本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及東方山羊豆赤霉素受體基因GoGID的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
赤霉素是一類四環(huán)二萜烷類物質(zhì)，屬于植物五大激素之一，在植物的多種重要生長發(fā)育過程中發(fā)揮作用。包括種子萌發(fā)，葉片伸展，莖伸長，開花，以及種子發(fā)育等。赤霉素受體是赤霉素信號傳導(dǎo)途徑中重要環(huán)節(jié)，能夠結(jié)合活性GA，形成GID-GA-DELLA復(fù)合體，經(jīng)泛素E3酶復(fù)合體(SCFGID2/SLY1)識別，介導(dǎo)DELLA蛋白形成多聚泛素鏈，隨后被26S蛋白酶體降解，從而引發(fā)GA響應(yīng)。
赤霉素受體基因(Gibberellin Insensitive Dwarf1，GID1)是2005年從水稻赤霉素不敏感矮化突變體中首先發(fā)現(xiàn)的。該基因編碼了一個類似于激素敏感脂酶的可溶性蛋白，定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。隨后，在擬南芥、棉花、楊樹等物種中也相繼發(fā)現(xiàn)了赤霉素受體。多項(xiàng)研究結(jié)果都顯示，赤霉素受體參與多個植物生長發(fā)育過程，GID突變導(dǎo)致經(jīng)典的植物矮化表型。
東方山羊豆(Galegaorientalis)為重要的多年生豆科牧草，產(chǎn)量高，營養(yǎng)豐富，飼喂利用期比苜蓿早，青飼反芻家畜不得臌脹病，并具有促進(jìn)奶牛泌乳等功能。
紫花苜蓿(Medicago sativa)是苜蓿屬多年生豆科植物，因其產(chǎn)量高、適口性好、品質(zhì)優(yōu)良，而在全世界廣泛種植，素有“牧草之王”的美譽(yù)，全世界的種植面積超過千萬公頃。紫花苜蓿的主要利用部位是莖稈，因此生物產(chǎn)量是紫花苜蓿的重要育種目標(biāo)。常規(guī)育種方法選育時間長，效果也不明顯。隨著基因組學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)分子改良牧草已經(jīng)成為可能。miR156能夠調(diào)控柳枝稷的生物量以及頂端優(yōu)勢和花的轉(zhuǎn)變。將紫花苜蓿miR156的前體分離后在紫花苜蓿中超表達(dá)，導(dǎo)致受miR156調(diào)控的3個SPL基因全部下調(diào)。轉(zhuǎn)基因材料的節(jié)間長度和莖粗減低，分支數(shù)增加，毛狀體密度增大，開花時間推遲，生物量獲得顯著增高。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種東方山羊豆赤霉素受體基因GoGID轉(zhuǎn)化紫花苜蓿的方法。
本發(fā)明所述的東方山羊豆赤霉素受體基因GoGID轉(zhuǎn)化紫花苜蓿的方法,包括以下步驟：
(1)將東方山羊豆赤霉素受體基因GoGID插入到PBI121載體質(zhì)粒DNA中，得到PBI121重組載體：
設(shè)計5’端包含XbaI酶切位點(diǎn)的上游引物P1和BamHI酶切位點(diǎn)的下游引物P2，如序列表中SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；
P1：5'-GCTCTAGAATGGTGATCGAGAACGACATTGAG-3'；
P2：5'-CGGGATCCTCAGTGATGGCCACGCCTAAGTGATG-3'；
其中，下劃線部分為酶切位點(diǎn)；
用該引物從東方山羊豆cDNA模板中擴(kuò)增GoGID的全長閱讀框，PBI載體和目的基因全長片段經(jīng)XbaI和BamHI雙酶切后回收產(chǎn)物，經(jīng)T4DNA連接酶連接，得到插入有GoGID基因的PBI121載體，其含有CaMV35s啟動子、GoGID基因以及一個卡那霉素抗性篩選標(biāo)記；
其中，所述東方山羊豆赤霉素受體基因GoGID如序列表中SEQ ID NO:3所示；
(2)將所述PBI121重組載體導(dǎo)入到根癌農(nóng)桿菌LBA4404中：
A.向農(nóng)桿菌LBA4404中加入PBI121重組載體質(zhì)粒DNA，混勻，冰?。?/p>
B.于液氮中速凍，立即置于水浴中溫育；
C.加入YEB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)；
D.菌體涂布于YEB選擇平板上，培養(yǎng)兩天；
E.挑取單菌落，接種于YEB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜；
提取導(dǎo)入有GoGID基因的農(nóng)桿菌LBA4404的質(zhì)粒并測序，結(jié)果顯示導(dǎo)入基因的核苷酸序列與如序列表中SEQ ID NO:3所示的序列一致，則表明含有目的基因GoGID的表達(dá)載體構(gòu)建成功；
(3)導(dǎo)入有GoGID基因的農(nóng)桿菌LBA4404的培養(yǎng)；
(4)以紫花苜蓿單株為材料，生長于人工氣候室中，取深綠色健康葉片，切成外植體；
將外植體放在農(nóng)桿菌重懸液中，然后放到無菌濾紙上，除去多余液體；
在共培培養(yǎng)基上生長；把外植體取出，除菌；隨后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基上；愈傷組織轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；胚發(fā)育成小枝或根；小植株移入生根培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；
(5)紫花苜蓿轉(zhuǎn)基因植株鑒定、擴(kuò)繁及評價：
將上述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的植株，提取DNA，以nptⅡ基因引物P3、P4，GUS基因引物P5、P6進(jìn)行檢測；以引物P7、P8進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄水平檢測，其中，P3～P8如序列表中SEQ IDNO:7～NO:12所示；
挑選表達(dá)量較高轉(zhuǎn)基因株系在大桶中生長，待長大后，通過扦插法獲得拷貝和擴(kuò)繁；
用PBI121載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，獲得重組農(nóng)桿菌LBA4404，用重組農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)空載體的對照植株；
轉(zhuǎn)空載體的紫花苜蓿、轉(zhuǎn)化插入有GoGID基因的PBI121載體的紫花苜蓿在人工氣候室中成活后，分株，種于小盆；待健壯后，移于大盆，在溫室中生長，期間精心管理，及時控制病蟲害；觀察表型，測定株高、鮮重、干重、葉莖比、開花期等指標(biāo)。
本發(fā)明所述東方山羊豆赤霉素受體基因GoGID轉(zhuǎn)化紫花苜蓿的方法，其中步驟(3)包括如下具體步驟：將導(dǎo)入有GoGOD基因的農(nóng)桿菌于含有卡那霉素和鏈霉素的固體培養(yǎng)基上劃平板，放于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；
兩天后，從平板上挑取單菌落，接種于含有卡那霉素和鏈霉素的YEB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)；
用培養(yǎng)好的菌液劃平板，培養(yǎng)，待長出單菌落后，將平板放于4℃保存；
在平板上挑取單菌落，接種于含有卡那霉素和鏈霉素的YEB液體培養(yǎng)基內(nèi)，在恒溫?fù)u床上培養(yǎng)；
兩天以后取少量菌液，稀釋到含有卡那霉素和鏈霉素的YEB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期；將菌體收集到離心管中，離心富集菌體，棄上清，再用SH液體培養(yǎng)基重懸菌體，使菌液的OD600值為0.6-0.8，待用。
本發(fā)明所述東方山羊豆赤霉素受體基因GoGID轉(zhuǎn)化紫花苜蓿的方法，其中步驟(1)中所述東方山羊豆赤霉素受體基因GoGID是由東方山羊豆為原料制備而得，其制備方法包括以下步驟：
A.東方山羊豆總RNA的提取；
B.RACE克隆GoGID基因cDNA全長；
C.重組質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)化，并測序。
本發(fā)明所述的東方山羊豆赤霉素受體基因GoGID轉(zhuǎn)化紫花苜蓿的方法，其中，東方山羊豆赤霉素受體基因GoGID的制備方法的步驟A采用Trizol試劑法，包括如下具體步驟：
a.將東方山羊豆組織材料加入至Trizol試劑，加入液氮快速磨碎，放至變?yōu)閯驖{；
b.吸取勻漿到離心管中，劇烈振蕩混勻，于室溫放置，然后離心；
c.取上清，加入氯仿，劇烈振蕩，室溫放置，然后離心；
d.溶液分層后，取上層移入另一支離心管，加入等體積氯仿，重復(fù)上一步驟；
e.取其上清，加入等體積異丙醇，混合混勻，室溫放置，然后離心，得到白色RNA沉淀；
f.棄上清，加入乙醇，將沉淀沖起，離心，倒掉乙醇，留下沉淀；
g.重復(fù)上一步驟，晾干，加DEPC水溶解；
h.進(jìn)行RNA電泳，檢測RNA提取質(zhì)量，使用微量核酸蛋白分析儀測定RNA濃度。
本發(fā)明所述的東方山羊豆赤霉素受體基因GoGID轉(zhuǎn)化紫花苜蓿的方法，其中，東方山羊豆赤霉素受體基因GoGID的制備方法的步驟B包括如下具體步驟：
(1)RACE-ready cDNA的合成
a.準(zhǔn)備緩沖液：5×第一鏈緩沖液、DTT、dNTP Mix；
b.制備用于5’RACE的cDNA反應(yīng)液和用于3’RACE的cDNA反應(yīng)液；
c.將步驟b中制備好的液體混勻，離心，孵育，再冷卻，離心收集反應(yīng)液液體；
d.向5’RACE的cDNA反應(yīng)液中加入SMARTer IIA oligo，離心收集反應(yīng)液液體；
e.制備5’RACE和3’RACE-Ready cDNA反應(yīng)液：將步驟a中得到的緩沖液、RNA酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶混勻；
f.向步驟c中得到的3’RACE和步驟d中得到的5’RACE反應(yīng)液中分別加入步驟e中得到的反應(yīng)液，混合，離心收集液體；
g.將制備好的反應(yīng)液孵育；
h.加熱，完成Ready-cDNA的合成；
(2)RACE引物的設(shè)計
設(shè)計原則包括：
a.基因特異引物GSPs滿足以下條件：23-28bp；GC含量50％-70％；Tm值>70℃；與3’-端通用引物不發(fā)生互補(bǔ)；
b.需設(shè)計兩個GSP引物，反向引物GSP1用于5’RACE，正向引物GSP2用于3’RACE；
根據(jù)以上設(shè)計原則，設(shè)計GSP1和GSP2兩條引物；
(3)cDNA末端的快速合成
a.制備PCR混合液：PCR反應(yīng)體系中加入以下試劑：PCR用水、10×Advantage 2PCR緩沖液、dNTP Mix、50×Advantage 2聚合酶Mix；混合，離心收集液體；
b.制備用于5’RACE的PCR反應(yīng)液：5’RACE–ready cDNA、10×UPM、GSP1、步驟a中制備的PCR混合液；
制備用于3’RACE的PCR反應(yīng)液：3’RACE–ready cDNA、10×UPM、GSP2、步驟a中制備的PCR混合液；
c.RACE擴(kuò)增：
反應(yīng)體系為：94℃30秒，72℃3分鐘，共5個循環(huán)；94℃30秒，70℃3分鐘，72℃3分鐘，共5個循環(huán)；94℃30秒，68℃30秒，72℃3分鐘，共20個循環(huán)；
取PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，回收目的條帶，用T4DNA連接酶連接回收產(chǎn)物于PMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。
本發(fā)明所述的東方山羊豆赤霉素受體基因GoGID轉(zhuǎn)化紫花苜蓿的方法，其中，東方山羊豆赤霉素受體基因GoGID的制備方法的步驟B所述引物GSP1和GSP2如序列表中SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示。
本發(fā)明所述的東方山羊豆赤霉素受體基因GoGID轉(zhuǎn)化紫花苜蓿的方法，其中，東方山羊豆赤霉素受體基因GoGID的制備方法的步驟C包括如下具體步驟：
a.DH5α感受態(tài)細(xì)胞融化，加入DNA連接產(chǎn)物，混合均勻后冰浴；
b.熱擊，立即冰??；
c.加入LB液體培養(yǎng)基，恒溫振蕩器下培養(yǎng)；
d.離心，收集菌體；
e.LB平板上涂布X-gal和IPTG，使其均勻涂布平板表面，常溫晾干；
f.取菌液均勻涂布于LB平板上，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；次日將平板放置使之充分顯色；
g.挑選白色單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜；
對菌液進(jìn)行PCR檢測，挑選陽性菌液，進(jìn)行測序。
本發(fā)明最終所獲得的轉(zhuǎn)化紫花苜蓿的突出效果為：
(1)東方山羊豆赤霉素受體基因GoGID在紫花苜蓿中超表達(dá)后，轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的株高增加了0.2-0.35倍，生物量增加了14.9-46.3％，紫花苜蓿的葉長葉寬也顯著高于野生型，此外，開花時間比野生型晚一周。并且，轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的品質(zhì)指標(biāo)沒有受到顯著影響。結(jié)果表明GoGID作為一個赤霉素受體基因，調(diào)控了植物，尤其是牧草的多個生長發(fā)育過程，特別是提高了葉片的長度和寬度，而且調(diào)控了轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的開花期。這是之前對于赤霉素受體基因的研究中所未見報道的。
(2)本發(fā)明為解析牧草赤霉素信號途徑提供理論基礎(chǔ)，也為紫花苜蓿產(chǎn)量性狀的遺傳改良提供可能的候選基因和理論依據(jù)。
下面結(jié)合附圖說明和具體實(shí)施例對本發(fā)明的東方山羊豆赤霉素受體基因GoGID轉(zhuǎn)化紫花苜蓿的方法作進(jìn)一步說明。
附圖說明
圖1為本發(fā)明實(shí)施例中植物表達(dá)載體構(gòu)建示意圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 東方山羊豆赤霉素受體基因GoGID的制備
根據(jù)東方山羊豆差顯雜交文庫數(shù)據(jù)信息，設(shè)計RACE擴(kuò)增引物GSP1和GSP2，如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，利用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech，USA)分別對該序列進(jìn)行5’RACE和3’RACE克隆，最后獲得了該基因全長序列。具體方法如下：
1、東方山羊豆總RNA的提取：
東方山羊豆總RNA的提取采用Trizol試劑法，具體步驟如下：
(1)將0.3g東方山羊豆組織材料加入至3000μl Trizol試劑，加入液氮快速磨碎，放在無菌環(huán)境中直至變?yōu)閯驖{；
(2)用移液槍吸取1mL勻漿到1.5mL離心管中，劇烈振蕩混勻，于室溫放置5min，然后于4℃下13000rpm離心10min；
(3)取上清，加入200μL氯仿，劇烈振蕩，室溫放置2-3min，然后于4℃下13000rpm離心15min；
(4)溶液從下到上依次分為三層：有機(jī)相、蛋白質(zhì)、無色水相；取上層移入另一支離心管，加入等體積氯仿，重復(fù)上一步驟；
(5)取其上清加入等體積異丙醇，混合混勻，室溫放置10min，然后于4℃下13000rpm離心10min，得到白色RNA沉淀；
(6)棄上清，加入1000μL由DEPC水配制的75％乙醇，將沉淀沖起，于4℃下13000rpm離心10min，倒掉乙醇，留下沉淀；
(7)重復(fù)上一步驟，在無菌環(huán)境下晾干，加20-50μl無菌DEPC水溶解；
(8)進(jìn)行RNA電泳，檢測RNA提取質(zhì)量，微量核酸蛋白分析儀測定RNA濃度。
2、RACE克隆基因cDNA全長
(1)RACE-ready cDNA的合成
a.準(zhǔn)備緩沖液：2.0μl 5×第一鏈緩沖液，1.0μl的DTT，1.0μl的dNTP Mix；其中，DTT的濃度為20mM，dNTP Mix的濃度為10mM；
b.制備用于5’RACE的cDNA反應(yīng)液：2.75μl RNA，1.0μl 5'-CDS Primer A；制備用于3’RACE的cDNA反應(yīng)液：3.75μl RNA，1.0μl 3'-CDS Primer A；
c.將步驟b中制備好的液體混勻，短暫離心，72℃孵育3分鐘，再于42℃冷卻2分鐘，短暫離心收集反應(yīng)液液體；
d.向5’RACE的cDNA反應(yīng)液中加入1μl的SMARTer IIA oligo，短暫離心收集反應(yīng)液液體；
e.制備5’RACE和3’RACE-Ready cDNA反應(yīng)液：4.0μl步驟a中得到的緩沖液，0.25μl的RNA酶抑制劑，1.0μl的逆轉(zhuǎn)錄酶，將以上試劑混勻；其中，RNA酶抑制劑的濃度為40U/μl；逆轉(zhuǎn)錄酶的濃度為100U/μl；
f.向步驟c中得到的3’RACE和步驟d中得到的5’RACE反應(yīng)液中分別加入5.25μl步驟e中得到的反應(yīng)液，輕柔混合，短暫離心收集液體；
g.將制備好的反應(yīng)液于42℃中孵育90分鐘；
h.70℃加熱10分鐘，完成Ready-cDNA的合成；
(2)RACE引物的設(shè)計
設(shè)計原則包括：
a.基因特異引物GSPs滿足以下條件：23-28bp；GC含量50％-70％；Tm值>70℃；與3’-端通用引物不發(fā)生互補(bǔ)；
b.需設(shè)計兩個GSP引物，反向引物GSP1用于5’RACE，正向引物GSP2用于3’RACE；
根據(jù)以上設(shè)計原則，設(shè)計GSP1和GSP2兩條引物，如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示；
(3)cDNA末端的快速合成
a.制備PCR混合液：每50μl PCR反應(yīng)體系中加入以下試劑：34.5μl PCR用水，5.0μl 10×Advantage 2PCR緩沖液，1.0μl的dNTP Mix，1.0μl 50×Advantage 2聚合酶Mix；輕輕混合液體，不可產(chǎn)生氣泡，短暫離心收集液體；其中，dNTP Mix的濃度為10mM；
b.制備用于5’RACE的PCR反應(yīng)液：2.5μl 5’RACE–ready cDNA，5.0μl 10×UPM，1.0μlGSP1；41.5μl的步驟a中制備的PCR混合液；
制備用于3’RACE的PCR反應(yīng)液：2.5μl 3’RACE–ready cDNA，5.0μl 10×UPM，1.0μlGSP2；41.5μl的步驟a中制備的PCR混合液；
c.RACE擴(kuò)增：
反應(yīng)體系為：94℃30秒，72℃3分鐘，共5個循環(huán)；94℃30秒，70℃3分鐘，72℃3分鐘，共5個循環(huán)；94℃30秒，68℃30秒，72℃3分鐘，共20個循環(huán)；
取PCR產(chǎn)物于重量百分比為1.0％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，回收目的條帶，用T4DNA連接酶連接回收產(chǎn)物于PMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。
3、重組質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)化
(1)DH5α感受態(tài)細(xì)胞在冰上融化，吸取50μl，加入5μl的DNA連接產(chǎn)物，混合均勻后冰浴30min；
(2)42℃熱擊60sec，立即冰浴3-5min；
(3)加入700μl LB液體培養(yǎng)基，于37℃，恒溫振蕩器150r/min下培養(yǎng)60min；
(4)5000rpm離心3min，收集菌體；
(5)含抗生素Amp100mg/L的LB平板上涂布X-gal和IPTG，使其均勻涂布平板表面，常溫晾干；其中，X-gal的濃度為2％，IPTG的濃度為50mg/ml；
(6)取100μl菌液均勻涂布于含抗生素Amp100mg/L的LB平板上，培養(yǎng)箱中37℃倒置培養(yǎng)過夜；次日將平板于4℃放置使之充分顯色；
(7)挑選白色單菌落于1ml Amp終濃度為100mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，225r/min下，于37℃培養(yǎng)過夜；
對菌液進(jìn)行PCR檢測，挑選陽性菌液，送Invitrogen公司進(jìn)行測序。對結(jié)果進(jìn)行序列拼接，結(jié)果顯示該基因具有如序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，其編碼的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示。
實(shí)施例2農(nóng)桿菌介導(dǎo)的GoGID基因轉(zhuǎn)化紫花苜蓿植株
1材料與試劑
1.1植物材料
供試苜蓿品種為紫花苜蓿(Medicago sativa L.cv.Zhongmu No.1，中苜一號)。
1.2農(nóng)桿菌菌株和質(zhì)粒載體
所用的農(nóng)桿菌菌株為根癌農(nóng)桿菌：LBA4404
農(nóng)桿菌培養(yǎng)基：
表1
121℃高壓蒸汽滅菌20min；載體：PBI121。
2實(shí)驗(yàn)方法
2.1將GoGID基因插入到PBI121載體質(zhì)粒DNA中，具體步驟為：設(shè)計5’端包含XbaI酶切位點(diǎn)的上游引物和BamHI酶切位點(diǎn)的下游引物，如序列表中SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示；
(P1：5'-GCTCTAGAATGGTGATCGAGAACGACATTGAG-3'，
P2：5'-CGGGATCCTCAGTGATGGCCACGCCTAAGTGATG-3'，
其中，下劃線部分為酶切位點(diǎn))；
用該引物從東方山羊豆cDNA模板中擴(kuò)增GoGID的全長閱讀框，PBI載體和目的基因全長片段經(jīng)XbaI和BamHI雙酶切后回收產(chǎn)物，經(jīng)T4DNA連接酶連接，得到插入有GoGID基因的PBI121載體，其含有CaMV35s啟動子、GoGID基因以及一個卡那霉素抗性篩選標(biāo)記，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時可通過卡那霉素篩選初步鑒定獲得的轉(zhuǎn)基因植株，含有目的片段的質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)如圖1所示。
2.2將插入有GoGID基因的PBI121載體導(dǎo)入到根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，具體步驟如下：
A.向100μl農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞LBA4404中加入約1μg質(zhì)粒DNA，輕輕混勻，冰浴30min；
B.于液氮中速凍1min，立即置于37℃水浴中溫育5min；
C.加入800μl YEB液體培養(yǎng)基，28℃150rpm培養(yǎng)4-6h；
D.菌體涂布于含有50mg/L卡那霉素和100mg/L鏈霉素的YEB選擇平板上，28℃倒置培養(yǎng)兩天。
E.挑取單菌落，接種于YEB液體培養(yǎng)基中(含50mg/L卡那霉素和100mg/L鏈霉素)，28℃震蕩培養(yǎng)過夜。
提取導(dǎo)入有GoGID基因的農(nóng)桿菌的質(zhì)粒并測序，結(jié)果顯示導(dǎo)入基因的核苷酸序列與如序列表中SEQ ID NO:3所示的序列一致，表明含有目的基因GoGID的表達(dá)載體構(gòu)建成功。
2.3農(nóng)桿菌的培養(yǎng)
將導(dǎo)入有GoGOD基因的農(nóng)桿菌于含有50mg/L卡那霉素和100mg/L鏈霉素的固體培養(yǎng)基上劃平板，放于培養(yǎng)箱內(nèi)，28℃培養(yǎng)。兩天后，從平板上挑取單菌落，接種于含有50mg/L卡那霉素和100mg/L鏈霉素的20ml YEB液體培養(yǎng)基中，180rpm，28℃培養(yǎng)。用培養(yǎng)好的菌液劃平板，28℃培養(yǎng)，待長出單菌落后，將平板放于4℃保存。
在平板上挑取單菌落，接種于20ml含有50mg/L卡那霉素和100mg/L鏈霉素的YEB液體培養(yǎng)基內(nèi)，在恒溫?fù)u床上于28℃，180rpm培養(yǎng)。兩天以后取少量菌液，以1:50-1:100的比例稀釋到含50mg/L卡那霉素和100mg/L鏈霉素的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)6-12h至對數(shù)生長期。將菌體收集到離心管中，4000rpm離心10min富集菌體，棄上清，再用約20ml不含抗生素的改良的SH液體培養(yǎng)基重懸菌體，使菌液的OD600值為0.6-0.8，待用。
2.4外植體的準(zhǔn)備：
以紫花苜蓿單株為材料，生長于人工氣候室中，3-4周后，取葉片(深綠色健康葉片)，無菌條件下，切成外植體。
2.5轉(zhuǎn)化過程
外植體準(zhǔn)備，滅菌。外植體為大、厚、深綠色葉片，肉眼看起來非常健康為佳。將外植體在A600 0.6-0.8的農(nóng)桿菌重懸液(滅菌的YEP)中15-30分，然后放到無菌濾紙上，除去多余液體；在共培培養(yǎng)基上生長7-8天；把外植體取出，放入滅菌水中，顛倒10-20次，以除去菌。重復(fù)以上過程2-3次。隨后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基上；2-3周后，愈傷組織轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；3周后，胚將發(fā)育成小枝；小植株移入生根培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。
2.6轉(zhuǎn)基因株植鑒定及擴(kuò)繁
將上述轉(zhuǎn)化的植株，提取DNA，以nptⅡ基因引物P3、P4，GUS基因引物P5、P6，以引物P7、P8進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄水平檢測；其中，P3～P8如序列表中SEQ ID NO:7～NO:12所示；
挑選表達(dá)量較高轉(zhuǎn)基因株系L9、L38、L39，在大桶中生長，待長大后，通過扦插法獲得拷貝和擴(kuò)繁。
2.7GoGID基因的PBI121載體轉(zhuǎn)化紫花苜蓿評價：
用PBI121載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，獲得重組農(nóng)桿菌，用重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)空載體的對照植株，方法如步驟2.2～2.6，獲得轉(zhuǎn)空載體對照植株(CK)，作為對比例1。
評價轉(zhuǎn)空載體的紫花苜蓿和轉(zhuǎn)化插入有GoGID基因的PBI121載體紫花苜蓿的各項(xiàng)指標(biāo)，具體方法如下：
對照和轉(zhuǎn)基因扦插植株在人工氣候室中成活后，分株，種于小盆。待健壯后，移于大盆，在溫室中生長，期間精心管理，及時控制病蟲害。觀察表型，測定株高、鮮重、干重、葉莖比、開花期等指標(biāo)。統(tǒng)計結(jié)果見表2。
表2
注：**代表轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿與轉(zhuǎn)空載體的紫花苜蓿之間存在顯著性差異。
GoGID基因增強(qiáng)表達(dá)后，與對比例紫花苜蓿相比，轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的株高增加了0.2-0.35倍，生物量增加了14.9-46.3％，葉片長度和寬度顯著高于對比例。此外，轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的開花時間也推遲了一周。結(jié)果表明GoGID作為一個赤霉素受體基因，調(diào)控了植物，尤其是牧草的多個生長發(fā)育過程，特別是提高了葉片的長度和寬度，而且調(diào)控了轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的開花期。
以上所述的實(shí)施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。