技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于食品安全的分子生物學(xué)檢測(cè)方法領(lǐng)域，特別涉及一種單增李斯特菌的LAMP引物組及檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
：

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）簡(jiǎn)稱單增李斯特菌，是一種能夠引起人畜共患病的食源性致病菌，屬李斯特菌屬。在自然界中廣泛分布，主要存在于土壤、動(dòng)植物體和水產(chǎn)品中，食用了被單增李斯特污染的食物，可導(dǎo)致人和動(dòng)物敗血癥、流產(chǎn)、腦膜炎等，病死率高達(dá)30%～70%，是人類(lèi)最重要的食源性病原菌之一。單增李斯特菌對(duì)食品企業(yè)威脅最大，它能夠存活在高鹽分、冷藏以及低水分活度的食品生產(chǎn)環(huán)境中，由于巴氏殺菌能將其殺死，所以主要存在于后巴氏殺菌過(guò)程中。它可以附著在非生物質(zhì)表面，形成生物膜，因此極易污染連續(xù)生產(chǎn)過(guò)程中的產(chǎn)品。

目前，單增李斯特菌的檢測(cè)方法主要依賴于傳統(tǒng)分離鑒定、免疫學(xué)檢測(cè)和PCR方法等。傳統(tǒng)培養(yǎng)法耗時(shí)大約5到7天，檢測(cè)周期長(zhǎng)，不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)需求；免疫學(xué)檢測(cè)如ELLSA法雖然快速靈敏，但特異性低，易出現(xiàn)假陽(yáng)性，而且成本較高；PCR法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和速度快等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)儀器設(shè)備要求高，需要專門(mén)的操作人員進(jìn)行后續(xù)的電泳操作和紫外觀察，限制了其在基層實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。因而，急需開(kāi)發(fā)一種既簡(jiǎn)單快速，又靈敏特異的檢測(cè)方法以滿足對(duì)食品中單增李斯特菌的實(shí)時(shí)檢測(cè)要求。

環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是由Notomi等建立的一種體外核酸特異性擴(kuò)增技術(shù)。LAMP法是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異的引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA ploymerase）在恒溫條件（65℃左右）保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速等優(yōu)點(diǎn)，適用于實(shí)驗(yàn)條件相對(duì)薄弱的基層地區(qū)開(kāi)展食源性致病菌的快速檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
：

本發(fā)明的一個(gè)目的是在于提供一種的LAMP引物。根據(jù)單增李斯特氏菌的溶血素基因（hlyA）保守區(qū)序列設(shè)計(jì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物，應(yīng)用PrimerExplorer V4（http://primerexplorer. jp/elamp4.0.0/index.html）在線設(shè)計(jì)特異引物組，利用LAMP技術(shù)擴(kuò)增靶基因的特定區(qū)域，從分子水平上實(shí)現(xiàn)單增李斯特菌的快速檢測(cè)，為單增李斯特菌檢測(cè)提供了有效且快速的核酸篩查檢測(cè)方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種單增李斯特菌的LAMP檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的LAMP引物組，包括一對(duì)外引物、一對(duì)內(nèi)引物和一對(duì)環(huán)引物，其核苷酸序列分別如下所示：

hlyA-F3:CGCAATCAGTGAAGGGAA

hlyA-B3:GTAAGTCTCCGAGGTTGC

hlyA-FIP: GCCGTATGCCACACTTGAGAAACCTACAAGACCTTCCAGA

hlyA-BIP: TTGATGCTGCCGTAAGTGGACGGCTTTGAAGGAAGAATT

hlyA-LF:GCGCTTGCAACTGCTCTT

hlyA-LB:AATCTGTCTCAGGTGATGTAGA。

一種LAMP檢測(cè)試劑盒，包括以下物質(zhì)：（1）DNA聚合酶；（2）2×反應(yīng)緩沖液；（3）熒光染料；（4）密封液；（5）標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板；（6）陰性對(duì)照；（7）上述的LAMP引物組。

在上述的LAMP檢測(cè)試劑盒中，所述LAMP引物組的濃度比例如下：外引物、內(nèi)引物、環(huán)引物的摩爾比為：1-2：4-8：2-4。

在上述的LAMP檢測(cè)試劑盒中，所述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶。

在上述的LAMP檢測(cè)試劑盒中，所述2×反應(yīng)緩沖液包含buffer緩沖液、甜菜堿和dNTPs，三者體積比為10：8：7。

在上述的LAMP檢測(cè)試劑盒中，所述熒光染料為濃度是0.02mM的SYTO-9。

在上述的LAMP檢測(cè)試劑盒中，所述密封液為礦物油。

在上述的LAMP檢測(cè)試劑盒中，所述的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板為單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA；所述陰性對(duì)照為滅菌超純水。

使用上述LAMP試劑盒檢測(cè)單增李斯特菌的方法，包括以下步驟：

（1）待檢樣品的提取：采用水煮法從待檢樣品中提取DNA；

（2）恒溫基因擴(kuò)增檢測(cè)反應(yīng)體系及條件：25μl反應(yīng)體系含有：SAnuc-F3 0.2μM，SAnuc-B3 0.2μM，SAnuc-FIP 0.8μM，SAnuc-BIP 0.8μM，SAnuc-LF 0.4μM，SAnuc-LB 0.4μM，2×反應(yīng)液12.5μl，DNA聚合酶8U，SYTO-9 0.5μl，待檢樣品2μl，用超純水補(bǔ)齊至25μl；密封液加入體積為20μl；同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照；將配置好的PCR管混勻后離心，63℃反應(yīng)45～60min，并在80℃持續(xù)2min；

（3）檢測(cè)結(jié)果判斷：將上述反應(yīng)管置于熒光PCR儀（如ABI stepone、ZYD-S1）中，根據(jù)擴(kuò)增曲線判斷檢測(cè)結(jié)果；如出現(xiàn)“S”形擴(kuò)增曲線，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，即檢測(cè)樣品中含有單增李斯特菌；如無(wú)“S”形擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，檢測(cè)結(jié)果為陰性，即檢測(cè)樣品不含有單增李斯特菌。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

（1）本發(fā)明采用的LAMP引物組在常規(guī)的LAMP檢測(cè)4條引物的基礎(chǔ)上增加了2條環(huán)引物，加快了擴(kuò)增速度，并提高擴(kuò)增效率。

（2）本發(fā)明采用STO-9染料作為熒光指示劑，可在配制反應(yīng)體系中添加，避免了反應(yīng)后打開(kāi)蓋子添加造成的氣溶膠污染風(fēng)險(xiǎn)，并減少了反應(yīng)步驟。

（3）本發(fā)明結(jié)果判斷簡(jiǎn)單，可通過(guò)觀察擴(kuò)增曲線判斷檢測(cè)樣品陰陽(yáng)性，無(wú)需電泳等其他任何分析步驟，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

附圖說(shuō)明：

圖1為L(zhǎng)AMP靈敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖；其中，從左至右依次為濃度1ng/μl、100pg/μl和10 pg/μl單增李斯特菌基因組DNA模板LAMP反應(yīng)結(jié)果。

圖2為L(zhǎng)AMP特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖；

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)的說(shuō)明，但不應(yīng)該當(dāng)作對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1：一種單增李斯特菌的LAMP引物的設(shè)計(jì)合成和檢測(cè)試劑盒的建立

（1）LAMP引物的設(shè)計(jì)合成

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，以單增李斯特菌hlyA基因作為靶基因，采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer 4.0設(shè)計(jì)包括環(huán)引物在內(nèi)的6條LAMP引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，6條引物序列如下：

SEQ NO.1：hlyA-F3:CGCAATCAGTGAAGGGAA

SEQ NO.2：hlyA-B3:GTAAGTCTCCGAGGTTGC

SEQ NO.3：hlyA-FIP: GCCGTATGCCACACTTGAGAAACCTACAAGACCTTCCAGA

SEQ NO.4：hlyA-BIP: TTGATGCTGCCGTAAGTGGACGGCTTTGAAGGAAGAATT

SEQ NO.5：hlyA-LF:GCGCTTGCAACTGCTCTT

SEQ NO.6：hlyA-LB:AATCTGTCTCAGGTGATGTAGA

（2）阪崎腸桿菌LAMP檢測(cè)試劑盒除包括上述LAMP引物組外，還包括DNA聚合酶、2×反應(yīng)液、熒光染料、密封液、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。其中反應(yīng)液包含buffer緩沖液、甜菜堿和dNTPs，各成分體積比為10：8：7。

（3）檢測(cè)方法：

1）待檢樣品的提?。翰捎盟蠓?，將樣品稀釋液煮沸，上清液作為擴(kuò)增反應(yīng)DNA模板。

2）恒溫基因擴(kuò)增檢測(cè)反應(yīng)體系及條件：25μl反應(yīng)體系含有：hlyA-F3 0.2μM，hlyA-B3 0.2μM，hlyA-FIP 0.8μM，hlyA-BIP 0.8μM，hlyA-LF 0.4μM，hlyA-LB 0.4μM，2×反應(yīng)液12.5μl，DNA聚合酶8U，SYTO-9 0.5μl，待檢樣品2μl，用超純水補(bǔ)齊至25μl。密封液加入體積為20μl。同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。

將配置好的PCR管混勻后離心，63℃反應(yīng)45～60min，并在80℃持續(xù)2min。

3）檢測(cè)結(jié)果判斷：將上述反應(yīng)管置于熒光PCR儀（如ABI stepone、ZYD-S1）中，根據(jù)擴(kuò)增曲線來(lái)判斷檢測(cè)結(jié)果。擴(kuò)增曲線呈“S”形，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，即檢測(cè)樣品中含有單增李斯特菌；無(wú)“S”形擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，檢測(cè)結(jié)果為陰性，即檢測(cè)樣品不含有單增李斯特菌。

實(shí)施例2： LAMP靈敏度實(shí)驗(yàn)

將單增李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯，36℃±1℃培養(yǎng)18小時(shí)。應(yīng)用Magen細(xì)菌基因DNA提取試劑盒提取培養(yǎng)產(chǎn)物中的細(xì)菌DNA。將單增李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株抽提的DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別以1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl五個(gè)梯度濃度DNA作為模板和陰性對(duì)照（滅菌超純水）按照實(shí)施例1的反應(yīng)體系和條件建立檢測(cè)方法，以確定試劑盒檢測(cè)方法的靈敏性。

參見(jiàn)圖1，結(jié)果表明：將單增李斯特氏菌基因組DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋后，建立的單增李斯特氏菌LAMP檢測(cè)試劑盒可檢測(cè)樣品中10pg/μl的單增李斯特氏菌DNA。

實(shí)施例3: LAMP特異性實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用實(shí)施例1的LAMP檢測(cè)試劑盒對(duì)金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、阪崎腸桿菌、福氏志賀氏菌、大腸埃希氏菌及副溶血性弧菌進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。設(shè)置單增李斯特菌DNA為陽(yáng)性對(duì)照，滅菌超純水為陰性對(duì)照。從圖2中可以看出，只有單增李斯特氏菌出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，其他菌株為陰性結(jié)果直至反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至60min。說(shuō)明實(shí)施例1的LAMP反應(yīng)體系只對(duì)單增李斯特氏菌有特異性。

SEQUENCE LISTING

<110> 中華人民共和國(guó)廣州機(jī)場(chǎng)出入境檢驗(yàn)檢疫局，暨南大學(xué)，廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司

<120> 一種單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的LAMP引物組及檢測(cè)試劑盒與使用方法

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列hlyA-F3

<400> 1

cgcaatcagt gaagggaa 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列hlyA-B3

<400> 2

gtaagtctcc gaggttgc 18

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列hlyA-FIP

<400> 3

gccgtatgcc acacttgaga aacctacaag accttccaga 40

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列hlyA-BIP

<400> 4

ttgatgctgc cgtaagtgga cggctttgaa ggaagaatt 39

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列hlyA-LF

<400> 5

gcgcttgcaa ctgctctt 18

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列hlyA-LB

<400> 6

aatctgtctc aggtgatgta ga 22