吹打均；取20μl細(xì)胞懸液加入到80μl紅細(xì)胞裂解液中，室溫下裂解5min，計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×10⁶細(xì)胞/ml，接種于T25cm2型細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5％CO₂，飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，相差顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察；培養(yǎng)2天～3天后全量換液，棄去未貼壁細(xì)胞，以后每2-3d全量換液一次；觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80％～90％匯合時(shí)，以0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化，所得細(xì)胞為原代細(xì)胞(參見(jiàn)圖1)。

觀察原代hPMSCs細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80％～90％匯合時(shí)，吸棄培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)原有培養(yǎng)液，吸取10m10.01M PBS緩沖液輕輕加入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)洗滌，棄去洗液；加入0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化液1.0ml，浸漫覆蓋瓶底，倒置顯微鏡下觀察；加入1.0mlFBS中止胰酶消化；加入10ml 0.01M PBS反復(fù)吹打沖洗，在室溫下1200rpm離心5min；棄去上清液，加入5ml DMEM重懸細(xì)胞，按1∶2～1∶3比例傳代培養(yǎng)；置37℃，5％CO₂，飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，計(jì)為第1代hPMSCs(P1)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80％～90％匯合時(shí)，重復(fù)上述操作進(jìn)行P2～P3代細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增。取培養(yǎng)P2～P3代hPMSCs，首先用0.25％的胰蛋白酶消化離心，然后用含1％小牛血清白蛋白的PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10⁷/ml；分別加入鼠抗人單克隆標(biāo)記抗體CD90-FITC、CD105-PE、CD73-APC、CD14-/CD20-/CD34-/CD45-PerCP，以鼠抗人的IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-APC、IgG1-PerCP、IgG2a-PerCP作為同型對(duì)照，室溫避光孵育10min，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，F(xiàn)lowJo軟件分析結(jié)果。結(jié)果顯示分離制備所得細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原CD73、CD90和CD105均在99％以上，而不表達(dá)CD14、CD19、CD34和CD45等表面抗原，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，制備所得的胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞純度很高。

實(shí)施例2胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察及培養(yǎng)基收集

取P0～P5代培養(yǎng)細(xì)胞，5×10⁴接種于10×10細(xì)胞培養(yǎng)皿，37℃、5％CO₂，飽和濕度靜置培養(yǎng)，使用CN103805562B記載的胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每3天換液一次，待hPMSCs細(xì)胞匯合度達(dá)到85％～90％時(shí)，收集培養(yǎng)基上清。分別在P0～P5代細(xì)胞匯合度達(dá)到85％～90％時(shí)進(jìn)行相差顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察并拍照(參見(jiàn)圖3)。如圖3所示，倒置相差顯微鏡下觀察，原代培養(yǎng)的PMSCs接種48h后，大部分細(xì)胞貼壁，形態(tài)為典型成纖維細(xì)胞樣，6-9d后所有細(xì)胞島匯合成單細(xì)胞層鋪滿全皿，中間散在些透亮圓形雜細(xì)胞。P0、P1、P2、P3代均為長(zhǎng)梭形，細(xì)胞排列緊密，成旋渦狀或放射狀生長(zhǎng)。而P4和P5代成短梭形或多邊形，細(xì)胞體積變大，成旋渦狀或網(wǎng)狀排列。

實(shí)施例3 exosome的獲取

提取的細(xì)胞培養(yǎng)上清液10ml～20ml，在4℃的環(huán)境下，0.22μm濾膜過(guò)濾；然后10,000×g離心30min，棄沉淀(去除亞細(xì)胞成分)；收集離心上清液按體積1∶1比例分別加入0w/v％、9w/v％、10w/v％、11w/v％、12w/v％和13w/v％聚乙二醇的培養(yǎng)基上清液溶液，120,000×g第二次離心75min，所得沉淀即為exosome。

用30ml PBS溶液重新懸浮沉淀物，混勻后再以120,000×g離心75min，用1ml PBS溶液懸浮沉淀物提純的exosome溶液分別裝入eppendorf管內(nèi)，置于-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?，進(jìn)行得率分析參見(jiàn)圖5，其中12％PEG的添加組exosome得率最高。

實(shí)施例4胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的exosome心肌細(xì)胞修復(fù)特異分子表達(dá)

利用exosome的RNA和蛋白抽提試劑盒(invitrogen公司)進(jìn)行上述所得P0～P5代胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞源exosome中的RNA和總蛋白，通過(guò)microRNA反轉(zhuǎn)錄、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)心肌細(xì)胞修復(fù)關(guān)鍵表達(dá)microRNA分子microRNA15a、microRNA21、microRNA20b，以及western blot檢測(cè)胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞源exosome特異表面蛋白CD63表達(dá)水平，結(jié)果參見(jiàn)圖4和圖7所示，從人胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基上清中分離獲得的exosome透射電鏡下觀察大小為40nm～100nm的微囊泡(圖4A)，western blotting檢測(cè)顯示，人胎盤(pán)間充質(zhì)源exosome可表達(dá)CD63、CD9和CD81標(biāo)志蛋白分子(圖4B)。P0～P5胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞源exosome中均microRNA15a、microRNA21、microRNA20b，且P2和P3表達(dá)豐度較高(圖7)。

實(shí)施例5胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)心肌細(xì)胞增殖的作用影響

上述分離獲得的P0～P5胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞源exosome：心肌細(xì)胞培養(yǎng)基為1∶20和1∶10(v/v)進(jìn)行培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞，設(shè)置PBS添加對(duì)照組、1∶20exosome添加組、exosome 1∶10添加組，培養(yǎng)24h、48h和72h，分別采用CCK法檢測(cè)心肌細(xì)胞的增殖，結(jié)果參見(jiàn)圖6。如圖6所示，exosome 1∶20添加組、exosome 1∶10添加組在培養(yǎng)24h、48h和72h后均顯著促進(jìn)了心肌細(xì)胞的增殖，其中1∶10exosome添加組促進(jìn)作用優(yōu)于1∶20exosome添加組。P0～P5胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞源exosome對(duì)心肌細(xì)胞增殖均有促進(jìn)作用，從24h和48h培養(yǎng)結(jié)果顯示其中P2和P3代間充質(zhì)干細(xì)胞源exosome對(duì)心肌增殖的促進(jìn)作用最優(yōu)。