技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種生物肥加工方法，屬于農(nóng)用肥料技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種微生態(tài)復(fù)合肥及其制備方法。
背景技術(shù)：
目前市場(chǎng)上已出現(xiàn)一些復(fù)合微生物菌劑，但其或者功能單一，或者其使用方法受到限制，使用后的作物增產(chǎn)效果還不能達(dá)到令人滿意，所以目前仍需要開發(fā)適用于多種施用途徑、具有綜合功能和良好增產(chǎn)效果的復(fù)合微生物菌劑或肥料。
申請(qǐng)?zhí)枮?01310743759.4的發(fā)明專利“一種微生物肥料的制備方法”，公開了一種微生物肥料的制備方法，屬于農(nóng)用肥料技術(shù)領(lǐng)域，所述微生物肥料的生產(chǎn)方法，是將黑曲霉培養(yǎng)物、解磷巨大芽孢桿菌、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌按比例混合為微生物肥料。該發(fā)明的肥料通過復(fù)合微生物發(fā)酵的方法制成，能夠改善土壤的微生態(tài)環(huán)境，為農(nóng)作物的生長提供有益條件。解磷巨大芽孢桿菌能分解土壤中的有機(jī)磷成為植物可利用的速效磷；該發(fā)明使用的黑曲霉具有產(chǎn)高活力纖維素酶的特性，纖維素酶有利于土壤有機(jī)質(zhì)的分解，腐殖質(zhì)的形成和碳素營養(yǎng)的釋放。每畝土地使用本發(fā)明的肥料的量為50-100克，是目前國內(nèi)外使用量較少的微生物肥料之一。公布號(hào)為CN102888356A的專利申請(qǐng)，公開了一種利用枯草芽孢桿菌制備微生物肥料的方法及其應(yīng)用。該專利公開了一種利用保藏菌種枯草芽孢桿菌CCTCCM2012287制備的微生物肥料及其制備方法以及應(yīng)用。利用該菌制備的微生物肥料，可促進(jìn)甜瓜植株和根系的生長發(fā)育，且甜瓜品質(zhì)有明顯提升、營養(yǎng)成分更高。申請(qǐng)?zhí)枮?01410040955.X的發(fā)明專利“一種大顆粒教槽料及其制備方法”，該發(fā)明所述大顆粒教槽料，特別添加了先經(jīng)酶解，再添加枯草芽孢桿菌CICC10063和CGMCCNo.7926混合菌液發(fā)酵制備的發(fā)酵豆粕，和枯草芽孢桿菌CGMCC No.7926發(fā)酵制備的高溫淀粉酶及其培養(yǎng)物。該發(fā)明飼料配方科學(xué)合理既能滿足仔豬的營養(yǎng)需求，又能增強(qiáng)飼料的適口性，針對(duì)各種原料各自特點(diǎn)進(jìn)行預(yù)處理，不但提高了消化、吸收率，且降低了抗?fàn)I養(yǎng)因子。
由于我國長期缺乏在微生物肥料方面的研究投入，使得我國的微生物肥料產(chǎn)業(yè)依然存在整體水平不高、技術(shù)創(chuàng)新不足、產(chǎn)品質(zhì)量與應(yīng)用效果表現(xiàn)欠穩(wěn)定的問題。在農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展已成為人類共識(shí)的今天，這些問題成了微生物肥行業(yè)函待打通的“瓶頸”。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供一種微生態(tài)肥及其制備方法。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：一種微生態(tài)肥，重量份數(shù)組成為：枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物10-15，黑曲霉培養(yǎng)物5-10，植物乳桿菌劑20-30份。
所述植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)保藏號(hào)為CGMCC NO.9405。
所述制備微生態(tài)肥的方法：將枯草芽孢桿菌、黑曲霉培養(yǎng)物和植物乳桿菌按比例組合造粒機(jī)造粒即可。
所述枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物制備：從斜面轉(zhuǎn)接培養(yǎng)枯草芽孢桿菌，逐級(jí)擴(kuò)培后的種子液轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵完畢發(fā)酵液經(jīng)過板框過濾、干燥后獲得含枯草芽孢桿菌菌劑的培養(yǎng)物。
植物乳桿菌劑的制備方法：從斜面轉(zhuǎn)接培養(yǎng)植物乳桿菌，逐級(jí)擴(kuò)培后的種子液轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵完畢發(fā)酵液經(jīng)低溫負(fù)壓真空濃縮到原體積的45％，得到菌濃縮液。添加載體：向濃縮液中添加混合好的載體，混合均勻；濃縮液與載體的重量比為0.5-0.6:1，載體組成為：CaCO3 20-30份，糊精10-15份。流化床干燥，干燥溫度50℃。
黑曲霉培養(yǎng)物制備：菌種培養(yǎng)，固體發(fā)酵培養(yǎng)：孢子液接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)料中，26-33℃培養(yǎng)至菌絲長滿培養(yǎng)料，低溫流化床干燥，粉碎干燥物；采用常見固態(tài)發(fā)酵法制備獲得。
本發(fā)明采用的菌種如下：
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis subsp)CGMCC 7926；
黑曲霉(Aspergillus niger)CGMCC NO.7927。
上述菌種的保藏單位是中國普通微生物菌種保藏管理中心。地址：北京市中關(guān)村北一條13號(hào)中科院微生物研究所；郵編：100080。
有益效果：
本發(fā)明的肥料由復(fù)合微生物發(fā)酵而成，能夠改善土壤的微生態(tài)環(huán)境，為農(nóng)作物的生長提供有益條件。
在生物肥料工業(yè)上，黑曲霉具有裂解大分子有機(jī)物和難溶無機(jī)物，便于作物吸收利用，改善土壤結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)土壤肥力，提高作物產(chǎn)量的效果。黑曲霉具有解磷的特性，可以利用固定態(tài)、吸附態(tài)的磷，有效緩解土壤中缺磷的現(xiàn)狀，而且對(duì)提高磷肥利用率，減少磷肥的使用所造成的環(huán)境污染。
本發(fā)明使用的黑曲霉還具有產(chǎn)高活力纖維素酶的特性，纖維素酶有利于土壤有機(jī)質(zhì)的分解，腐殖質(zhì)的形成和碳素營養(yǎng)的釋放，用在果類作物上，能使果肉細(xì)嫩清脆，果汁豐富，口感良好。
本發(fā)明的肥料營養(yǎng)豐富，有機(jī)質(zhì)含量高，能夠滿足有機(jī)食品的生產(chǎn)需要。
本發(fā)明的肥料能夠增強(qiáng)作物的抗病蟲害能力。
本發(fā)明的肥料能夠改良土壤，肥料中有益微生物能產(chǎn)生糖類物質(zhì)，占土壤有機(jī)質(zhì)的0.1％，與植物粘液、礦物胚體和有機(jī)膠體結(jié)合在一起，可以改善土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)土壤的物理性能和減少土壤顆粒的損失，在一定的條件下，還能參與腐殖質(zhì)形成。
本產(chǎn)品使用方法簡單，每畝地使用量0.3-1公斤，拌種或生長期灌水前地表噴灑。
具體實(shí)施方式
除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)這些實(shí)施方案中的反應(yīng)條件、分離提取條件進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1
本發(fā)明中植物乳桿菌菌株特點(diǎn)如下：在顯微鏡下觀察，該菌株為短桿狀，革蘭氏染色呈陽性，無鞭毛，不產(chǎn)芽孢；在固體培養(yǎng)基上，該菌菌落為白色，表面光滑，致密，形態(tài)為圓形，邊緣較整齊。
理化特征為：過氧化氫酶(-)，明膠液化(-)，吲哚實(shí)驗(yàn)(+)，運(yùn)動(dòng)性(-)，發(fā)酵產(chǎn)氣(-)，亞硝酸鹽還原(-)，發(fā)酵產(chǎn)氣(-)，產(chǎn)硫化氫氣體(-)，pH4.0MRS培養(yǎng)基中生長(+)。
本發(fā)明植物乳桿菌采用下述流程進(jìn)行選育：
原始出發(fā)菌種→試管活化→硫酸二乙酯(DES)誘變→亞硝基胍(NTG)誘變→等離子體誘變→平板初篩→搖瓶復(fù)篩→傳代穩(wěn)定性試驗(yàn)。
本發(fā)明所采用的出發(fā)菌株在MRS葡萄糖培養(yǎng)基中，其乳酸的生產(chǎn)速率為1.5g/L/d,當(dāng)培養(yǎng)基pH為3.5時(shí)幾乎停止生長，對(duì)亞硝酸鈉的分解速率為0.34mg/h/kg白菜。出發(fā)菌株為李政采集于寧夏鹽池縣育肥羊場(chǎng)的青儲(chǔ)飼料，采集時(shí)間2013年9月15日。
為了提高其乳酸生產(chǎn)速率、耐酸能力和亞硝酸鹽的分解速率，依次采用DES和NTG技術(shù)對(duì)該菌種進(jìn)行誘變，誘變后菌株采用MRS碳酸鈣平板進(jìn)行初篩，然后采用500mL搖瓶發(fā)酵，生物傳感器分析儀對(duì)高產(chǎn)菌進(jìn)行復(fù)篩，選育優(yōu)良的植物乳桿菌菌株，然后做傳代實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)其遺傳穩(wěn)定性。
植物乳桿菌tlj-2014遺傳穩(wěn)定性結(jié)果表明：經(jīng)過連續(xù)傳代十次，各項(xiàng)性能指標(biāo)都比較穩(wěn)定，遺傳性較好，性狀沒有回復(fù)，因此把植物乳桿菌tlj-2014作為選育得到的目的菌株。
經(jīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)：該誘變菌株的乳酸生產(chǎn)速率可以達(dá)到35g/L/d，該菌株經(jīng)過71小時(shí)發(fā)酵后乳酸濃度達(dá)到95g/L；能夠在pH為1.80的條件下存活。降解亞硝酸鹽速度快，分解能力達(dá)到9.8mg/h/kg(自然發(fā)酵過程亞硝酸鹽積累的速率大約為1.1mg/h/kg)，能夠耐1％膽鹽。
因此采用該菌種生產(chǎn)泡菜，整個(gè)發(fā)酵過程中亞硝酸鹽濃度在5mg/kg以下，遠(yuǎn)低于國家標(biāo)準(zhǔn)GB2714-2003中規(guī)定的含量(20mg/kg)。
植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)tlj-2014，該菌株已于2014年7月2日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào),郵編：100101)，保藏號(hào)為CGMCC NO.9405。
1.DES誘變選育
1)在超凈臺(tái)上取試管斜面上的植物乳桿菌L一環(huán)，接入裝有50mL培養(yǎng)基MRS(無瓊脂，葡萄糖20g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培養(yǎng)12h左右，使菌體處于對(duì)數(shù)生長前期。
2)取5mL菌液，5000rpm離心10min收集菌體，用生理鹽水洗滌2次。
3)用pH7.0磷酸緩沖液稀釋成107個(gè)/mL菌懸液。
4)取32mL pH7.0的磷酸鉀緩沖液、8mL菌懸液、0.4mL DES在預(yù)先放入轉(zhuǎn)子的150mL三角瓶中充分混合，使DES最終濃度為1％(v/v)。
5)在37℃搖床中150rpm反應(yīng)30min，取1mL混合液，加入0.5mL 25％Na2S2O3溶液中止反應(yīng)。
6)適當(dāng)稀釋，取最后稀釋度的菌液0.2mL，涂布于碳酸鈣篩選培養(yǎng)基(含100g/L葡萄糖的碳酸鈣MRS培養(yǎng)基)平皿中。在37℃培養(yǎng)2～3天后，采用影印法將該篩選平板的菌株轉(zhuǎn)印到pH為1.5、1.8和2.0的LPHMRS培養(yǎng)基(低pH值改性MRS培養(yǎng)基)上和亞硝酸鈉篩選培養(yǎng)基(單一氮源為2g/L亞硝酸鈉的改性MRS篩選培養(yǎng)基)上。
7)在37℃培養(yǎng)2～3天后，挑選菌落較大，分別能在LPHMRS培養(yǎng)基、亞硝酸鈉篩選培養(yǎng)基上生長并且在碳酸鈣篩選培養(yǎng)基上。經(jīng)初步篩選，挑取出的菌落命名為植物乳桿菌L1。
2.亞硝基胍誘變
1)在超凈臺(tái)上取試管斜面上的植物乳桿菌L1一環(huán)，接入裝有50mL培養(yǎng)基MRS(無瓊脂)(葡萄糖濃度為60g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培養(yǎng)12h左右，使菌體處于對(duì)數(shù)生長前期。
2)取5mL菌液5000rpm離心10min收集菌體，用生理鹽水洗滌2次。
3)用pH6.0磷酸緩沖液稀釋成107個(gè)/mL菌懸液。
4)取10mL菌懸液轉(zhuǎn)移至100mL三角瓶中，加入10mg的NTG，配制成終濃度為10mg/mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
5)在37℃下200rpm振蕩反應(yīng)30min，5000rpm離心10min收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌數(shù)次，中止反應(yīng)。
6)適當(dāng)稀釋，取最后稀釋度的菌液0.2mL，涂布于碳酸鈣篩選培養(yǎng)基(含100g/L葡萄糖的碳酸鈣MRS培養(yǎng)基)平皿中。在37℃培養(yǎng)2～3天后，采用影印法將該篩選平板的菌株轉(zhuǎn)印到pH為1.5、1.8和2.0的LPHMRS培養(yǎng)基(低pH值改性MRS培養(yǎng)基)上和亞硝酸鈉篩選培養(yǎng)基(單一氮源為2g/L亞硝酸鈉的改性MRS篩選培養(yǎng)基)上。
7)挑選菌株方法：挑選菌落較大，分別能在LPHMRS培養(yǎng)基、亞硝酸鈉篩選培養(yǎng)基上生長并且在碳酸鈣篩選培養(yǎng)基上。經(jīng)初步篩選，挑取100支符合以上條件的菌落。
3.搖瓶復(fù)篩
1)在超凈臺(tái)上分別取各試管斜面上的植物乳桿菌一環(huán)，接入裝有50mL培養(yǎng)基MRS(無瓊脂)(葡萄糖濃度為100g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培養(yǎng)15h左右，使菌體處于對(duì)數(shù)生長中期。
2)分別取5mL菌液，接入裝有50mL碳酸鈣篩選液體培養(yǎng)基(含250g/L葡萄糖的碳酸鈣MRS培養(yǎng)基)平皿中、pH為1.5、1.8和2.0的LPHMRS液體培養(yǎng)基(低pH值改性MRS培養(yǎng)基)和亞硝酸鈉液體篩選培養(yǎng)基(單一氮源為2g/L亞硝酸鈉的改性MRS篩選培養(yǎng)基)上(注：采用250mL三角瓶)。200rpm，37℃培養(yǎng)3-4天，每天分別檢測(cè)碳酸鈣篩選液體培養(yǎng)基中L-乳酸產(chǎn)生速率、LPHMRS液體培養(yǎng)基中的生物量和亞硝酸鈉液體篩選培養(yǎng)基中亞硝酸鹽的消耗速率。發(fā)酵結(jié)束后，比較100株菌種的碳酸鈣篩選液體培養(yǎng)基中L-乳酸產(chǎn)生速率、LPHMRS液體培養(yǎng)基中的生物量和亞硝酸鈉液體篩選培養(yǎng)基中亞硝酸鹽的消耗速率。
3)選擇兼具高L-乳酸產(chǎn)生速率、耐受低pH(該菌種僅能在最低為pH1.8的培養(yǎng)基中生長)和亞硝酸鹽的消耗速率高的菌株，將其命名為L2菌。
4.遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)
將L2菌在斜面上連續(xù)十次傳代，并用搖瓶復(fù)篩的方法檢測(cè)每次傳代后的發(fā)酵情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在斜面上連續(xù)十次傳代，該菌種性狀沒有明顯變化，各項(xiàng)性能指標(biāo)都正常，說明該菌種的遺傳穩(wěn)定性較強(qiáng)。菌株命名為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)tlj-2014。
5.5L發(fā)酵罐試驗(yàn)
1)取斜面上的植物乳桿菌L2一環(huán)，接入裝有50mL培養(yǎng)基MRS(無瓊脂)(葡萄糖濃度為150g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培養(yǎng)12h左右，使菌體處于對(duì)數(shù)生長中期。
2)將對(duì)數(shù)期的菌種接入裝有3L MRS液體培養(yǎng)基(初始葡萄糖為150g/L)的5L發(fā)酵罐中。接種量為10％，37℃下100rpm培養(yǎng)8小時(shí)，對(duì)數(shù)前期溶氧控制10％(通氣0.5L/min)，后期厭氧培養(yǎng)63小時(shí)。發(fā)酵結(jié)束后，植物乳桿菌L2的乳酸產(chǎn)量達(dá)到95g/L。這樣的產(chǎn)乳酸速率利于泡菜的快速發(fā)酵。
3)將對(duì)數(shù)期的菌種接入裝有3L pH為1.8的LPHMRS液體培養(yǎng)基(初始葡萄糖為50g/L)的5L發(fā)酵罐中。接種量為10％，37℃下100rpm培養(yǎng)8小時(shí)，對(duì)數(shù)前期溶氧控制10％(通氣0.5L/min)，后期厭氧，整個(gè)過程用0.5mol/L的氫氧化鈉將發(fā)酵液pH控制在1.8，總培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)。發(fā)酵結(jié)束后，檢測(cè)植物乳桿菌L2的生物量為2.5g/L，說明植物乳桿菌L2能夠在pH1.8的環(huán)境中生存。
4)將對(duì)數(shù)期的菌種接入裝有3L亞硝酸鈉液體篩選培養(yǎng)基(單一氮源為2g/L亞硝酸鈉的改性MRS篩選培養(yǎng)基)的5L發(fā)酵罐中。接種量為10％，37℃下100rpm培養(yǎng)8小時(shí)，對(duì)數(shù)前期溶氧控制10％(通氣0.5L/min)，后期厭氧，發(fā)酵過程根據(jù)亞硝酸鹽的消耗速率流加20g/L的亞硝酸鈉溶液，培養(yǎng)2-3天。發(fā)酵結(jié)束后，計(jì)算發(fā)酵過程植物乳桿菌L2對(duì)亞硝酸鈉的降解速率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在該條件下，L2對(duì)亞硝酸鈉的降解速率可以達(dá)到563mg/h/L。
5)將對(duì)數(shù)期的菌種10mL接入裝有2kg預(yù)處理過的白菜中，按照傳統(tǒng)泡菜方法進(jìn)行加工，每12小時(shí)測(cè)定泡菜中的亞硝酸鹽含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)發(fā)酵過程中，L2菌對(duì)亞硝酸鈉的分解速率為9.8mg/h/kg白菜。泡菜中的亞硝酸鈉含量始終低于5mg/kg，遠(yuǎn)低于國家標(biāo)準(zhǔn)GB2714-2003中規(guī)定的含量(20mg/kg)。
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Li-2013-02，該菌株已于2013年7月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào))，保藏號(hào)為CGMCC No.7926。
所述菌株特性是產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶的酶活力高，耐熱、耐酸性強(qiáng)。
所述菌株制備的耐高溫α-淀粉酶酶活力為30000-35000u/ml；適用溫度范圍為105-115℃，最適反應(yīng)溫度110℃，在110℃酶活完全穩(wěn)定；適用反應(yīng)pH值范圍為3.0-7.0，在pH值為3.0時(shí)酶活完全穩(wěn)定，最適反應(yīng)pH值為4.2。
所述菌株特點(diǎn)如下：
所述菌株在固體平板上菌落顏色為乳白色，表面干燥不透明，邊緣整齊，為具有運(yùn)動(dòng)性的好氧菌。鏡檢為長桿狀，革蘭氏染色呈陽性。該菌可利用檸檬酸鹽，硝酸還原、V-P實(shí)驗(yàn)成陽性。
所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Li-2013-02由一株產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶的枯草芽孢桿菌Li-2013經(jīng)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變篩選獲得，具體篩選步驟如下：
(1)菌懸液的制備
將在平板劃線分離后長出的Li-2013單菌落接入種子培養(yǎng)基中，100r/min，40℃培養(yǎng)12h后，取1mL培養(yǎng)液離心后用生理鹽水洗滌兩次，并重懸與9mL生理鹽水中。
(2)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變
將菌懸液置于無菌平板中，在距離為30cm，功率15w的紫外燈下攪拌照射100s。將經(jīng)過照射的菌液經(jīng)梯度稀釋后涂布于氯化鋰平板，并以未經(jīng)紫外照射的菌液稀釋涂平板做對(duì)照。將上述涂布均勻的平板，用黑色的布或報(bào)紙包好，置40℃培養(yǎng)48h，在長出菌落的平板上篩選出水解圈與菌落直徑比值最大者挑至斜面保存，純化后配制成菌懸液，經(jīng)梯度稀釋后與硫酸二乙酯原液充分混合，并于40℃震蕩處理40min，將處理過的菌液經(jīng)梯度稀釋后涂布于氯化鋰平板。
(3)高產(chǎn)菌種的初篩
將上述涂布均勻的平板，置40℃培養(yǎng)48h，在長出菌落的平板上初篩出水解圈與菌落直徑比值較大者挑至斜面保存，純化后獲得三株菌Li-2013-01，Li-2013-02,Li-2013-03。
(4)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩
將獲得的三株菌Li-2013-01，Li-2013-02,Li-2013-03在含有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，種子接種量10％(V/V)，40℃、100r/min培養(yǎng)72h，離心取發(fā)酵上清液制得粗酶液。
(5)酶活測(cè)定
酶活單位的定義：1mL粗酶液，于105℃、pH 4.2條件下，1min液化1mg可溶性淀粉，
即為1個(gè)酶活力單位，以U/mL表示。
經(jīng)測(cè)定，菌株Li-2013-02,為穩(wěn)定的最高產(chǎn)菌株，且酶活達(dá)到30000U/mL。
所述氯化鋰平板：淀粉1％，蛋白胨1％，(NH)2SO4 0.4％，K2HPO4 0.8％，CaCl20.2％，氯化鋰0.9％，瓊脂2％。
所述的種子培養(yǎng)基：酵母粉0.5％，蛋白胨1％，可溶性淀粉1％，NaCl 1％。
所述的發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉5％-15％，豆餅粉4％-10％，(NH)2SO4 0.4％，K2HPO40.8％，CaCl2 0.2％。
所述的搖瓶培養(yǎng)條件：該菌在含有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，接種量10％(V/V)，100r/min、40℃發(fā)酵培養(yǎng)72h。
所述耐高溫的α-淀粉酶，其酶學(xué)性質(zhì)如下：
(1)該酶溫度適應(yīng)范圍較寬，最適作用溫度在100-110℃之間，且在110℃以下保存的，溫度穩(wěn)定性較好，而110℃以上保存長時(shí)間溫度穩(wěn)定性較差。
(2)該酶最適反應(yīng)pH值為4.2。在pH值3.0-7.0之間均有較高酶活力，在pH值為3.0時(shí)酶活完全穩(wěn)定。
(3)酶活性：由本發(fā)明所提供的突變株Li-2013-02,制備的耐高溫α-淀粉酶酶活力為30000-35000U/ml。
本發(fā)明提供的黑曲霉(Aspergillus niger)Li-2013-03是由天津工業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏的一株產(chǎn)纖維素酶的黑曲霉(Aspergillus niger)Li-2010經(jīng)亞硝基胍多輪誘變篩選，然后對(duì)優(yōu)良菌株經(jīng)發(fā)酵性能測(cè)試篩選得到產(chǎn)高活力纖維素酶的黑曲霉菌株(Aspergillus niger)Li-2013-03。
本發(fā)明提供的產(chǎn)高活力纖維素酶的菌株具體為黑曲霉(Aspergillus niger)Li-2013-03。該菌株已于2013年7月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCC NO.7927。
本發(fā)明黑曲霉菌株(Aspergillus niger)Li-2013-03(CGMCC No.7927)具有以下微生物學(xué)特征：
1、形態(tài)學(xué)特征：
黑曲霉菌株CGMCC No.7927，生物學(xué)形態(tài)為包括分生孢子、胞梗、頂囊、產(chǎn)胞結(jié)構(gòu)等幾部分。分生孢子頭球形至輻射形，直徑150-450μm，分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)。胞梗莖1000-3000(長度)×12-20(直徑)μm，黃色或黃褐色，壁平滑；頂囊球形或近似球形，直徑45-75μm，表面全面可育；產(chǎn)胞結(jié)構(gòu)雙層，?；?0-20(長度)×4.5-7.0(直徑)μm，瓶梗6-10(長度)×2.5-3.5(直徑)μm，分生孢子球形或近球形，直徑3-4.5μm，褐色，壁粗糙。
2、培養(yǎng)學(xué)特征：
菌株在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上生長迅速，28℃4天孢子可鋪滿斜面；質(zhì)地絲絨狀或稍帶絮狀；分生孢子結(jié)構(gòu)大量，褐黑色，無滲出液；菌落反面略帶黃色。
3、生理生化特征：
黑曲霉菌株CGMCC No.7927可在玉米秸稈、稻草、木屑、馬鈴薯、玉米粉、可溶性淀粉、糖蜜等碳源上生長，最適pH范圍5-6，最適生長溫度范圍28-33℃，最適產(chǎn)酶溫度范圍28-30℃。
本發(fā)明黑曲霉菌株CGMCC No.7927的篩選技術(shù)路線為：出發(fā)菌株→斜面培養(yǎng)→孢子懸液的制備→誘變處理→平板分離→初篩→復(fù)篩→遺傳穩(wěn)定性測(cè)定→擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)(發(fā)酵性能測(cè)定)。
按誘變篩選方案，對(duì)突變株逐級(jí)篩選淘汰，最后對(duì)優(yōu)良菌株經(jīng)發(fā)酵性能測(cè)試篩選，得到一株高產(chǎn)酶性能菌株黑曲霉菌(Aspergillus niger)Li-2013-03，發(fā)酵96小時(shí)后纖維素酶的外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和濾紙酶活力分別達(dá)到620U/mL、1289U/mL、456U/mL和732U/mL。
28℃發(fā)酵4天直徑75mm，發(fā)酵液纖維素酶的的外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和濾紙酶活力分別達(dá)到620U/mL、1289U/mL、456U/mL和732U/mL，分別比出發(fā)菌株提高了9.21倍、7.43倍、8.15倍和10.31倍。
產(chǎn)高活力纖維素酶菌株的篩選方法，包括以下步驟：
1)斜面培養(yǎng)：將原始黑曲霉菌株(Aspergillus niger)Li-2010劃線接種斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2～3d，直至菌絲體成熟、產(chǎn)大量黑色孢子。所述斜面培養(yǎng)基組成如下：12OBrix麥芽汁l000mL，pH值自然，121℃滅菌20min；
2)孢子懸液制備(以下步驟均在無菌條件下操作)：向試管斜面加入15mL無菌水，把孢子刮下，用濾紙過濾，將濾過液倒入已滅菌、并加有5-10粒無菌玻璃珠的150mL三角瓶中，將三角瓶放入搖床振蕩10-15min，使孢子分散。
3)亞硝基胍(NTG)誘變
①用無菌水將孢子懸浮液調(diào)節(jié)為稀釋成106-107個(gè)/mL。
②取10mL菌懸液轉(zhuǎn)移至100mL三角瓶中，加入10mg的NTG，配制成終濃度為10mg/mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
③在30℃下200rpm振蕩反應(yīng)30min，5000rpm離心10min收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌數(shù)次，中止反應(yīng)。
④適當(dāng)稀釋將孢子濃度調(diào)節(jié)為103個(gè)/mL，取最后稀釋度的菌液0.2mL，稀釋涂布于纖維素-剛果紅平板篩選培養(yǎng)基上。在30℃培養(yǎng)2～3天后挑取透明圈/菌落直徑較大的菌株200支。(所述纖維素-剛果紅平板篩選培養(yǎng)基組成如下：纖維素粉10g、剛果紅0.2g、硫酸銨5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀1g、氯化鈉0.1g、明膠2g、瓊脂20g、自來水定容1000mL，pH值5-6，121℃滅菌20min)。
⑤復(fù)篩：將獲得的200株菌分別用無菌牙簽接種于斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)至孢子鋪滿斜面。分別將孢子以無菌水洗下接種于裝有50mL復(fù)篩培養(yǎng)基的250mL三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵，接種量10％(v/v)，30℃、100r/min培養(yǎng)96h，分別測(cè)定各菌株的纖維素酶活性。(所述復(fù)篩培養(yǎng)基組成如下：纖維素粉50g、硫酸銨5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀1g、氯化鈉0.1g、自來水定容1000mL，pH值5-6，121℃滅菌20min)。選取纖維素酶酶活力最高的菌株進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)。
4)遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)
將Li-2013-03菌株在斜面上連續(xù)十次傳代，并用搖瓶復(fù)篩的方法檢測(cè)每次傳代后的發(fā)酵情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在斜面上連續(xù)十次傳代，該菌種性狀沒有明顯變化，各項(xiàng)性能指標(biāo)都正常，說明該菌種的遺傳穩(wěn)定性較強(qiáng)。
5)放大試驗(yàn)
①種子培養(yǎng)：將纖維素酶酶活力最高的菌株(Aspergillus niger)Li-2013-03接入500mL三角瓶中，種子培養(yǎng)基裝量100毫升，30℃、150rpm搖床培養(yǎng)72-96h。
②種子罐培養(yǎng)：將種子液以10％(v/v)接種量接入裝有7.5L發(fā)酵液的10L發(fā)酵罐中，控制pH值恒定為6.0±0.2，培養(yǎng)溫度30±0.1℃，攪拌速度300rpm，通風(fēng)量(v/v)1:0.8-1.2,培養(yǎng)時(shí)間96h，溶解氧20-30％。所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：纖維素粉100g、硫酸銨5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀1g、氯化鈉0.1g、自來水定容1000mL，pH值5-6，121℃滅菌20min。
發(fā)酵結(jié)束后，取發(fā)酵上清液(粗酶液)進(jìn)行酶活力檢測(cè)經(jīng)測(cè)定，菌株(Aspergillus niger)Li-2013-03的外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和濾紙酶活力分別達(dá)到620U/mL、1289U/mL、456U/mL和732U/mL，分別比出發(fā)菌株(Aspergillus niger)Li-2010提高了9.21倍、7.43倍、8.15倍和10.31倍。
實(shí)施例2
一種微生態(tài)肥，其重量份數(shù)組成為：枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物15，黑曲霉培養(yǎng)物8，植物乳桿菌劑25份。
所述植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)保藏號(hào)為CGMCC NO.9405；
枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物的制備方法：
發(fā)酵液的獲得：采用斜面菌種逐級(jí)擴(kuò)培獲得枯草芽孢桿菌發(fā)酵液；
(1)一級(jí)種子培養(yǎng)：將枯草芽孢桿菌斜面菌種接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床180轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí)；
(2)二級(jí)種子培養(yǎng)：將一級(jí)種子按照10％的接種量接入500毫升二級(jí)種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級(jí)種子相同；
(3)三級(jí)種子培養(yǎng)：將二級(jí)種子以10％接種量接入5000毫升三級(jí)種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量1000毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床100轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí)；
(4)一級(jí)種子罐培養(yǎng)：將三級(jí)種子以10％接種量接入總?cè)莘e為150L的一級(jí)種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度28℃，攪拌速度100轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量(V/V)1:0.5,罐壓0.05MPa,培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí)；
(5)發(fā)酵培養(yǎng)：將一級(jí)種子罐菌種以10％接種量接入總?cè)莘e為1.5噸二級(jí)種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量1噸，培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度28℃，攪拌速度100轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量(V/V)1:0.5,罐壓0.05MPa,培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí)。發(fā)酵液板框過濾后干燥獲得。
培養(yǎng)基組成：葡萄糖6％,酵母提取物1％,蛋白胨0.2％，CaCO3 1％,pH6.8。
植物乳桿菌劑的制備方法：
(1)一級(jí)種子培養(yǎng)：將植物乳桿菌菌種接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí)；
(2)二級(jí)種子培養(yǎng)：將一級(jí)種子按照10％的接種量接入500毫升二級(jí)種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級(jí)種子相同；
(3)三級(jí)種子培養(yǎng)：將二級(jí)種子以10％接種量接入5000毫升三級(jí)種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量1000毫升，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí)；
(4)一級(jí)種子罐培養(yǎng)：將三級(jí)種子以5％接種量接入總?cè)莘e為150L的一級(jí)種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度30℃，罐壓0.05MPa,培養(yǎng)時(shí)間18小時(shí)；
(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)：將一級(jí)種子罐菌種以5％接種量接入總?cè)莘e為3噸二級(jí)種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量2噸，培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度30℃，罐壓0.05MPa,培養(yǎng)時(shí)間22小時(shí)。發(fā)酵完畢發(fā)酵液經(jīng)低溫負(fù)壓真空濃縮到原體積的45％，得到菌濃縮液。添加載體：向濃縮液中添加混合好的載體，混合均勻；濃縮液與載體的重量比為0.5:1，載體組成為：CaCO3 25份，糊精12份,流化床干燥，干燥溫度50℃。
培養(yǎng)基組成為：酪蛋白胨1％,牛肉提取物1％,酵母提取物0.5％,葡萄糖0.5％,乙酸鈉0.5％,檸檬酸二胺0.2％,Tween 80 0.1％,K2HPO4 0.2％,MgSO4.7H2O 0.02％,MnSO4.H2O 0.005％,CaCO3 2％,瓊脂1.5％,pH6.8。
黑曲霉培養(yǎng)物的制備方法:
斜面菌種活化培養(yǎng)：將黑曲霉斜面菌種轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，27℃培養(yǎng)3天；
固體一級(jí)種子培養(yǎng)：挑取黑曲霉斜面菌種接入裝有100克培養(yǎng)基的500毫升三角瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)，30℃培養(yǎng)3天即可；
固體二級(jí)種子培養(yǎng)：將上述培養(yǎng)好的固體一級(jí)種子攪拌為碎塊后加入裝有1000克培養(yǎng)基的5000毫升三角瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：30℃培養(yǎng)3天即可；
固體發(fā)酵培養(yǎng)：將二級(jí)搖瓶種子粉碎，加入裝有滅菌培養(yǎng)基的發(fā)酵池或托盤中混合均勻后培養(yǎng)，曲料培養(yǎng)溫度控制在26-35℃，濕度80-90％，每隔10小時(shí)翻料一次，培養(yǎng)時(shí)間5-7天；固體曲料的培養(yǎng)采用常用曲料培養(yǎng)技術(shù)；待培養(yǎng)料長滿菌絲即可結(jié)束培養(yǎng)，培養(yǎng)基預(yù)先經(jīng)高溫蒸煮滅菌處理，滅菌條件控制溫度121℃，時(shí)間1小時(shí)；
干燥粉碎：發(fā)酵結(jié)束培養(yǎng)料在流化床或其他干燥設(shè)備上進(jìn)行干燥，干燥溫度控制在60℃，干燥到水分含量在10％以下，然后將固體培養(yǎng)料進(jìn)行粉碎，物料粉碎孔徑在60目以上；
培養(yǎng)基組成：固體原料：麩皮80％,豆餅粉10％,玉米淀粉10％，添加等量自來水；初始pH自然。
實(shí)施例3
一種微生態(tài)肥，重量份數(shù)組成為：枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物13，黑曲霉培養(yǎng)物5，植物乳桿菌劑20份。
所述植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)保藏號(hào)為CGMCC NO.9405。
實(shí)施例4
一種微生態(tài)肥及，重量份數(shù)組成為：枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物10，黑曲霉培養(yǎng)物10，植物乳桿菌劑30份。
植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)保藏號(hào)為CGMCC NO.9405。
實(shí)施例4
產(chǎn)品效果實(shí)驗(yàn)
試驗(yàn)地的選擇與試驗(yàn)設(shè)計(jì)：試驗(yàn)于2013年3月30日—10月28日在寧夏鹽池縣花馬池鎮(zhèn)八堡村進(jìn)行。
試驗(yàn)田達(dá)到田種植玉米10畝，分別在種植時(shí)使用本發(fā)明產(chǎn)品每畝0.5公斤，出苗1個(gè)月左右通過鋤地松土方式使用發(fā)明產(chǎn)品0.5公斤，對(duì)照組使用常規(guī)肥料。
發(fā)明產(chǎn)品使用玉米地玉米產(chǎn)量達(dá)到750公斤，對(duì)照組達(dá)到500公斤；該地塊在第2年種植春小麥，春小麥產(chǎn)量達(dá)到了480公斤，比對(duì)照組單產(chǎn)提高了29％。且試驗(yàn)田土壤結(jié)構(gòu)良好，無大塊和板結(jié)。