煙草根黑腐病菌的分子檢測引物及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物病蟲害檢疫領(lǐng)域，具體涉及一種煙草根黑腐病菌的分子檢測引物及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]煙草根黑腐病是世界性的病害，一旦發(fā)病就會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，在我國云南、貴州、湖北等主要產(chǎn)煙區(qū)發(fā)生較重，嚴(yán)重地塊發(fā)病率可達(dá)30%以上。山東、河南、安徽、吉林、福建等產(chǎn)煙區(qū)也有發(fā)生，近年有加重危害的趨勢(shì)。但是，煙草根黑腐病菌作為煙草常見的一種土傳真菌，目前對(duì)其檢測還未形成特異性和高靈敏性體系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種煙草根黑腐病菌的分子檢測引物及其檢測方法，設(shè)計(jì)了特異性和高靈敏性的檢測引物，建立了煙草根黑腐病菌的PCR檢測體系。
[0004]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
設(shè)計(jì)一種煙草根黑腐病菌的分子檢測引物，包括以下引物:
TB1419-F:GTGTTGGAGGACCCGCGTTTAGTB1419-R:AGTTGAGGGTTTTTCGGCATGTT。
[0005]設(shè)計(jì)一種煙草根黑腐病菌的分子檢測方法，包括以下步驟:
(O提取待檢測煙株、土壤或其混合材料中的總DNA ；
(2)以所述總DNA為模板用上述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用20μ?反應(yīng)體系，其中包括:0.2μ? 的 5u/^L rTaq 酶，各 0.4μ? 均為 10 μ mol/L 的 TB1419-F 和 TB1419-R 引物，?μ? 的總DNA, 1.5μ? 的 2.5mmol/L dNTP，1.Ομ? 的 2.5mmol/L MgCl2溶液，2μ? 的 10XPCR Buffer，余量為ddH20 ;PCR擴(kuò)增程序:95°C預(yù)變性4min，35個(gè)循環(huán)的95°C變性30 s、59°C退火50 s和72°C延伸30 S，最后在72°C延伸5 min ；
(3)取所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，如在131bp處出現(xiàn)特異條帶，說明待檢測材料帶有煙草根黑腐病菌，反之則不攜帶。
[0006]根據(jù)上述的分子檢測方法，所述總DNA濃度不小于100fg/>L。
[0007]本發(fā)明的積極有益效果:
本發(fā)明在綜合考量DNA序列的保守區(qū)、是否形成二級(jí)結(jié)構(gòu)、G+C含量、堿基隨機(jī)分布、長度等眾多因素的基礎(chǔ)之上，并經(jīng)過必要的修飾及大量的試驗(yàn)驗(yàn)證，最終設(shè)計(jì)并篩選出了特異性和高靈敏性(達(dá)lOOfg/μυ的檢測引物，建立了特異性和高靈敏度的PCR檢測體系，通過檢測煙株病殘?bào)w和土壤的基因組序列，完成了煙草根黑腐病菌的快速準(zhǔn)確超低濃度鑒定，并進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同耕作栽培條件下病害風(fēng)險(xiǎn)的精確預(yù)警性監(jiān)測，顯著提高了煙草根黑腐病害的防治水平，滿足煙葉生產(chǎn)上的迫切需求。
【附圖說明】
[0008]圖1本發(fā)明引物的特異性鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖中M DL2000 DNA Marker，I煙草根黑腐病菌，2煙草黑脛病菌，3鐮刀菌，4煙草赤星病菌，5煙草灰霉菌，6煙葉，7煙草角斑病菌，8煙草蛙眼病菌。
[0009]圖2本發(fā)明引物的靈敏性鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖中M DL2000 DNA Marker，CK ddH20空白對(duì)照，9-16分別為基因組DNA濃度(104ng/μυ 的 I 倍、1'1'1'1'1'1'Kr7倍。
【具體實(shí)施方式】
[0010]以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0011]實(shí)施例1
一種煙草根黑腐病菌的分子檢測引物，引物對(duì)如下:
TB1419-F:GTGTTGGAGGACCCGCGTTTAGTB1419-R:AGTTGAGGGTTTTTCGGCATGTT。
[0012]實(shí)施例2
一種煙葉中煙草根黑腐病菌的分子檢測方法，包括以下步驟:
Cl)提取待檢測煙株煙葉部分的基因組DNA:
O用無水乙醇先把研缽、研杵、鑷子灼燒滅菌，冷卻至室溫，向研缽中加入液氮對(duì)研缽和研杵進(jìn)行預(yù)冷，將裝有煙葉的離心管放進(jìn)液氮瓶中進(jìn)行預(yù)冷，當(dāng)研缽表面結(jié)出白霜即可用來研磨；
2)將離心管中的煙葉倒入研缽，向研缽中加入適量液氮快速、用力研磨，研磨過程中要不斷添加液氮，研磨三次，研磨成均勻粉末狀態(tài)后分裝至1.5 mL離心管；
3)加入800μ?SLS提取液輕微晃動(dòng)5min，加800μ?酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)搖動(dòng)5min，室溫 12000rpm 離心 1min ；
4)將上清移入新的無菌的1.5mL離心管中，加等體積異丙醇輕微搖晃2min，20°C靜置2min ；
5)再離心10分鐘，棄上清，用lmL75%乙醇洗滌一次，12000rpm離心lOmin，棄上清；
6)室溫放置5?1min晾干，加入ddH2050μ?充分溶解；
7)用Nanodrop1000核酸測定儀測定DNA濃度，為100ng/>L ；
(2)以所述基因組DNA為模板用所述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用20μ?反應(yīng)體系，其中包括:0.2μ? 的 5u/^L rTaq 酶，各 0.4μ? 均為 10Mmol/L 的 TB1419-F 和 TB1419-R 引物，I PL 的總 DNA, 1.5μ? 的 2.5mmol/L dNTP, 1.Ομ? 的 2.5mmol/L MgCl2溶液，2μ? 的 10XPCR Buffer,余量為ddH20 ；PCR擴(kuò)增程序:95°C預(yù)變性4min，35個(gè)循環(huán)的95°C變性30 s、59°C退火50 s和72°C延伸30 S，最后在72°C延伸5 min ；
(3)取所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在131bp處出現(xiàn)特異條帶，說明待檢測材料帶有煙草根黑腐病菌。
[0013]本發(fā)明檢測方法的特異性鑒定試驗(yàn):
(O分別以煙草根黑腐病菌的基因組DNA 100ng/>L，以及同濃度的煙草黑脛病菌、煙草赤星病菌、煙草灰霉病菌、煙草蛙眼病菌、煙葉、煙草灰斑病菌和鐮刀菌的基因組DNA為模板用所述引物對(duì)TB1419-F和TB1419-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用20 μ L反應(yīng)體系，其中包括:0.2μ? 的 5u/^L rTaq 酶，各 0.4μ? 均為 10Mmol/L 的 TB1419-F 和 TB1419-R 引物，?μ? 的總DNA, 1.5μ? 的 2.5mmol/L dNTP, 1.Ομ? 的 2.5mmol/L MgCl2溶液，2μ? 的 10XPCR Buffer，余量為ddH20 ;PCR擴(kuò)增程序:95°C預(yù)變性4min，35個(gè)循環(huán)的95°C變性30 s、59°C退火50 s和72°C延伸30 S，最后在72°C延伸5 min ；
(2)分別取所得8組PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，只有煙草根黑腐病菌在131bp處出現(xiàn)特異條帶，見圖1，表明本發(fā)明檢測方法的特異性較強(qiáng)。
[0014]本發(fā)明方法的靈敏性鑒定試驗(yàn):
Cl)分別以煙草根黑腐病菌的基因組DNA 100ng/>L，及將其稀釋10'10_2、10'10_4、ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—7倍的基因組DNA溶液為模板用所述引物對(duì)TB1419-F和TB1419-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用20μ?反應(yīng)體系，其中包括:0.2μ?的5u/^L rTaq酶，各0.4μ?均為10Mmol/L的TB1419-F 和 TB1419-R 引物，1.5μ? 的 2.5mmol/L dNTP, 1.Ομ? 的 2.5mmol/L MgCl2溶液，2μ?的10XPCR Buffer，余量為ddH20 ;PCR擴(kuò)增程序:95°C預(yù)變性4min，35個(gè)循環(huán)的95°C變性30 s、59°C退火50 s和72°C延伸30 S，最后在72°C延伸5 min ；
(2)分別取所得8組PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，見圖2，100ng/^L~稀釋10_6倍溶液在131bp處均出現(xiàn)明顯的特異條帶，表明:本發(fā)明方法可檢測出lOOfg/^L的待檢測DNA濃度，靈敏度高。
[0015]本發(fā)明涉及在菌株、土壤或其混合材料中提取總DNA的方法均為常規(guī)技術(shù)，在此不再贅述。
[0016]本實(shí)施例所用煙草黑脛病菌、根黑腐病菌菌株由河南科技大學(xué)提供，為2012?2013年從河南的洛陽、南陽、鄭州等河南主要的產(chǎn)煙區(qū)采集；煙草赤星病菌株、煙草蛙眼病菌株、煙草灰霉病菌株由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院微生物資源保藏室饋贈(zèng)，鐮刀菌菌株由河南省農(nóng)科院饋贈(zèng)，煙葉為實(shí)驗(yàn)室種植所得。土樣采自洛陽宜陽煙田。
[0017]本發(fā)明并不局限于上述【具體實(shí)施方式】，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可據(jù)此做出多種變化，但任何與本發(fā)明等同或者類似的變化都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種煙草根黑腐病菌的分子檢測引物，其特征在于，包括以下引物對(duì):TB1419-F:GTGTTGGAGGACCCGCGTTTAGTB1419-R:AGTTGAGGGTTTTTCGGCATGTT。
2.—種煙草根黑腐病菌的分子檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: (O提取待檢測煙株、土壤或其混合材料中的總DNA ； (2)以所述總DNA為模板用權(quán)利要求1所述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用20μ?反應(yīng)體系，其中包括:0.2μ? 的 5?/μ? rTaq 酶，各 0.4μ? 均為 10Mmol/L 的 TB1419-F 和 TB1419-R 引物，Iμ? 的總 DNA，1.5μ? 的 2.5mmol/L dNTP，1.Ομ? 的 2.5mmol/L MgCl2溶液，2μ? 的 10XPCRBuffer，余量為ddH20 ;PCR擴(kuò)增程序:95°C預(yù)變性4min，35個(gè)循環(huán)的95°C變性30s、59°C退火50s和72°C延伸30s，最后在72°C延伸5min ； (3)取所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，如在131bp處出現(xiàn)特異條帶，說明待檢測材料帶有煙草根黑腐病菌，反之則不攜帶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分子檢測方法，其特征在于:所述總DNA濃度不小于10fg/μι。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種煙草根黑腐病菌的分子檢測引物及其檢測方法。所述檢測引物包括：TB1419-F：GTGTTGGAGGACCCGCGTTTAG，TB1419-R：AGTTGAGGGTTTTTCGGCATGTT；所述檢測方法包括在一定條件下進(jìn)行的提取總DNA、PCR擴(kuò)增和凝膠電泳等步驟。本發(fā)明提供了特異性和高靈敏性的檢測引物，建立了特異性和高靈敏度的PCR檢測體系，通過檢測煙株病殘?bào)w和土壤的基因組序列，完成了煙草根黑腐病菌的快速準(zhǔn)確超低濃度鑒定。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-04, C12Q1-68, C12R1-77
【公開號(hào)】CN104726556
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510062876
【發(fā)明人】邢國珍, 封松利, 鄭文明, 申一林, 宋鵬宇, 王海濤, 蔣士君, 李淑君
【申請(qǐng)人】河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年6月24日
【申請(qǐng)日】2015年2月6日