本發(fā)明涉及一種促進甘薯黑斑病菌分生孢子穩(wěn)定萌發(fā)并獲得最佳觀察效果的方法，特別涉及一種利用甘薯葉片組織液促進特定培養(yǎng)條件下甘薯黑斑病菌的分生孢子穩(wěn)定萌發(fā)并獲得最佳觀察效果的方法。
背景技術：
：甘薯黑斑病是甘薯大田栽培期及儲藏期的主要病害，每年由于該病造成的產量損失一般為5％～10％，危害嚴重時可達20％～50％，甚至更高。同時，病薯還會產生甘薯黑斑霉酮(ipomeamarone)和甘薯黑斑霉二酮(ipomeanine)等有毒物質，人和家畜食用后可引起中毒，甚至死亡，因此甘薯黑斑病的防治成為甘薯病害防治的重點。甘薯黑斑病的防治主要是依賴于殺菌劑的使用，但是現有的殺菌劑存在藥劑品種單一、抗藥性風險增加的問題，因此篩選新的防治藥劑成為甘薯黑斑病的研究方向。篩選新的防治藥劑的關鍵步驟之一就是進行室內的藥效評價，即通常利用抑制病原真菌孢子萌發(fā)試驗(NY/T1156.1-2006)和抑制病原真菌菌絲生長試驗(NY/T1156.2-2006)來評價藥劑的保護和治療作用。由于甘薯黑斑病菌(Ceratocystisfimbriata)的分生孢子在水滴中萌發(fā)率極低，無法滿足“藥效評價標準”中分生孢子穩(wěn)定萌發(fā)90％以上的試驗要求，造成藥劑篩選工作無法進行。因此建立一種簡單、穩(wěn)定的提高甘薯黑斑病菌分生孢子萌發(fā)率的技術體系，是本領域亟待解決的技術問題，也是農藥生測和相關抗藥性研究的必要條件。目前關于如何保證侵染甘薯的黑斑病菌分生孢子萌發(fā)率在90％以上及保持穩(wěn)定萌發(fā)并獲得最佳觀察效果的方法國內外文獻均無報道。技術實現要素：為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種促進甘薯黑斑病菌分生孢子穩(wěn)定萌發(fā)并獲得最佳觀察效果的方法，該方法能夠使甘薯黑斑病菌分生孢子萌發(fā)率穩(wěn)定在90％以上，并確定了最佳觀察時間。為了實現上述目的，本發(fā)明所采用的技術方案是：一種促進甘薯黑斑病菌分生孢子穩(wěn)定萌發(fā)并獲得最佳觀察效果的方法，所述的方法是將甘薯黑斑病菌菌株接種在P+S培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7-21d，再制備分生孢子懸浮液；在分生孢子懸浮液中加入甘薯葉片組織液，繼續(xù)培養(yǎng)，直至分生孢子懸浮液中的甘薯黑斑病菌分生孢子萌發(fā)并獲得最佳觀察效果，進行鏡檢。所述的甘薯黑斑病菌菌株為甘薯長喙殼(Ceratocystisfimbriata)CFSC-01，保藏編號：CGMCCNo.3.18030，保藏日期：2016年9月26日；保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。所述的P+S培養(yǎng)基的制備方法為：將馬鈴薯、甘薯去皮切塊，稱取馬鈴薯塊20g、甘薯塊100g混合，加水煮爛，過濾，濾液中加入葡萄糖0.02g、瓊脂粉13g，再加水定容至1L。所述甘薯黑斑病菌株在P+S培養(yǎng)基上培養(yǎng)的條件為：24-26℃、黑暗條件下。所述制備分生孢子懸浮液的方法為：用無菌水沖洗培養(yǎng)基表面的菌體即得。所述的分生孢子懸浮液中分生孢子濃度為1×106個/ml。所述的甘薯葉片組織液的制備方法為：將1g甘薯葉片組織加2ml水研磨離心后，取上清液，加水定容至2ml，得到甘薯葉片組織液，-20℃避光保存；使用時，室溫溶解，使用后重新置于-20℃避光保存，甘薯葉片組織液的有效期從制備完成開始計，為3周。所述的甘薯葉片組織液的加入量為每1ml分生孢子懸浮液加入15-30μl甘薯葉片組織液。所述的繼續(xù)培養(yǎng)直至分生孢子懸浮液中的甘薯黑斑病菌分生孢子萌發(fā)并獲得最佳觀察效果的條件為：24-26℃、黑暗條件下，培養(yǎng)2.5-3h至分生孢子芽管長度為2-4個分生孢子長度。本發(fā)明的有益效果：1、本發(fā)明結合甘薯黑斑病菌的特性，通過反復的實驗論證，最終得到一種促進甘薯黑斑病菌分生孢子穩(wěn)定萌發(fā)的方法，該方法能夠使甘薯黑斑病菌分生孢子萌發(fā)率穩(wěn)定在90％以上，并確定了最佳觀察時間，滿足了殺菌劑藥劑篩選試驗的必要條件。2、本發(fā)明的方法能夠保證同一批培養(yǎng)的菌株，在7-21d的培養(yǎng)時間內任意時段制備的分生孢子懸浮液，均可達到90％以上的萌發(fā)率，滿足了使用同一批菌株在不同時間制備分生孢子懸浮液進行大量藥劑篩選的需求，提高了藥劑篩選的效率和準確性。3、本發(fā)明在分生孢子懸浮液中加入甘薯葉片組織液，能夠顯著提高甘薯黑斑病菌孢子萌發(fā)率，實驗證明，當甘薯葉片組織液的加入量達到每1ml分生孢子懸浮液加入15-30μl甘薯葉片組織液時，分生孢子懸浮液中分生孢子的萌發(fā)率穩(wěn)定在90％以上。4、本發(fā)明通過限定甘薯黑斑病菌的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，分生孢子萌發(fā)的培養(yǎng)條件，進一步保證了甘薯黑斑病菌的生長和分生孢子萌發(fā)的穩(wěn)定性。5、本發(fā)明明確了甘薯葉片組織液的保存條件和持效性，使整個操作進一步簡化高效。6、本發(fā)明方法簡單，可操作性強，為篩選防治甘薯黑斑病的殺菌劑提供了必要條件，為評估藥劑的抗藥性風險以及其他需要借助分生孢子萌發(fā)來完成的試驗順利進行提供了保證。附圖說明圖1為未加入甘薯葉片組織培養(yǎng)液的分生孢子懸浮液培養(yǎng)3h后的分生孢子萌發(fā)情況圖。圖2為加入甘薯葉片組織培養(yǎng)液(20μl/ml)的分生孢子懸浮液培養(yǎng)3h后的分生孢子萌發(fā)情況圖。具體實施方式以下結合實施例對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細說明。本發(fā)明實施例中所用到的甘薯新鮮葉片均采自甘薯品種商薯19。實施例1實驗材料的制備甘薯黑斑病菌株：甘薯長喙殼(Ceratocystisfimbriata)CFSC-01，分離自四川帶病薯塊，純化、鑒定后保存；保藏編號：CGMCCNo.3.18030，保藏日期：2016年9月26日；保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。P+S培養(yǎng)基：將馬鈴薯、甘薯去皮切塊，稱取馬鈴薯塊20g、甘薯塊100g混合，加水煮爛(此次的加水量不超過1L)，過濾，濾液中加入葡萄糖0.02g，瓊脂粉13g，再加水定容至1L。甘薯葉片組織液：將1g甘薯葉片組織加2ml水研磨離心后，取上清液，加水定容至2ml，得到甘薯葉片組織液，-20℃避光保存；使用時，室溫溶解，使用后重新置于-20℃避光保存。以下實施例中組織液為甘薯葉片組織液的簡稱。實施例2分生孢子在組織液刺激下萌發(fā)率和芽管長度與時間的關系挑取甘薯黑斑病菌菌株，接種在P+S培養(yǎng)基的中心部位，25℃、黑暗條件下培養(yǎng)，然后分別選取培養(yǎng)10d和16d的甘薯黑斑病菌菌株，用無菌水沖洗培養(yǎng)基表面的菌體，得到含有分生孢子的沖洗液，再用無菌水調整沖洗液中分生孢子濃度，顯微鏡鏡檢，最終配制成分生孢子濃度為1×106個/ml的分生孢子懸浮液。在兩種分生孢子懸浮液中分別加入甘薯葉片組織液，組織液的加入量均為每1ml分生孢子懸浮液加入20μl組織液。將加入組織液的分生孢子懸浮液在25℃、黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)1h、2h、2.5h、3h、4h，對不同培養(yǎng)時間的分生孢子懸浮液中分生孢子萌發(fā)的情況進行鏡檢，結果見表1。表1分生孢子在組織液刺激下萌發(fā)率和芽管長度與時間的關系根據表1的試驗結果，25℃黑暗培養(yǎng)1h后，兩種分生孢子懸浮液的分生孢子萌發(fā)率分別為：25.69％和13.71％，芽管長度可達到3/4個孢子長度。培養(yǎng)2h后，兩種懸浮液的分生孢子萌發(fā)率分別為：97.00％和97.06％，芽管長度可達到1.5個孢子長度。培養(yǎng)2h后的分生孢子萌發(fā)率基本不再增加，但芽管長度進一步伸長，2.5h后可達到2個孢子長度；3h后可達到3-4個孢子長度；4h后可達到5個孢子長度以上?？紤]到實際應用時，如果芽管長度太長，會相互交叉，不利于觀察計數，所以觀察孢子萌發(fā)情況的最佳時間應該在25℃、黑暗培養(yǎng)2.5-3小時。實施例3甘薯葉片組織液濃度與分生孢子萌發(fā)率的關系挑取甘薯黑斑病菌菌株，接種在P+S培養(yǎng)基的中心部位，25℃、黑暗條件下培養(yǎng)8d，然后用無菌水沖洗培養(yǎng)基表面的菌體，得到含有分生孢子的沖洗液，再用無菌水調整沖洗液中分生孢子濃度，顯微鏡鏡檢，最終配制成分生孢子濃度為1×106個/ml的分生孢子懸浮液。在分生孢子懸浮液中分別加入不同量的組織液，組織液的加入量為每1ml分生孢子懸浮液分別加入0、1、3、6、12、15、20、30μl組織液。將加入不同量組織液的分生孢子懸浮液在25℃、黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)3h，對加入不同量組織液的分生孢子懸浮液中分生孢子萌發(fā)的情況進行鏡檢(見圖1、2)。各重復調查分生孢子總數不少于200個，孢子芽管長度大于孢子的短半徑視為萌發(fā)，分別記錄萌發(fā)數和分生孢子總數。同時，采用方差分析方法(新復極差法)對分生孢子萌發(fā)結果進行分析，結果見表2。表2分生分生孢子懸浮液中甘薯組織液的不同濃度與孢子萌發(fā)結果加入量(μl/ml)013612152030萌發(fā)率(％)0.3831.8846.0570.6783.7093.7294.4393.90方差分析結果fedcbaaa注：相同字母表示無差異，不相同字母表示差異顯著。根據表2的試驗結果，當組織液的加入量達到每1ml分生孢子懸浮液加入15-30μl組織液時，分生孢子萌發(fā)率超過90％，組織液加入量分別為15、20、30μl/ml時，萌發(fā)率分別為：93.72％、94.43％、93.90％，三個處理的萌發(fā)率無顯著差異。實施例4保持分生孢子萌發(fā)活力的條件篩選挑取甘薯黑斑病菌菌株，接種在P+S培養(yǎng)基的中心部位，25℃、黑暗條件下培養(yǎng)8d，然后將同一批次接種的菌株分開放置，一部分繼續(xù)在25℃、黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)，另一部分轉移至4℃、黑暗條件下培養(yǎng)。分別取在25℃和4℃黑暗條件下放置不同時間的菌株制備分生孢子懸浮液，即用無菌水沖洗培養(yǎng)基表面的菌體，得到含有分生孢子的沖洗液，再用無菌水調整沖洗液中分生孢子濃度，顯微鏡鏡檢，最終配制成分生孢子濃度為1×106個/ml的分生孢子懸浮液。在分生孢子懸浮液中加入組織液，組織液的加入量為每1ml分生孢子懸浮液加入20μl組織液(另設不加入組織液的對照)，再在25℃、黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)3h，對分生孢子懸浮液中孢子萌發(fā)的情況進行鏡檢。各重復調查分生孢子總數不少于200個，孢子芽管長度大于孢子的短半徑視為萌發(fā)，分別記錄萌發(fā)數和分生孢子總數，對分生孢子萌發(fā)結果進行分析，結果見表3。表3不同培養(yǎng)條件下分生孢子的萌發(fā)率調查根據表3的試驗結果，始終在25℃黑暗條件下培養(yǎng)的菌株，其分生孢子萌發(fā)活性保持時間較長，從第8天開始鏡檢，90％以上的萌發(fā)率可以保持兩周。在4℃黑暗條件下培養(yǎng)的菌株分生孢子萌發(fā)活性顯著降低，所有批次的分生孢子萌發(fā)率均低于90％。因此，為保證分生孢子具備穩(wěn)定的萌發(fā)活力，制備分生孢子懸浮液的菌株應始終在25℃黑暗條件下培養(yǎng)，整個取樣期間從接種后的第8天起，不應超過兩周。實施例5甘薯葉片組織液的持效性檢測(與實施例4同時進行)在實施例4的實驗中，當發(fā)現始終在25℃、黑暗條件下培養(yǎng)的菌株，其分生孢子的萌發(fā)率在甘薯組織液的刺激下首次低于90％時(第14d)，開展葉片組織液的持效性檢測(從第15d開始)。在第15d當天制備新的葉片組織液，使用兩種制備時間不同的組織液同時進行實施例4的后續(xù)試驗(實施例4試驗開始當天制備的組織液稱為初次制備組織液，實施例4試驗進行至15d時制備的組織液稱為再次制備組織液)。比較兩種制備時間不同的組織液對分生孢子萌發(fā)率的影響，并采取t檢驗對兩組數據的差異顯著性進行分析。各重復調查分生孢子總數不少于200個，孢子芽管長度大于孢子的短半徑視為萌發(fā)，分別記錄萌發(fā)數和分生孢子總數，對分生孢子萌發(fā)結果進行分析，結果見表4。表4甘薯葉片組織液的持效性檢測結果根據表4的試驗結果，使用兩種不同時間制備的組織液，分別處理25℃、黑暗條件下培養(yǎng)的菌株制備的分生孢子懸浮液，兩組分生孢子萌發(fā)率數據的t檢驗P值為0.2283-0.8231，均大于0.05，故兩組數據間差異不顯著。4℃、黑暗條件下保存的菌株制備的分生孢子懸浮液，兩組分生孢子萌發(fā)率數據的t檢驗P值為0.0535-0.1452，均大于0.05，故兩組數據間差異不顯著。由上述結果可知，相同培養(yǎng)溫度下，兩種相同量組織液刺激下的分生孢子萌發(fā)率隨時間變化的趨勢一致，同一天的萌發(fā)率數據差異不顯著，表明萌發(fā)率的變化只與菌株培養(yǎng)的時間有關，與組織液制備的時間無關。在其它條件不變的情況下，分生孢子萌發(fā)率并沒有因為甘薯葉片組織液的制備日期不同而出現顯著差異，表明甘薯葉片組織液儲存在-20℃的條件下，具備一定的持效期，持效期至少為3周。當前第1頁1 2 3