本發(fā)明屬于中藥材分子鑒別領(lǐng)域，具體涉及利用ISSR分子標(biāo)記方法對冬蟲夏草及其相似種進(jìn)行鑒別。

技術(shù)背景

冬蟲夏草[Cordyceps sinensis(Berk)Sacc]，鱗翅目蝙蝠蛾科蝠蛾屬幼蟲被中國被毛孢(Hirsutella sinensis)寄生后形成的蟲菌復(fù)合體，為國家二級保護(hù)瀕危物種，具有補(bǔ)肺益腎，止血，化痰的功效。因其極高的臨床藥用價值與滋補(bǔ)保健作用，冬蟲夏草日益受到人們的青睞，但由于其資源被過度采挖和氣候的變化，產(chǎn)量連年下滑，價格不斷攀升，不良商家為牟取暴利，使用冬蟲夏草相似品種的偽品，包括中國被毛孢菌絲體、蟲草花、蘭坪蟲草和古尼蟲草等替代和冒充冬蟲夏草，嚴(yán)重的擾亂了冬蟲夏草市場秩序，也給市場管理帶來了一定的挑戰(zhàn)。

市場上很多由冬蟲夏草粉碎后制成的冬蟲夏草膠囊和片劑產(chǎn)品很難通過傳統(tǒng)的外觀、顯微等常規(guī)手段被鑒別。加之冬蟲夏草中尚未發(fā)現(xiàn)特征性小分子成分，而常用的化學(xué)分析方法存在一定問題，如檢測不夠精確，對于含量較低的冬蟲夏草復(fù)方產(chǎn)品也很難鑒定，所需檢測的樣品量大，進(jìn)而對珍貴瀕危中藥造成一定浪費。而分子標(biāo)記技術(shù)具有靈敏度高、重復(fù)性好、所需檢測的樣品量少等優(yōu)點，現(xiàn)已被廣泛用于中藥原料的質(zhì)量檢測和鑒定。

目前，使用分子生物學(xué)方法對冬蟲夏草進(jìn)行鑒別的技術(shù)文獻(xiàn)較多，但都存在一定的局限性。如論文《冬蟲夏草與5種人工發(fā)酵菌絲體的DNA分子鑒別方法》公開了一種方法，利用ITS序列(5.8S rDNA和28S rDNA基因間隔序列)能夠?qū)Χx夏草和多種人工發(fā)酵蟲草菌絲粉進(jìn)行鑒別，但PCR擴(kuò)增之后需要對產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序，耗時較長。專利《一種冬蟲夏草分子身份證及鑒定方法》(申請?zhí)枺?01510117046.6)公開了一種分子身份證和方法可以準(zhǔn)確的將冬蟲夏草與形態(tài)特征相似的偽品區(qū)分開，同樣需要測序。專利《一種快速檢測冬蟲夏草的方法》(申請?zhí)枺?01610270920.4)公開了一種鑒別冬蟲夏草的方法，無需DNA測序，能夠鑒別冬蟲夏草、蛹蟲草、古尼蟲草、涼山蟲草和/或蟬花，但不能有效的鑒別中國被毛孢菌絲體，且公開實施例中冬蟲夏草樣品僅為四川一個產(chǎn)地樣品，對不同青海、西藏省份樣品適應(yīng)性不明確。論文《青海省冬蟲夏草的遺傳變異及親緣關(guān)系的形態(tài)性狀和ISSR分析》公開了一種ISSR分析標(biāo)記方法，提供了多條ISSR引物，該文獻(xiàn)從不同產(chǎn)地冬蟲夏草間的差異，實現(xiàn)區(qū)分不同產(chǎn)地的冬蟲夏草真品，但卻沒有提供與冬蟲夏草偽品區(qū)分的方法，即真品與偽品之間的差異與不同產(chǎn)地真品之間的差異的比較，無法用于分辨真?zhèn)纹贰?/p>

因此，研究真品冬蟲夏草之間的共同點，尋找可靠的引物，開發(fā)一種無需對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，同時便捷、靈敏、穩(wěn)定且實驗重復(fù)性好的分子鑒別方法來分辨真品冬蟲夏草和偽品冬蟲夏草成為一個重要的研究內(nèi)容。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)難題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種冬蟲夏草鑒別用ISSR-PCR引物，該引物不但可以用于冬蟲夏草的真?zhèn)舞b定，還可以用于中國被毛孢菌絲體、蟲草花、蘭坪蟲草及古尼蟲草的鑒定；同時提供了含有該引物的用于ISSR-PCR鑒定用的擴(kuò)增體系；結(jié)合使用該擴(kuò)增體系，本發(fā)明公開了一種基于ISSR-PCR技術(shù)的快速、準(zhǔn)確鑒定冬蟲夏草、中國被毛孢菌絲體、蟲草花、蘭坪蟲草及古尼蟲草的方法。

一方面，本發(fā)明提供了一種冬蟲夏草鑒別用ISSR-PCR引物，所述引物用于冬蟲夏草、中國被毛孢菌絲體、蟲草花、蘭坪蟲草和/或古尼蟲草的鑒別，其特征在于，所述引物的核苷酸序列表示如下：

SEQ ID NO.1：5’-AGAGAGAGAGAGAGGC-3’或

SEQ ID NO.2：5’-AGTGTGTGTGTGTGT-3’。

另一方面，本發(fā)明提供了一種冬蟲夏草鑒別用ISSR-PCR擴(kuò)增體系，其特征在于，所述ISSR-PCR擴(kuò)增體系包括如權(quán)利要求1所述的引物SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2。

在一些實施例中，本發(fā)明所述冬蟲夏草鑒別用ISSR-PCR擴(kuò)增體系本發(fā)明所述的引物SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2、rTaq酶、Mg²⁺、dNTPs、PCR緩沖液。

在一些實施例中，在本發(fā)明所述的ISSR-PCR擴(kuò)增體系中，其特征在于，所述rTaq酶為5U/μL、Mg²⁺為25mM、dNTPs為2.5mM、10倍的PCR緩沖液；引物SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2為10μM。

在一些實施例中，本發(fā)明所述的ISSR-PCR擴(kuò)增體系總體積為50μL，含有0.5μL的5U/μL rTaq酶、3.0μL的25mM Mg²⁺、2.0μL的2.5mM dNTPs、1.0μL的10μM引物SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2、2.0μL的10倍PCR緩沖液、0.2μL的25ng/L模板DNA、其余為水。

另一方面，本發(fā)明提供了一種冬蟲夏草ISSR鑒別方法，其特征在于包括如下步驟：

1)提取對照品基因組DNA；所述對照品為冬蟲夏草、中國被毛孢菌絲體、蟲草花、蘭坪蟲草或古尼蟲草；

2)利用本發(fā)明所述的ISSR-PCR擴(kuò)增體系對步驟1)中的對照品基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增；

3)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；

4)構(gòu)建ISSR分子標(biāo)記的圖譜；

5)按照步驟1)至3)相同條件處理供試品得到供試品電泳圖譜，比對供試品電泳圖譜與步驟4)構(gòu)建的ISSR分子標(biāo)記圖譜進(jìn)行鑒別。

在一些實施例中，本發(fā)明所述冬蟲夏草ISSR鑒別方法的步驟1)中所述提取對照品基因組DNA包括：分別稱取正品冬蟲夏草、中國被毛孢菌絲體、蟲草花、蘭坪蟲草和古尼蟲草這五種對照品0.2g，分別研磨至粉狀，然后用CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)提取緩沖液分別裂解，再加入飽和醋酸鈉溶液，混勻，冰浴，離心，取上清液與異丙醇混勻，靜置后離心，棄去上清液，用70％乙醇洗滌沉淀，進(jìn)行除鹽，自然晾干至乙醇完全揮發(fā)；最后加TE緩沖液溶解，即得5個對照品基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

在一些實施例中，本發(fā)明所述冬蟲夏草ISSR鑒別方法的步驟1)中所述提取對照品基因組DNA包括：分別稱取正品冬蟲夏草、中國被毛孢菌絲體、蟲草花、蘭坪蟲草和古尼蟲草這五種對照品0.2g，分別在預(yù)冷陶瓷研缽中加入液氮研磨至粉狀，然后迅速轉(zhuǎn)移樣品至離心管，加入3mL的65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液，65℃水浴裂解30-40min，中間每隔10min翻轉(zhuǎn)混勻1次；加入1/10體積預(yù)冷的飽和醋酸鈉溶液，混勻，冰浴5min，4℃下12000rpm離心5min；取上清液與等體積異丙醇混勻，靜置60s，4℃下12000rpm離心5min；棄去上清液，用預(yù)冷的70％乙醇洗滌沉淀，進(jìn)行除鹽，自然晾干至乙醇完全揮發(fā)；最后加入100-300μL的TE緩沖液溶解，即得5個對照品品基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

在一些實施例中，本發(fā)明所述冬蟲夏草ISSR鑒別方法步驟1)中所述CTAB提取緩沖液組成成分包含2％體積重量比例的CTAB、1.4M NaCl、20mM EDTA(乙二胺四乙酸)、100mM pH＝8.0的Tric-HCl、2％巰基乙醇。

在一些實施例中，本發(fā)明所述冬蟲夏草ISSR鑒別方法步驟2)中所述擴(kuò)增程序為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，48.2℃退火1min，72℃延伸2min，擴(kuò)增35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。

在一些實施例中，本發(fā)明所述冬蟲夏草ISSR鑒別方法步驟3)瓊脂糖凝膠電泳條件為：擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.6％瓊脂糖凝膠電泳，使用GelRed核酸染料，電壓為5V/cm，時間為1h。

另一方面，本發(fā)明提供了一種本發(fā)明所述冬蟲夏草ISSR鑒別方法的應(yīng)用，其用于鑒定冬蟲夏草復(fù)方產(chǎn)品中是否含有正品冬蟲夏草。

本發(fā)明的優(yōu)益之處在于：

(1)本發(fā)明成功構(gòu)建的冬蟲夏草分子標(biāo)記圖譜與其他分子生物學(xué)鑒定方法相比較，更具有操作快捷、重復(fù)性、穩(wěn)定性、特異性好的優(yōu)點，不需要經(jīng)過測序，節(jié)約經(jīng)濟(jì)與時間成本。

(2)本發(fā)明構(gòu)建的ISSR分子標(biāo)記圖譜具有多態(tài)性高、基因分型能力強(qiáng)、穩(wěn)定性好的特征，對不同產(chǎn)地冬蟲夏草真品都有較好的適應(yīng)性，同時對包括中國被毛孢菌絲體在內(nèi)的多個相似種偽品有較好的差異性。

(3)本發(fā)明能夠準(zhǔn)確鑒別冬蟲夏草復(fù)方片劑和膠囊產(chǎn)品中是否真正含有正品冬蟲夏草，即使含有少量的冬蟲夏草也能很靈敏的檢測。

附圖說明：

圖1所示是正品冬蟲夏草與4種偽品以引物SEQ ID NO.1進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳的顯影圖，其中泳道1為青海冬蟲夏草、泳道2為中華被毛孢菌絲體、泳道3為蟲草花、泳道4為蘭坪蟲草、泳道5為古尼蟲草，泳道M為100bp DNA Marker。

圖2所示是不同產(chǎn)地冬蟲夏草樣品以引物SEQ ID NO.1進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳的顯影圖，其中泳道1為青海冬蟲夏草、泳道2為西藏冬蟲夏草、泳道3為四川冬蟲夏草、泳道M為100bp DNA Marker。

圖3所示是正品冬蟲夏草與4種偽品以引物SEQ ID NO.2進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳的顯影圖，其中泳道1為青海冬蟲夏草、泳道2為中華被毛孢菌絲體、泳道3為蟲草花、泳道4為蘭坪蟲草、泳道5為古尼蟲草，泳道M為100bp DNA Marker。

圖4所示是不同產(chǎn)地冬蟲夏草樣品以引物SEQ ID NO.2進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳的顯影圖，其中泳道1為青海冬蟲夏草、泳道2為西藏冬蟲夏草、泳道3為四川冬蟲夏草、泳道M為100bp DNA Marker。

圖5所示為構(gòu)建得到的冬蟲夏草及4種相似種偽品的ISSR分子標(biāo)記圖譜，其中，泳道1-5根據(jù)引物SEQ ID NO.1進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳描繪，分別為青海冬蟲夏草、中國被毛孢菌絲體、蟲草花、蘭坪蟲草、古尼蟲草；泳道6-10根據(jù)引物SEQ ID NO.2進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳描繪，分別為青海冬蟲夏草、中國被毛孢菌絲體、蟲草花、蘭坪蟲草、古尼蟲草；泳道M為100bp DNA Marker。

圖6所示是市售冬蟲夏草復(fù)方產(chǎn)品以引物SEQ ID NO.1進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳的顯影圖，其中泳道1為供試品、泳道M為100bp DNA Marker。

圖7所示是市售冬蟲夏草復(fù)方產(chǎn)品以引物SEQ ID NO.2進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳的顯影圖，其中泳道1為供試品、泳道M為100bp DNA Marker。

具體實施方式

實施例1

取正品冬蟲夏草、中國被毛孢菌絲體、蟲草花、古尼蟲草、蘭坪蟲草5個對照品，分別提取其基因組DNA，然后加入引物SEQ ID NO.1進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，最后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，具體操作步驟如下：

1)提取對照品基因組DNA：

分別稱取正品冬蟲夏草、中國被毛孢菌絲體、蟲草花、蘭坪蟲草和古尼蟲草這五種對照品0.2g，分別在預(yù)冷陶瓷研缽中加入液氮研磨至粉狀，然后迅速轉(zhuǎn)移樣品至離心管，加入3mL在65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液，65℃水浴裂解30-40min，中間每隔10min翻轉(zhuǎn)混勻1次；加入1/10體積預(yù)冷的飽和醋酸鈉溶液，混勻，冰浴5min，4℃下12000rpm離心5min；取上清液與等體積異丙醇混勻，靜置60s，4℃下12000rpm離心5min；棄去上清液，用預(yù)冷的70％乙醇洗滌沉淀，除鹽，自然晾干至乙醇完全揮發(fā)；最后加入100-300μL TE緩沖液溶解，即得5個對照品基因組DNA；

上述CTAB提取緩沖液組成成分包含2％體積重量比例的CTAB、1.4M NaCl、20mM EDTA、100mM pH＝8.0的Tric-HCl、2％巰基乙醇。

2)進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)：

分別以步驟1)中5個對照品基因組DNA為模板，再加入引物SEQ ID NO.1、rTaq酶、Mg2+、dNTPs、PCR緩沖液在PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增；

其中50μL供試樣品ISSR-PCR擴(kuò)增體系的組成為：5U/μL rTaq酶0.5μL、25mM Mg²⁺3.0μL、2.5mM dNTPs 2.0μL、10μM引物SEQ ID NO.1 1.0μL、10倍PCR buffer 2.0μL、25ng/L模板DNA 0.2μL、其余為水。

擴(kuò)增程序為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，48.2℃退火1min，72℃延伸2min，擴(kuò)增35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。

3)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳：

將步驟2)中擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測，電泳條件為：擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.6％瓊脂糖凝膠電泳，使用GelRed核酸染料，電壓為5V/cm，時間為1h。用凝膠成像儀記錄擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果如圖1。

由圖1可知，通過引物SEQ ID NO.1擴(kuò)增獲得的冬蟲夏草與4種偽品(中國被毛孢菌絲體、蟲草花、尼古蟲草、蘭坪蟲草)的PCR分子圖譜有明顯不同，可以有效進(jìn)行鑒別。

實施例2

采集來自于青海、西藏、四川3個不同產(chǎn)地的野生冬蟲夏草，分別提取其基因組DNA，然后加入引物SEQ ID NO.1進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，最后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，具體操作步驟同實施例1。用凝膠成像儀記錄擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果如圖2。

由圖2可知，通過引物SEQ ID NO.1擴(kuò)增獲得的三個不同省份的冬蟲夏草樣品分子圖譜基本一致，表明該引物和方法對不同產(chǎn)地冬蟲夏草有很好的適應(yīng)性。

實施例3

取正品冬蟲夏草、中國被毛孢菌絲體、蟲草花、古尼蟲草、蘭坪蟲草5個對照品，分別提取其基因組DNA，然后加入引物SEQ ID NO.2進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，最后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。除引物SEQ ID NO.1換成SEQ ID NO.2，其他具體操作步驟同實施例1。用凝膠成像儀記錄擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果如圖3。

由圖3可知，通過引物SEQ ID NO.2擴(kuò)增獲得的冬蟲夏草與4種偽品(中國被毛孢菌絲體、蟲草花、尼古蟲草、蘭坪蟲草)的PCR分子圖譜有明顯不同，可以有效進(jìn)行鑒別。

實施例4

采集來自于青海、西藏、四川3個不同產(chǎn)地的野生冬蟲夏草，分別提取其基因組DNA，然后加入引物SEQ ID NO.2進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，最后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。除引物SEQ ID NO.1換成SEQ ID NO.2，具體操作步驟同實施例1。用凝膠成像儀記錄擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果如圖4。

由圖4可知，通過引物SEQ ID NO.2擴(kuò)增獲得的三個不同省份的冬蟲夏草樣品分子圖譜基本一致，表明該引物和方法對不同產(chǎn)地冬蟲夏草有很好的適應(yīng)性。

根據(jù)以上實施例1-4構(gòu)建ISSR-PCR分子標(biāo)記圖譜

根據(jù)實施例1和實施例3結(jié)果呈現(xiàn)的凝膠電泳條帶建立圖譜，采用軟件Bandscan，擴(kuò)增條帶的有無以總亮度值作為選擇依據(jù)，選取擴(kuò)增條帶亮度值≥0.2的條帶記錄為特征條帶，有擴(kuò)增帶的用“▁”表示，沒有擴(kuò)增帶的不做標(biāo)記，構(gòu)建正品冬蟲夏草、中國被毛孢菌絲體、蟲草花、蘭坪蟲草、古尼蟲草5個樣品的分子標(biāo)記圖譜，如圖5所示。

實施例5

取市售冬蟲夏草復(fù)方膠囊產(chǎn)品，提取其基因組DNA，然后加入引物SEQ ID NO.1進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，最后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，具體操作步驟同實施例1。用凝膠成像儀記錄擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果如圖6。

將市售產(chǎn)品由引物SEQ ID NO.1擴(kuò)增獲得的凝膠電泳圖譜6與已構(gòu)建的分子標(biāo)記圖譜5進(jìn)行比對，其特征條帶與圖5中的冬蟲夏草特征條帶一致，表明該產(chǎn)品中含有正品冬蟲夏草。

實施例6

取市售冬蟲夏草復(fù)方膠囊產(chǎn)品，提取其基因組DNA，然后加入引物SEQ ID NO.2進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，最后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，具體操作步驟同實施例1。用凝膠成像儀記錄擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果如圖7。

將市售產(chǎn)品由引物SEQ ID NO.2擴(kuò)增獲得的凝膠電泳圖譜7與已構(gòu)建的分子標(biāo)記圖譜5進(jìn)行比對，其特征條帶與圖5中的冬蟲夏草特征條帶一致，表明該產(chǎn)品中含有正品冬蟲夏草。

需要注意的是，上述僅以優(yōu)選實施例對本發(fā)明進(jìn)行說明，并不能局限本發(fā)明的權(quán)利范圍，因此不脫離本發(fā)明思想的情況下，凡運用本發(fā)明說明書和附圖部分的內(nèi)容所進(jìn)行的等效變化，均理同包含在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)。