本發(fā)明屬于微生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種用于現(xiàn)場快速無創(chuàng)檢測呼吸道以及空氣病原微生物的方法,主要利用快速升降溫模塊實現(xiàn)空氣或呼吸道樣品中致病菌的DNA釋放提取,然后通過恒溫擴增的方法實現(xiàn)現(xiàn)場病原體快速檢測。
背景技術(shù)：
通過空氣傳播的疾病成為人類的一大隱形殺手，呼吸系統(tǒng)感染每年造成幾百萬人的死亡，但其感染原因不明朗，且臨床上缺乏快速診斷技術(shù)，無法保證患者得到及時有效的治療。而通過呼吸暴露，機會致病菌可能乘虛而入，改變?nèi)梭w呼吸道存在的多種共生益生菌的含量，破壞呼吸道細菌微生態(tài)結(jié)構(gòu)，引發(fā)更多的呼吸系統(tǒng)感染。研究表明，細菌感染和病毒感染都可能導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)感染，兩者還存在并發(fā)感染；同時，真菌的定植又會加重呼吸道炎癥與過敏反應(yīng)。因此，吸道感染致病原復(fù)雜，感染的準確分型難以實現(xiàn)。醫(yī)生大多根據(jù)臨床經(jīng)驗利用血常規(guī)檢測得到的白細胞水平和臨床癥狀如頭痛、咳嗽、關(guān)節(jié)疼痛等癥狀對感染類型進行判別，然而這種診斷方法缺乏充足的科學(xué)依據(jù)，無法使患者得到準確及時的診療。而且，僅僅根據(jù)白細胞水平的增高將患者確診為細菌性感染會導(dǎo)致抗生素的濫用，進而不僅造成經(jīng)濟損失，還會造成微生物抗藥性增強，同時也會抑制其他益生菌，導(dǎo)致人體更容易感染其它疾病。
臨床上常用的致病原檢測方法有膠體金法，可快速檢測甲、乙型流感，30分鐘內(nèi)可檢測病毒是否陽性，耗時短，但是假陽性和假陰性率高，在臨床上的實用價值低。此外，在特殊情況下，實驗室還采用RT-qPCR以及基于PCR技術(shù)的高通量測序技術(shù)檢測致病菌，或直接檢測細胞因子和血清降鈣素原來標志細菌感染和病毒感染，但這幾種方法都存在耗時長、成本高等問題，難以在臨床上得以應(yīng)用。
綜上，針對臨床呼吸系統(tǒng)感染的病人，其致病菌的快速檢測顯得尤為重要，在發(fā)生大規(guī)模傳染病時，現(xiàn)場快速檢測的需求也頗為迫切。近年來，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LMAP)日益被用于細菌、病毒的檢測。本發(fā)明主要結(jié)合樣本采集、LAMP以及樣品細菌DNA的快速提取，針對空氣以及呼吸道樣品中的致病菌進行快速檢測。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種現(xiàn)場快速無創(chuàng)檢測空氣以及呼吸道病原微生物的方法，該方法可用于公共場所空氣以及臨床呼吸系統(tǒng)感染的病人的致病菌的快速檢測，直接采集空氣或者病人的咽拭子和呼出氣樣本，使用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)對樣本進行檢測，快速得到常見致病菌的種類，為臨床呼吸系統(tǒng)感染治療提供依據(jù)以及評估空氣的生物安全。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
一種現(xiàn)場快速檢測空氣或呼吸道病原微生物的方法，包括以下步驟：
1)采集空氣樣本或者待檢者的咽拭子樣本或呼出氣樣本；
2)利用快速反復(fù)升降溫的方法提取樣本的DNA；
3)使用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法對樣本DNA進行檢測，得到致病菌種類信息。
上述步驟1)中，采集待檢者的咽拭子樣本可以使用通用的細菌采樣管；采集待檢者的呼出氣樣本可以使用呼出氣采樣盒，例如發(fā)明名稱為“一種呼出氣采樣盒和采樣方法”的中國專利ZL.201110020115.3公開的呼出氣采樣盒，在3-5min內(nèi)采集上呼吸道感染病人的呼出氣樣本；
上述步驟1)中，采集空氣樣本可以使用市售的空氣采樣器，例如安德森(Andersen)采樣器，在傳統(tǒng)瓊脂培養(yǎng)基上盛放有一定量無菌水，在一定的采集流量下收集空氣一段時間，獲得所需空氣樣品。
上述步驟2)中，反復(fù)升降溫的具體參數(shù)可以是：90～99℃3min，20～25℃2min，重復(fù)兩次或三次。
上述步驟3)可以根據(jù)具體情況和常見致病菌，設(shè)計環(huán)介導(dǎo)等溫擴增體系，進行擴增反應(yīng)，得到檢測結(jié)果。
本發(fā)明的方法在樣本的采集方面，無論是對于無創(chuàng)的咽拭子或呼出氣樣本，還是對于空氣樣品，都非常簡便易得；反復(fù)升降溫法提取樣本DNA與環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)的結(jié)合，大大縮短了樣本的處理和檢測時間，1小時內(nèi)可得到檢測結(jié)果。本發(fā)明方法實現(xiàn)了空氣以及呼吸道樣品中致病菌的快速檢測，能夠方便快捷地為評估空氣的生物安全性和臨床呼吸系統(tǒng)感染治療提供依據(jù)。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例進一步闡述本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護范圍。
實施例1：對發(fā)熱門診呼吸道感染病人的致病菌檢測
1)使用生物通用細菌采樣管，采集上呼吸道感染病人的咽拭子樣本，將采樣拭子放入轉(zhuǎn)存液后震蕩15min，取50μL樣本待測；
2)使用呼出氣采樣盒采集呼出氣樣本，采集并收集至1.5mL離心管中，取50μL待測；
3)利用升降溫方法，提取上述咽拭子和呼出氣樣本的DNA，具體反應(yīng)參數(shù)為：99℃3min，20℃2min，重復(fù)兩次；
4)對于提取完成的樣本，使用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)的方法進行擴增反應(yīng)，檢測流感嗜血桿菌。反應(yīng)體系為25μL，包含2μL DNA模板，1.6μM的FIP和BIP，0.2μM的F3和B3，0.8μM的LF和LB，8U Bst酶，以及12.5μL的2×RM，使用ddH2O補齊體積。將混合體系至于濁度儀(LA-500，Kyoto,Japan)中，64℃反應(yīng)60min，最后80℃加熱滅活處理2min。
5)共計檢測咽拭子和呼出氣樣本46份，平均每個樣本前處理與檢測時間在60-90min之內(nèi)。流感嗜血桿菌陽性率為45.7％(21/46)，其中咽拭子樣本陽性率為59.3％(16/27)。表明該檢測方法體系可以實現(xiàn)對病原菌的快速檢測。
實施例2：對實驗室空氣中致病菌的檢測
1)在實驗室環(huán)境中，使用Andersen采樣器，在傳統(tǒng)瓊脂培養(yǎng)基上盛放有2mL無菌水，在采集流量為28.3L/min的情況下收集環(huán)境空氣10分鐘；
2)將上述2mL的水倒入試管中，獲得所需空氣樣品；
3)將上述空氣樣品離心濃縮至1mL；
4)取50μL上述空氣樣本，進行升降溫反應(yīng)，具體反應(yīng)參數(shù)為：99℃3min，20℃2min，重復(fù)兩次；
5)對提取的樣本，使用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)的方法進行擴增，反應(yīng)體系為25μL，包含2μL DNA模板，1.6μM的FIP和BIP，0.2μM的F3和B3，0.8μM的LF和LB，8U Bst酶，以及12.5μL的2×RM，使用ddH2O補齊體積。將混合體系至于濁度儀(LA-500，Kyoto,Japan)中，64℃反應(yīng)60min，最后80℃加熱滅活處理2min。
共計檢測空氣樣本10例，流感嗜血桿菌和銅綠假單胞菌均呈現(xiàn)陰性，反應(yīng)體系陽性對照正常。