本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)目標(biāo)核酸序列變異體的組合物和方法，本發(fā)明還涉及檢測(cè)目標(biāo)核酸變異體的試劑盒，廣泛應(yīng)用于核酸擴(kuò)增、基因變異體體外診斷、基因分型等領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

基因突變(gene mutation)是由于DNA分子中發(fā)生堿基對(duì)的增添、缺失或改變而引起的基因結(jié)構(gòu)的改變?；蛲蛔兎譃閮煞N，性細(xì)胞突變以及體細(xì)胞突變。性細(xì)胞突變是指發(fā)生在性細(xì)胞的突變，是可遺傳的突變類型。除性細(xì)胞外的體細(xì)胞發(fā)生的突變不會(huì)造成后代的遺傳改變，卻可以引起當(dāng)代某些細(xì)胞的遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。絕大部分體細(xì)胞突變無表型效應(yīng)。體細(xì)胞突變是一種稀有突變，體細(xì)胞突變存在于大量的野生型背景DNA序列中，相對(duì)于野生型背景序列的含量，體細(xì)胞突變含量很少。如腫瘤患者組織和外周血內(nèi)含有少量的腫瘤細(xì)胞DNA，初期出現(xiàn)的細(xì)菌和病毒耐藥情況等。體細(xì)胞突變常與疾病的發(fā)病相關(guān)，可以作為疾病發(fā)病的標(biāo)記物、預(yù)后判斷的主要標(biāo)志以及用藥指導(dǎo)的標(biāo)志物。因此，體細(xì)胞突變的檢測(cè)對(duì)于疾病的診療和預(yù)后評(píng)價(jià)具有重要的意義。

目前體細(xì)胞突變的檢測(cè)方法主要有DNA測(cè)序法、RFLP-PCR方法、PCR夾子方法(PCR clamping method)、探針擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(amplification refractory mutation system,ARMS)、數(shù)字PCR、競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性熒光探針PCR法(Competitive Allele-Specific Taqman PCR，CAST PCR)等，這些檢測(cè)方法均具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。

DNA測(cè)序法是進(jìn)行突變檢測(cè)的可靠方法，也是使用較多的方法。測(cè)序法對(duì)取材和技術(shù)要求比較高，最重要的是，由于測(cè)序方法本身的限制，靈敏度不高，只能對(duì)含量大于20％的目標(biāo)核酸序列突變型變異體進(jìn)行檢測(cè)。

RFLP-PCR方法通過在PCR反應(yīng)之前或是在PCR反應(yīng)的過程中使用限制性內(nèi)切酶，除去了與目標(biāo)核酸序列突變型變異體相似的野生型變異體，從而達(dá)到擴(kuò)增并富集目標(biāo)核酸片段的突變型變異體的目的?；诖朔椒ㄓ卸喾N變化，包括限制性酶切位點(diǎn)突變分析PCR(RSM-PCR)方法，通過在突變位點(diǎn)基于引物連接的擴(kuò)增(APRIL-ATM)方法等等。雖然這類方法具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單和成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，并且在一些特定的實(shí)驗(yàn)中具有較好的選擇性，但是它依賴于突變位點(diǎn)附近具有限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，在具體應(yīng)用中，這類方法的選擇性有限。

PCR夾子方法(PCR clamping method)通過抑制目標(biāo)核酸序列的野生型變異體的擴(kuò)增來達(dá)到選擇性擴(kuò)增待檢測(cè)目標(biāo)片段的目的。使用肽核酸(PNA)或使用鎖核酸(LNA)的方法分別在文獻(xiàn)[Henrik et al.,Nucleic Acid Research 21:5332-5336(1993)]和[Luo et al.,Nucleic Acid Research Vol.34,No 2e12(2006)]中公開。但是，由于目標(biāo)核酸序列的野生型變異體與突變型變異體只有1個(gè)或2個(gè)或3個(gè)堿基不同，肽核酸或鎖核酸也易與突變型變異體結(jié)合，從而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

數(shù)字PCR(digital PCR)通過稀釋模板和增加PCR反應(yīng)的數(shù)目來檢測(cè)少量目標(biāo)核酸序列突變型變異體[Vogelstein B,Kinzler KW.Digital PCR.Proc NatlAcad SciUSA1999；96:9236-41]。理論上，當(dāng)核酸模板稀釋到每個(gè)PCR反應(yīng)中僅有一個(gè)或沒有核酸模板時(shí)，這個(gè)PCR反應(yīng)中要么沒有擴(kuò)增，要么擴(kuò)增野生型模板或擴(kuò)增突變型模板。結(jié)合相應(yīng)的檢測(cè)方法即可以達(dá)到檢測(cè)少量突變型變異體的目標(biāo)。理論上，該方法通過增加PCR反應(yīng)的數(shù)量選擇性是無限的。但是在實(shí)際操作中，選擇性不僅受限于Taq DNA聚合酶的保真性限制，也受限于同時(shí)能進(jìn)行的PCR數(shù)目。雖然有報(bào)道基于數(shù)字PCR的方法具有高選擇性，如[Bielas JH,Loeb LA.Quantification of random genomic mutations.Nat Methods 2005；2:285-90]所公開的內(nèi)容。但該法通常需要專門的儀器并借助芯片技術(shù)，過程非常繁瑣復(fù)雜，成本較高。

探針擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(amplification refractory mutation system,ARMS),又名等位基因特異PCR(allele specific PCR,AS-PCR)，原理為：利用Taq DNA聚合酶缺少3’-5’外切酶活性，PCR引物的3’端末位堿基必須與其模板DNA互補(bǔ)才能有效擴(kuò)增的原理，針對(duì)不同的已知突變，設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)囊镆詸z測(cè)出突變基因。該方法的主要限制因素是，若突變的位點(diǎn)為弱錯(cuò)配堿基序列，ARMS引物不能有效區(qū)分目標(biāo)核酸序列的野生型變異體和突變型變異體，從而使該方法的選擇性受到影響。此外，在檢測(cè)常見的EGFR突變的14種缺失突變時(shí)，采用AS-PCR方法需要14條ARMS引物才可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)[US Premarket Approval Application number：150047(2016)]。

競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性熒光探針PCR法(Competitive Allele-Specific TaqMan PCR，CAST PCR)，其通過封閉探針阻礙野生型變異體的擴(kuò)增，同時(shí)運(yùn)用ARMS引物選擇性放大突變型變異體，兩者的結(jié)合使用在一定程度上降低了ARMS引物與野生型變異體錯(cuò)誤結(jié)合的幾率，但該技術(shù)使用非選擇性的公共探針，缺少對(duì)突變型變異體的有效選擇性檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種檢測(cè)目標(biāo)核酸序列變異體的方法，本發(fā)明所述檢測(cè)方法將具有特殊結(jié)構(gòu)的封閉探針與選擇性檢測(cè)探針一起使用，達(dá)到高選擇性檢測(cè)的目的，其對(duì)缺失突變、插入突變的檢測(cè)效果更顯著。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)目標(biāo)核酸序列變異體的檢測(cè)試劑盒，其對(duì)缺失突變、插入突變的檢測(cè)效果更顯著。

根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)目標(biāo)核酸序列變異體的組合物。所述組合物可以包括：(a)封閉探針，與所述目標(biāo)核酸序列的野生型變異體特異性結(jié)合，且其3’末端修飾有阻止其延伸的寡聚核苷酸；(b)檢測(cè)探針，與所述目標(biāo)核酸序列的突變型變異體特異性結(jié)合，并能產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)；(c)引物，與所述目標(biāo)核酸序列的野生型變異體和突變型變異體的共用引物。

本發(fā)明進(jìn)一步地，所述封閉探針3’末端通過非羥基基團(tuán)修飾阻止其延伸，所述非羥基基團(tuán)包括但不局限于磷酸化、氨基、脫氧、鹵代、C3 Spacer、C6 Spacer修飾。

本發(fā)明進(jìn)一步地，所述封閉探針含有核酸雙鏈穩(wěn)定因子。

本發(fā)明進(jìn)一步地，所述核酸雙鏈穩(wěn)定因子位于封閉探針5’端以外位置，包括但不限于堿基的修飾，堿基類似物的使用，核酸骨架的改變，糖基的修飾，優(yōu)先為鎖核酸(locked nucleic acids,LNA)、肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)。

本發(fā)明進(jìn)一步地，所述核酸雙鏈穩(wěn)定因子位于封閉探針5’端，為DNA小溝結(jié)合物/類似物(minor groove binder,MGB)中的一種或一種以上的組合。

本發(fā)明進(jìn)一步地，所述封閉探針5’末端含有抑制核酸酶水解的修飾因子。

本發(fā)明進(jìn)一步地，所述修飾因子包括堿基類似物、核酸骨架、脫氧核糖類似物、肽核酸或硫代磷酸酯。

本發(fā)明進(jìn)一步地，所述檢測(cè)探針5’末端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3’末標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。

進(jìn)一步地，所述熒光報(bào)告基團(tuán)選自FAM、TET、HEX、JOE、CY3、CY5、ROX或Texas Red；所述熒光淬滅基團(tuán)選自TAMRA、BHQ1、BHQ2或CY5。

本發(fā)明進(jìn)一步地，所述組合物還包括聚合酶，dNTP，和/或適合于PCR擴(kuò)增的其它試劑或緩沖劑。

本發(fā)明還提供一種檢測(cè)目標(biāo)核酸序列變異體的方法，該方法將待測(cè)核酸樣品與上述檢測(cè)目標(biāo)核酸序列變異體的組合物混合，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)通過檢測(cè)檢測(cè)探針的檢測(cè)信號(hào)的變化來檢測(cè)擴(kuò)增子，從而檢測(cè)待測(cè)核酸樣品中的目標(biāo)核酸的突變型變異體。

本發(fā)明進(jìn)一步地，還包括通過檢測(cè)探針的檢測(cè)信號(hào)的變化來定量突變型變異體。

本發(fā)明進(jìn)一步地，所述擴(kuò)增反應(yīng)包括但不限于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，所述等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)包括但不限于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)、依賴于核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)(NASBA)、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(RCA)、單引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(SPIA)、依賴于解旋酶的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(HAD)、鏈替代擴(kuò)增技術(shù)(SDA)、快速等溫檢測(cè)放大技術(shù)(RIDA)、切刻內(nèi)切酶核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(NEMA)。

本發(fā)明進(jìn)一步地，所述擴(kuò)增反應(yīng)是實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

本發(fā)明進(jìn)一步地，所述突變型變異體為點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變。

根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)目標(biāo)核酸序列變異體的檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括如下成分：封閉探針、檢測(cè)探針和引物；

所述封閉探針與所述目標(biāo)核酸序列的野生型變異體特異性結(jié)合，且其3’末端修飾有阻止其延伸的寡聚核苷酸；

所述檢測(cè)探針與所述目標(biāo)核酸序列的突變型變異體特異性結(jié)合，并能產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)；

所述引物為所述目標(biāo)核酸序列的野生型變異體和突變型變異體的共用引物。

本發(fā)明進(jìn)一步地，所述封閉探針3’末端進(jìn)行非羥基基團(tuán)修飾，包括但不局限于磷酸化、氨基、脫氧、鹵代、C3 Spacer、C6 Spacer修飾。

本發(fā)明進(jìn)一步地，所述封閉探針含有核酸雙鏈穩(wěn)定因子。

本發(fā)明進(jìn)一步地，所述核酸雙鏈穩(wěn)定因子位于封閉探針5’端以外位置，包括但不限于堿基的修飾，堿基類似物的使用，核酸骨架的改變，糖基的修飾，優(yōu)先為鎖核酸(locked nucleic acids,LNA)、肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)。

本發(fā)明進(jìn)一步地，所述核酸雙鏈穩(wěn)定因子位于封閉探針5’端，為DNA小溝結(jié)合物/類似物(minor groove binder,MGB)中的一種或一種以上的組合。

本發(fā)明進(jìn)一步地，所述封閉探針5’末端含有抑制核酸酶水解的修飾因子。

本發(fā)明進(jìn)一步地，所述修飾因子包括堿基類似物、核酸骨架、脫氧核糖類似物、肽核酸或硫代磷酸酯。

本發(fā)明進(jìn)一步地，所述檢測(cè)探針5’末端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3’末標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。

進(jìn)一步地，所述熒光報(bào)告基團(tuán)選自FAM、TET、HEX、JOE、CY3、CY5、ROX或Texas Red；所述熒光淬滅基團(tuán)選自TAMRA、BHQ1、BHQ2或CY5。

本發(fā)明進(jìn)一步地，所述反應(yīng)混合物還包括聚合酶，dNTP，和/或適合于PCR擴(kuò)增的其它試劑或緩沖劑。

本發(fā)明具有下述積極效果：

1、選擇性能優(yōu)越：本發(fā)明將選擇性擴(kuò)增和選擇性檢測(cè)結(jié)合使用，封閉探針優(yōu)先與野生型變異體結(jié)合，選擇性檢測(cè)探針優(yōu)先與突變型變異體結(jié)合，即使用封閉探針結(jié)合目標(biāo)核酸序列的野生型變異體，使得野生型變異體在擴(kuò)增反應(yīng)中不能被有效擴(kuò)增，從而選擇性擴(kuò)增目標(biāo)核酸序列的突變型變異體，形成突變型變異體擴(kuò)增子。同時(shí)選擇性檢測(cè)探針與突變型變異體結(jié)合，通過檢測(cè)探針熒光信號(hào)的變化來檢測(cè)突變型變異體擴(kuò)增子，因此即使有野生型變異體未被封閉探針結(jié)合，形成野生型變異體擴(kuò)增子，由于其不能與選擇性檢測(cè)探針結(jié)合，也不能產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)，從而阻止封閉探針結(jié)合突變型變異體，解除了封閉探針對(duì)突變型變異體的抑制，避免了假陰性結(jié)果。因此本方法可以在大量野生型變異體中檢測(cè)到微量的突變型變異體。傳統(tǒng)的等位基因特異性PCR(AS-PCR)方法，使用3’末端錯(cuò)配的引物一旦錯(cuò)誤的延伸就相當(dāng)于人為的引入突變型的變異體，這種人為引入的突變型變異體在隨后的每一輪循環(huán)中被作為突變型變異體被擴(kuò)增，而本發(fā)明不存在這一問題，在本發(fā)明中，即使野生型變異體在PCR一輪反應(yīng)中得到了擴(kuò)增，但是擴(kuò)增產(chǎn)物在下一輪反應(yīng)中仍然容易被Blocker結(jié)合而無法高效擴(kuò)增，從而高效的抑制了野生型變異體的擴(kuò)增效率，同時(shí)選擇性檢測(cè)探針的使用實(shí)現(xiàn)了選擇性檢測(cè)。

2、體系簡(jiǎn)單，不容易有副反應(yīng)：由于本發(fā)明采用公用引物，因此只需1對(duì)引物即可同時(shí)檢測(cè)多種缺失和/或插入突變，可以有效避免多條引物間形成二聚體。比如采用ARMS PCR方法在檢測(cè)常見的EGFR突變的14種缺失突變時(shí)，需要14條ARMS引物才可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)[US Premarket Approval Application number：150047(2016)]，而采用本發(fā)明的技術(shù)僅需要1條引物即可實(shí)現(xiàn)對(duì)所有缺失突變的檢測(cè)，有效避免多條引物間二聚體的形成，從而減少副反應(yīng)的發(fā)生，提高擴(kuò)增檢測(cè)效率，增強(qiáng)檢測(cè)靈敏度。

3、應(yīng)用廣泛，本發(fā)明可廣泛的應(yīng)用于核酸擴(kuò)增，腫瘤體外診斷，基因分型等領(lǐng)域。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1突變序列(EGFR2235-2249del15)和野生型序列在加入選擇性檢測(cè)探針情況下的擴(kuò)增圖；

圖2突變序列(EGFR2235-2249del15)、野生型序列和兩種序列的混合序列在加入封閉探針、選擇性檢測(cè)探針情況下的擴(kuò)增圖；

圖3突變序列(EGFR2236-2253del18)和野生型序列在加入選擇性檢測(cè)探針情況下的擴(kuò)增圖；

圖4突變序列(EGFR2236-2253del18)、野生型序列和兩種序列的混合序列在加入封閉探針、選擇性檢測(cè)探針情況下的擴(kuò)增圖；

圖5突變序列(EGFR 2319-2320insCAC)對(duì)應(yīng)的野生型序列在有封閉探針和無封閉探針情況下的擴(kuò)增圖；

圖6突變序列(EGFR 2319-2320insCAC)、野生型序列和兩種序列的混合序列在加入封閉探針、選擇性檢測(cè)探針情況下的擴(kuò)增圖；

圖7突變序列(EGFR2310-2311insGGT)對(duì)應(yīng)的野生型序列在有封閉探針和無封閉探針情況下的擴(kuò)增圖；

圖8突變序列(EGFR2310-2311insGGT)、野生型序列和兩種序列的混合序列在加入封閉探針、選擇性檢測(cè)探針情況下的擴(kuò)增圖；

具體實(shí)施方式

為了檢測(cè)存在于大量非待檢測(cè)核酸變異體中的少量待檢測(cè)核酸變異體，發(fā)明人進(jìn)行了大量的研究工作，并提出了本發(fā)明技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

一方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)目標(biāo)核酸序列變異體的組合物。所述組合物可以包括：(a)封閉探針，與所述目標(biāo)核酸序列的野生型變異體特異性結(jié)合，且其3’末端修飾有阻止其延伸的寡聚核苷酸；(b)檢測(cè)探針，與所述目標(biāo)核酸序列的突變型變異體特異性結(jié)合，并能產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)；(c)引物，與所述目標(biāo)核酸序列的野生型變異體和突變型變異體的共用引物。

在一些實(shí)施方案中，所述封閉探針3’末端通過非羥基基團(tuán)修飾阻止其延伸，所述非羥基基團(tuán)包括但不局限于磷酸化、氨基、脫氧、鹵代、C3 Spacer、C6 Spacer修飾。

在一些實(shí)施方案中，所述封閉探針含有核酸雙鏈穩(wěn)定因子。

在一些實(shí)施方案中，所述核酸雙鏈穩(wěn)定因子位于封閉探針5’端以外位置，包括但不限于堿基的修飾、堿基類似物的使用、核酸骨架的改變、糖基的修飾。

在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸雙鏈穩(wěn)定因子為鎖核酸(locked nucleic acids,LNA)、肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)。

在一些實(shí)施方案中，所述核酸雙鏈穩(wěn)定因子位于封閉探針5’端，為DNA小溝結(jié)合物/類似物(minor groove binder,MGB)中的一種或一種以上的組合。

在一些實(shí)施方案中，所述封閉探針5’末端含有抑制核酸酶水解的修飾因子。

其中所述修飾因子包括堿基類似物、核酸骨架(肽核酸或硫代磷酸酯)、脫氧核糖類似物、肽核酸或硫代磷酸酯。

在一些實(shí)施方案中，所述組合物還包括聚合酶，dNTP，和/或適合于PCR擴(kuò)增的其它試劑或緩沖劑。

本發(fā)明進(jìn)一步地，所述檢測(cè)探針5’末端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3’末標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。進(jìn)行熒光定量的檢測(cè)方法時(shí)探針完整時(shí)，5’端的熒光報(bào)告基團(tuán)受到3’端熒光淬滅基團(tuán)的制約，不能發(fā)出熒光。而檢測(cè)探針與目標(biāo)核酸序列的突變型變異體結(jié)合后，當(dāng)PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的3'－5'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，5’端的熒光報(bào)告基團(tuán)便會(huì)游離出來，發(fā)出熒光，通過熒光定量PCR達(dá)到檢測(cè)熒光的目的。

進(jìn)一步地，所述熒光報(bào)告基團(tuán)選自FAM、TET、HEX、JOE、CY3、CY5、ROX或Texas Red；所述熒光淬滅基團(tuán)選自TAMRA、BHQ1、BHQ2或CY5。

另一方面，本發(fā)明還提供一種檢測(cè)目標(biāo)核酸序列變異體的方法，將待測(cè)核酸樣品與上述檢測(cè)目標(biāo)核酸序列變異體的組合物混合，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)通過檢測(cè)檢測(cè)探針的檢測(cè)信號(hào)的變化來檢測(cè)擴(kuò)增子，從而檢測(cè)待測(cè)核酸樣品中的目標(biāo)核酸的突變型變異體。

進(jìn)一步的，還可以通過檢測(cè)探針的檢測(cè)信號(hào)的變化來定量突變型變異體。

在一些實(shí)施方案中，所述擴(kuò)增反應(yīng)包括但不限于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。

進(jìn)一步的，所述等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)包括但不限于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)、依賴于核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)(NASBA)、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(RCA)、單引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(SPIA)、依賴于解旋酶的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(HAD)、鏈替代擴(kuò)增技術(shù)(SDA)、快速等溫檢測(cè)放大技術(shù)(RIDA)、切刻內(nèi)切酶核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(NEMA)。

在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述擴(kuò)增反應(yīng)為實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

在一些實(shí)施方案中，所述突變型變異體為點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變。

根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)目標(biāo)核酸序列變異體的檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括如下成分：封閉探針、檢測(cè)探針和引物；

所述封閉探針與所述目標(biāo)核酸序列的野生型變異體特異性結(jié)合，且其3’末端修飾有阻止其延伸的寡聚核苷酸；

所述檢測(cè)探針與所述目標(biāo)核酸序列的突變型變異體特異性結(jié)合，并能產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)；

所述引物為所述目標(biāo)核酸序列的野生型變異體和突變型變異體的共用引物。

在一些實(shí)施方案中，所述封閉探針3’末端通過非羥基基團(tuán)修飾阻止其延伸，所述非羥基基團(tuán)包括但不局限于磷酸化、氨基、脫氧、鹵代、C3 Spacer、C6 Spacer修飾。

在一些實(shí)施方案中，所述封閉探針含有核酸雙鏈穩(wěn)定因子。

在一些實(shí)施方案中，所述核酸雙鏈穩(wěn)定因子位于封閉探針5’端以外位置，包括但不限于堿基的修飾、堿基類似物的使用、核酸骨架的改變、糖基的修飾。

在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸雙鏈穩(wěn)定因子為鎖核酸(locked nucleic acids,LNA)、肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)。

在一些實(shí)施方案中，所述核酸雙鏈穩(wěn)定因子位于封閉探針5’端，為DNA小溝結(jié)合物/類似物(minor groove binder,MGB)中的一種或一種以上的組合。

在一些實(shí)施方案中，所述封閉探針5’末端含有抑制核酸酶水解的修飾因子。

其中所述修飾因子包括堿基類似物、核酸骨架(肽核酸或硫代磷酸酯)、脫氧核糖類似物、肽核酸或硫代磷酸酯。

在一些實(shí)施方案中，所述檢測(cè)探針5’末端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3’末標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。

進(jìn)一步地，所述熒光報(bào)告基團(tuán)選自FAM、TET、HEX、JOE、CY3、CY5、ROX或Texas Red；所述熒光淬滅基團(tuán)選自TAMRA、BHQ1、BHQ2或CY5。

在一些實(shí)施方案中，所述組合物還包括聚合酶，dNTP，和/或適合于PCR擴(kuò)增的其它試劑或緩沖劑。如甘油、Tris·HCl、KCl、MgCl₂等。

除非特別定義，本專利所有的科學(xué)或技術(shù)專業(yè)詞匯均與本領(lǐng)域大部分一般人員的普通理解一致。以下的文獻(xiàn)中本領(lǐng)域中大部分專業(yè)名詞的一般定義：[Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994)]；[The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988)]；[The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger et al.(eds.),Springer Verlag(1991)]；[Hale&Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)]除非另外定義，本專利中所使用的專業(yè)名詞與上述文獻(xiàn)中對(duì)該專業(yè)名詞描述一致。

名詞“核苷酸”一般指的是一個(gè)核苷通過酯鍵與一個(gè)酸性分子或基團(tuán)相連而形成的化合物，例如，核苷的磷酸酯，通常有一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)磷酸基團(tuán)共價(jià)連接在核苷的糖基團(tuán)的5號(hào)位上。在一些情況下，核苷酸的定義還包括一些典型核苷酸的同系物或類似物。

名詞“寡聚核苷酸”指的是一種核苷酸之間通過共價(jià)鍵相連形成的多聚體。一個(gè)寡聚核苷酸通常包括至少3個(gè)核苷酸。在某些情況下，寡聚核苷酸也有可能包含有磷氨[Beaucage et al.(1993)Tetrahedron 49(10):1925]，硫代磷酸酯[Mag et al.(1991)Nucleic Acids Res.19:1437；and U.S.Pat.No.5644048)]，二硫代磷酸酯[Briu et al.(1989)J.Am.Chem.Soc.111:2321]，O-甲基磷氨連接[Eckstein,Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,Oxford University Press(1992))]，肽核酸骨架連接[Egholm(1992)J.Am.Chem.Soc.114:1895]。其他的寡聚核苷酸還包括那些帶正電的骨架[Denpcy et al.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6097]，非離子型骨架(U.S.Pat.Nos.5386023,5637684,5602240,5216141和4469863)和非核糖骨架(U.S.Pat.Nos.5235033和5034506)。寡聚核苷酸包含一個(gè)或多個(gè)碳環(huán)糖也在核酸的定義中[Jenkins et al.(1995)Chem.Soc.Rev.pp.169-176]。那些為了提高分子在特定條件下的穩(wěn)定性或者為了對(duì)寡聚核苷酸進(jìn)行標(biāo)簽等目的在核糖-磷酸骨架上進(jìn)行修飾的情況也包含在寡聚核苷酸的定義范圍內(nèi)。寡聚核苷酸還可能包括各種空間子(spacer)修飾，例如C3 Spacer，C9 Spacer，C18 Spacer等。

名詞“核酸”包括脫氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)，DNA-RNA雜交體，寡聚核苷酸，適配體(aptamers)，肽核酸(PNAs)，PNA-DNA雜交體，PNA-RNA雜交體等等。包括一切線性形式(單鏈或雙鏈)或分支狀形式的共價(jià)相連的核苷酸。一個(gè)典型的核酸通常是單鏈或者雙鏈的，并包含磷酸二脂鍵。

名詞“目標(biāo)核酸序列”指的是待擴(kuò)增的一段核酸序列，該序列作為核酸擴(kuò)增的模板。

名詞“核酸序列變異體”、“核酸變異體”指的是一段特定的核酸序列，不同變異體之間存在差別，這種差別可以是單個(gè)或多個(gè)堿基的不同，也可以是插入、缺失、易位或者以上所有類型的組合。

名詞“野生型變異體”指的是自然存在的“正?！钡幕蛐蛄校诖蠖鄶?shù)群體中同一基因序列出現(xiàn)頻率最高的序列。

名詞“突變型變異體”指的是相比于“野生型變異體”不同的核酸序列。這種不同可以是單個(gè)或多個(gè)堿基的不同，也可以是插入或缺失或者以上所有類型的組合，例如，腫瘤細(xì)胞中突變的核酸序列。在一些實(shí)施例中，相較于野生型變異體，突變型變異體所占比例很少。

名詞“擴(kuò)增”指的是目的核酸片段在核酸聚合酶的作用下數(shù)目變多的過程，包括但不限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)，核酸序列基礎(chǔ)擴(kuò)增(NASBA)，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(TMA)，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)，鏈置換擴(kuò)增(SDA)，解旋酶依賴擴(kuò)增(HDA)等。

在本發(fā)明實(shí)施例中，擴(kuò)增指的是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。模板變性解鏈，寡聚核苷酸引物與模板退火雜交，伴隨著核苷酸加入的延伸，如此反復(fù)循環(huán)一定輪數(shù)，實(shí)現(xiàn)目的核苷酸片段的增多。

名詞“突變”指細(xì)胞中的遺傳基因發(fā)生的改變。它包括單個(gè)堿基改變所引起的點(diǎn)突變，或多個(gè)堿基的缺失、重復(fù)和插入。

本專利中的“核酸雙鏈穩(wěn)定因子”指的是可以幫助穩(wěn)定核酸雙鏈結(jié)構(gòu)的化合物或基團(tuán)，它可以是鎖核酸，也可以是肽核酸或者是DNA小溝結(jié)合物。優(yōu)選的，修飾是DNA小溝結(jié)合物。之前有文獻(xiàn)報(bào)告DNA小溝結(jié)合物分子可以顯著的提高雜交核酸二聚體的退火溫度，通常DNA小溝結(jié)合物連接在寡聚核苷酸片段的3’端。由于連接DNA小溝結(jié)合物可以顯著的提高雜交核酸二聚體的退火溫度，不同的核酸變異體與修飾的寡聚核苷酸片段互補(bǔ)程度不同而產(chǎn)生較大的退火溫度的差異，從而產(chǎn)生不同的阻礙核酸聚合酶延伸的效果。本發(fā)明中，優(yōu)選的，DNA小溝結(jié)合物連接在寡聚核苷酸的5’端。

名詞“小溝結(jié)合物”指的是能與DNA小溝相結(jié)合的化合物。DNA雙螺旋的表面有兩條溝，分別命名為大溝和小溝。DNA大溝相比于DNA小溝擁有更多的氫鍵供體、受體、電荷等信息，并且細(xì)胞內(nèi)蛋白更喜好識(shí)別大溝內(nèi)的位點(diǎn)來調(diào)控基因的表達(dá)或者行使其他的細(xì)胞內(nèi)功能。

DNA小溝是自然界中一些抗生素的靶點(diǎn)，比如紡錘霉素(netropsin)，遠(yuǎn)霉素(distamycin)。這兩種化合物結(jié)合DNA的解離常數(shù)均為10～5M數(shù)量級(jí)，并且表現(xiàn)出對(duì)DNA AT-rich區(qū)域的偏好性。這兩種化合物在選擇性，毒性等方面具有一定的局限。研究人員找到了許多類似的化合物用來克服這些局限性，比如以下綜述文獻(xiàn)中提及的化合物[Sondhi et al.(Curr.Med.Chem.4,313(1997))，[Reddy et al.(Pharmacology&Therapeutics 84,1(1999)],Wemmer(Biopolymers 52,197(2001)]，[Dervan(Bioorg.Med.Chem.9,2215(2001)]。

還有一些化合物據(jù)稱更喜好結(jié)合DNA GC堿基對(duì)區(qū)域，比如以下文獻(xiàn)中提及的化合物[Anti-Cancer Drug Design 5,3(1990)]，[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,7586(1992)]，[Biochemistry 32,4237(1993)]，[Science 266,647(1994)]，[Anti-Cancer Drug Design 10,155(1995)]，[Bioorg Med.Chem.8,985(2000)]，[Mol.Biol.34,357(2000)]。不同的紡錘霉素(netropsin)，遠(yuǎn)霉素(distamycin)的類似物被發(fā)現(xiàn)，例如[J Am.Chem.Soc.114(15),5911(1992)]，[Biochemistry 31,8349(1992)]，[Bioconjugate Chem.5,475(1994)]，[Biochem.Biophys.Res.Commun.222,764(1996)]，[J Med.Chem.43,3257(2000)]，[Tetrahedron 56,5225(2000)]，[Molecular Pharmacology 54,280(1998)]，[Bioorg Med.Chem.Lett.6(18),2169(1996)]，[J.Med.Chem.45,805(2002)]，[Bioorg.Med.Chem.Lett.12,2007(2002)]，(international patent applications WO 97/28123,WO 98/21202,WO 01/74898and WO 02/00650,US patent numbers 4,912,199,5,273,991,5,637,621,5,698,674and 5,753,629)。紡錘霉素(netropsin)，遠(yuǎn)霉素(distamycin)的多肽同系物被以下專利WO/2003/059881公開。

名詞“測(cè)序法”是指分析特定核酸片段的堿基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)與鳥嘌呤的(G)排列方式。Sanger法是根據(jù)核苷酸在某一固定的點(diǎn)開始，隨機(jī)在某一個(gè)特定的堿基處終止，并且在每個(gè)堿基后面進(jìn)行熒光標(biāo)記，產(chǎn)生以腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)與鳥嘌呤的(G)結(jié)束的四組不同長(zhǎng)度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進(jìn)行檢測(cè)，從而獲得可見的DNA堿基序列。在循環(huán)陣列合成測(cè)序法中，序列都是在熒光或者化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的協(xié)助下,通過讀取DNA聚合酶或DNA連接酶將堿基連接到DNA鏈上過程中釋放出的光學(xué)信號(hào)而間接確定的。新型納米孔測(cè)序法(nanopore sequencing)是采用電泳技術(shù)，借助電泳驅(qū)動(dòng)單個(gè)分子逐一通過納米孔來實(shí)現(xiàn)測(cè)序的。由于納米孔的直徑非常細(xì)小，僅允許單個(gè)核酸聚合物通過，而不同的單個(gè)堿基的帶電性質(zhì)不一樣，通過電信號(hào)的差異就能檢測(cè)出通過的堿基類別，從而實(shí)現(xiàn)測(cè)序。核酸測(cè)序方法有多種，并且新的方法在不斷的被開發(fā)中。

在本發(fā)明實(shí)施例中，核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)是熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。在熒光定量PCR反應(yīng)中，衡量擴(kuò)增的參數(shù)是Ct值，較早的Ct值反應(yīng)的是信號(hào)更快的達(dá)到閾值。擴(kuò)增樣品中不同核酸變異體之間的Ct差值，往往反映了擴(kuò)增體系對(duì)不同核酸變異體擴(kuò)增效率的差異，進(jìn)一步反應(yīng)了擴(kuò)增體系的選擇性。

對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)在本領(lǐng)域中也有很多方法。這些方法包括使用熒光標(biāo)記的探針，或者各種與核酸結(jié)合的染料。這些檢測(cè)可以是特異性的檢測(cè)核酸變異體中一種或者多種，也可以是非選擇性的檢測(cè)所有核酸信號(hào)。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)可以發(fā)生在擴(kuò)增反應(yīng)完成之后，比如通過凝膠電泳的方法，或者對(duì)核酸進(jìn)行染色的方法。另外，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)也可以發(fā)生在擴(kuò)增反應(yīng)的過程之中。

實(shí)施例1：使用本發(fā)明所述的方法實(shí)現(xiàn)對(duì)缺失突變的選擇性擴(kuò)增與檢測(cè)

在這個(gè)實(shí)施例中，兩種目標(biāo)核酸序列的變異體分別加入的量為100copies和10⁶copies，一種變異體是一個(gè)質(zhì)粒DNA中插入了EGFR 2235-2249del15突變序列，而另一個(gè)變異體是相同的質(zhì)粒但插入了EGFR野生型序列。

EGFR突變序列為：

TTCGGGGTGCATCGCTGGTAACATCCACCCAGATCACTGGGCAGCATGTGGCACCATCTCACAATTGCCAGTTAACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTGGGGGTCCATGGCTCTGAACCTCAGGCCCACCTTTTCTCATGTCTGGCAGCTGCTCTGCTCTAGACCCTGCTCATCTCCACATCCTAAATGTTCACTTTC

EGFR野生型序列為：

TTCGGGGTGCATCGCTGGTAACATCCACCCAGATCACTGGGCAGCATGTGGCACCATCTCACAATTGCCAGTTAACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTGGGGGTCCATGGCTCTGAACCTCAGGCCCACCTTTTCTCATGTCTGGCAGCTGCTCTGCTCTAGACCCTGCTCATCTCCACATCCTAAATGTTCACTTTC

正向引物序列為：DF-GACTCTGGATCCCAGAAGGTGA

反向引物序列為：DR-GGGCCTGAGGTTCAGAGCC

封閉探針序列為：DB-GGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAA(5’端MGB修飾，3’端C3 Spacer)

檢測(cè)探針序列為：DPF1-TCGCTATCAAAACATCT(5’端FAM，3’端MGB)

PCR反應(yīng)體系為25μl，每個(gè)反應(yīng)體系中含有2％甘油，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM，正向引物、反向引物各200nM，檢測(cè)探針200nM，封閉探針500nM和1個(gè)單位的熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶。其中1個(gè)單位是指在72℃30分鐘摻入10nmol dNTPs所需要的酶量。

使用羅氏LightCycler 480熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)和后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。PCR熱循環(huán)條件為95℃，10min；50循環(huán)(95℃，15s；60℃，40s，單循環(huán))；37℃，30s。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1和圖2，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果通過在465nM-510nM的熒光變化來體現(xiàn)的。

圖1中可見10⁶copies野生型模板在加入檢測(cè)探針后擴(kuò)增效率極低，基本無擴(kuò)增，由此表明檢測(cè)探針具有極強(qiáng)的檢測(cè)選擇性。

圖2中可見10⁶copies野生型模板在加入封閉探針及檢測(cè)探針后完全無擴(kuò)增。封閉探針與檢測(cè)探針共存時(shí)突變型模板與混合型模板(100copies突變型與10⁶copies野生型)均得到有效擴(kuò)增，封閉探針的存在不會(huì)干擾突變型模板的檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)探針的存在也不會(huì)干擾封閉探針對(duì)野生型模板的結(jié)合。

實(shí)施例2：使用本發(fā)明所述的方法實(shí)現(xiàn)對(duì)缺失突變的選擇性擴(kuò)增與檢測(cè)

在這個(gè)實(shí)施例中，兩種目標(biāo)核酸序列的變異體分別加入的量為100copies和10⁶copies，一種變異體是一個(gè)質(zhì)粒DNA中插入了EGFR 2236-2253del18突變序列，而另一個(gè)變異體是相同的質(zhì)粒但插入了EGFR野生型序列。

EGFR突變序列為：

TTCGGGGTGCATCGCTGGTAACATCCACCCAGATCACTGGGCAGCATGTGGCACCATCTCACAATTGCCAGTTAACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGTCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTGGGGGTCCATGGCTCTGAACCTCAGGCCCACCTTTTCTCATGTCTGGCAGCTGCTCTGCTCTAGACCCTGCTCATCTCCACATCCTAAATGTTCACTTTC

EGFR野生型序列為：

TTCGGGGTGCATCGCTGGTAACATCCACCCAGATCACTGGGCAGCATGTGGCACCATCTCACAATTGCCAGTTAACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTGGGGGTCCATGGCTCTGAACCTCAGGCCCACCTTTTCTCATGTCTGGCAGCTGCTCTGCTCTAGACCCTGCTCATCTCCACATCCTAAATGTTCACTTTC

正向引物序列為：DF-GACTCTGGATCCCAGAAGGTGA

反向引物序列為：DR-GGGCCTGAGGTTCAGAGCC

封閉探針序列為：DB-GGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAA(5’端MGB修飾，3’端C3 Spacer)

檢測(cè)探針序列為：DPF2-TCGCTATCAAGTCTCCGAAAGCCAACA(5’端FAM，3’端BHQ1)

PCR反應(yīng)體系為25μl，每個(gè)反應(yīng)體系中含有2％甘油，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM，正向引物、反向引物各200nM，檢測(cè)探針200nM，封閉探針500nM和1個(gè)單位的熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶。

使用羅氏LightCycler 480熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)和后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。PCR熱循環(huán)條件為95℃，10min；50循環(huán)(95℃，15s；60℃，40s，單循環(huán))；37℃,30s。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3和圖4，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果通過在465nM-510nM的熒光變化來體現(xiàn)的。

圖3中可見10⁶copies野生型模板在加入檢測(cè)探針后擴(kuò)增效率極低，基本無擴(kuò)增，由此表明檢測(cè)探針具有極強(qiáng)的檢測(cè)選擇性。

圖4中可見10⁶copies野生型模板在加入封閉探針及檢測(cè)探針后完全無擴(kuò)增。封閉探針與檢測(cè)探針共存時(shí)突變型模板與混合型模板(100copie突變型與10⁶copies野生型)均得到有效擴(kuò)增，封閉探針的存在不會(huì)干擾突變型模板的檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)探針的存在也不會(huì)干擾封閉探針對(duì)野生型模板的結(jié)合。

實(shí)施例3：使用本發(fā)明所述的方法實(shí)現(xiàn)對(duì)插入突變的選擇性擴(kuò)增與檢測(cè)

在這個(gè)實(shí)施例中，兩種目標(biāo)核酸序列的變異體分別加入的量為100copies和10⁶copies，一種變異體是一個(gè)質(zhì)粒DNA中插入了EGFR 2319-2320insCAC突變序列，而另一個(gè)變異體是相同的質(zhì)粒但插入了EGFR野生型序列。

EGFR突變序列為：

GCTTTTCCTCCATGAGTACGTATTTTGAAACTCAAGATCGCATTCATGCGTCTTCACCTGGAAGGGGTCCATGTGCCCCTCCTTCTGGCCACCATGCGAAGCCACACTGACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAAAGGTAATCAGGGAAGGGAGATACGGGGAGGGGAGATAAGGAGCCAGGATCCT

EGFR野生型序列為：

GCTTTTCCTCCATGAGTACGTATTTTGAAACTCAAGATCGCATTCATGCGTCTTCACCTGGAAGGGGTCCATGTGCCCCTCCTTCTGGCCACCATGCGAAGCCACACTGACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAAAGGTAATCAGGGAAGGGAGATACGGGGAGGGGAGATAAGGAGCCAGGATCCT

正向引物序列為：INF-CTACGTGATGGCCAGCGTG

反向引物序列為：INR-CATTCATGCGTCTTCACCTGG

封閉探針序列為：INB-ACAACCCCCACGTGT(5’端MGB修飾，3’端C3 Spacer)

檢測(cè)探針序列為：INPH1-CCCCACCACGTGTGC(5’端HEX，3’端MGB)

PCR反應(yīng)體系為25μl，每個(gè)反應(yīng)體系中含有2％甘油，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM，正向引物、反向引物各200nM，檢測(cè)探針200nM，封閉探針500nM和1個(gè)單位的熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶。

使用羅氏LightCycler 480熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)和后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。PCR熱循環(huán)條件為95℃，10min；50循環(huán)(95℃，15s；60℃，40s，循環(huán))；37℃,30s。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5和圖6，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果通過在533nM-580nM的熒光變化來體現(xiàn)的。

圖5中可見在無封閉探針的時(shí)候10⁶copies野生型模板擴(kuò)增明顯，而加入封閉探針后基本無擴(kuò)增。

圖6中可見在封閉探針與檢測(cè)探針共存時(shí)突變型模板的擴(kuò)增效果與混合型模板(100copies突變型與10⁶copies野生型)的擴(kuò)增效果類似，封閉探針的存在不會(huì)干擾突變型模板的檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)探針的存在也不會(huì)干擾封閉探針對(duì)野生型模板的結(jié)合。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明使用本發(fā)明所述的方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)插入突變的選擇性擴(kuò)增與選擇性檢測(cè)。

實(shí)施例4：使用本發(fā)明所述的方法實(shí)現(xiàn)對(duì)插入突變的選擇性擴(kuò)增與檢測(cè)

在這個(gè)實(shí)施例中，兩種目標(biāo)核酸序列的變異體分別加入的量為100copies和10⁶copies，一種變異體是一個(gè)質(zhì)粒DNA中插入了EGFR 2310-2311insGGT序列，而另一個(gè)變異體是相同的質(zhì)粒但插入了EGFR野生型序列。

EGFR突變序列為：

GCTTTTCCTCCATGAGTACGTATTTTGAAACTCAAGATCGCATTCATGCGTCTTCACCTGGAAGGGGTCCATGTGCCCCTCCTTCTGGCCACCATGCGAAGCCACACTGACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACGGTAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAAAG

EGFR野生型序列為：

GCTTTTCCTCCATGAGTACGTATTTTGAAACTCAAGATCGCATTCATGCGTCTTCACCTGGAAGGGGTCCATGTGCCCCTCCTTCTGGCCACCATGCGAAGCCACACTGACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAAAGGTAATCAGGGAAGGGAGATACGGGGAGGGGAGATAAGGAGCCAGGATCCT

正向引物序列為：INF-CTACGTGATGGCCAGCGTG

反向引物序列為：INR-CATTCATGCGTCTTCACCTGG

封閉探針序列為：INB-ACAACCCCCACGTGT(5’端MGB修飾，3’端C3 Spacer)

檢測(cè)探針序列為：INPH2-GTGGACGGTAACCC(5’端HEX，3’端MGB)

PCR反應(yīng)體系為25μl，每個(gè)反應(yīng)體系中含有2％甘油，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM，正向引物、反向引物各200nM，檢測(cè)探針200nM，封閉探針500nM和1個(gè)單位的熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶。

使用羅氏LightCycler 480熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)和后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。PCR熱循環(huán)條件為95℃，10min；50循環(huán)(95℃，15s；60℃，40s，單循環(huán))；37℃，30s。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7和圖8，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果通過在533nM-580nM的熒光變化來體現(xiàn)的。

圖7中可見在無封閉探針的時(shí)候10^⁶野生型模板擴(kuò)增明顯，而加入封閉探針后基本無擴(kuò)增。

圖8中可見在封閉探針與檢測(cè)探針共存時(shí)野生型模板的擴(kuò)增效果與混合型模板(100copies突變型與10⁶copies野生型)的擴(kuò)增效果類似，封閉探針的存在不會(huì)干擾突變型模板的檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)探針的存在也不會(huì)干擾封閉探針對(duì)野生型模板的結(jié)合。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明使用本發(fā)明提供的方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)插入突變的選擇性擴(kuò)增與選擇性檢測(cè)。

對(duì)所公開的實(shí)施例的上述說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對(duì)這些實(shí)施例的多種修改對(duì)本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實(shí)施例中實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會(huì)被限制于本文所示的實(shí)施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點(diǎn)相一致的最寬的范圍。