本發(fā)明屬于分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種快速進(jìn)行DNA末端修復(fù)和加接頭的方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：以Illumina測序平臺為代表的下一代測序（Next-generationSequencing，NGS）試驗(yàn)中，在進(jìn)行上機(jī)測序前，需要首先將DNA樣本打斷至一定長度，然后對打斷的DNA樣本進(jìn)行末端修復(fù)、加接頭等后續(xù)操作，完成文庫制備。目前，廣泛使用的DNA打斷方法包括機(jī)械法和酶法。機(jī)械法主要是超聲波破碎法，如采用Covaris和Bioruptor公司的超聲波破碎儀進(jìn)行超聲波打斷；酶法打斷主要是利用非特異性核酸酶如NEB公司的大片段酶等對DNA進(jìn)行隨機(jī)切斷。通過機(jī)械法和酶法打斷的DNA其兩端大多都會帶有5’-或3’-凸出的粘性末端。要想對打斷的帶有粘性末端的DNA片段進(jìn)行測序，首先必須對其末端進(jìn)行修復(fù)，以滿足接頭連接的需要。目前對DNA進(jìn)行修復(fù)主要采用T4DNA聚合酶或Klenow片段酶及T4多聚核苷酸激酶。T4DNA聚合酶或Klenow片段酶具有5’-3’DNA聚合酶和3’-5’核酸外切酶活性，可以在dNTP存在的情況下，將DNA片段的5’-粘性末端進(jìn)行補(bǔ)平，同時(shí)可以切除凸出的3’-末端。T4多聚核苷酸激酶可在ATP存在的條件下，在DNA的5’-末端加入磷酸基團(tuán)。通過以上過程，可以完成對打斷DNA的末端修復(fù)。修復(fù)后的DNA具有平末端，可以進(jìn)一步利用沒有外切酶活性的Klenow片段酶在DNA的3’-末端加A，利用T4DNA連接酶連接5’末端帶有T的接頭，進(jìn)行TA連接。目前各種DNA測序文庫制備試劑盒中的DNA末端補(bǔ)平和加接頭都是基于以上原理，多采用TA連接法加接頭。不同試劑盒采用不同的反應(yīng)緩沖液，但共同目的都是使實(shí)驗(yàn)步驟更簡單，操作時(shí)間更短，同時(shí)制備高效率的DNA文庫。但是由于DNA3’-末端加A與DNA的核酸外切酶活性相沖突，目前對打斷的DNA進(jìn)行平末端化和加A需要分開進(jìn)行，同時(shí)中間需要進(jìn)行純化，再加上連接接頭的過程，大概需要2.5小時(shí)左右。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：第一方面，本發(fā)明提供了一種快速進(jìn)行DNA末端修復(fù)和加接頭的方法及應(yīng)用，所述的方法進(jìn)行末端修復(fù)和加接頭僅需40min左右，有效提高了DNA制備的效率。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的具體實(shí)施方式提供了一種快速進(jìn)行DNA末端修復(fù)和加接頭的方法，本方法采用以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供一種快速進(jìn)行DNA末端修復(fù)和加接頭的方法，所述方法采用包含高保真DNA聚合酶的混合液進(jìn)行DNA末端修復(fù)、采用T4DNA連接酶進(jìn)行接頭連接。本發(fā)明采用同樣具有5′-3′DNA聚合酶活性和3′-5′外切酶活性的高保真DNA聚合酶進(jìn)行末端補(bǔ)平和修復(fù)，該酶在65-75℃時(shí)才具有活性。本發(fā)明采用平末端連接法進(jìn)行接頭連接，經(jīng)高保真DNA聚合酶修復(fù)后的DNA無需進(jìn)行加A反應(yīng)，直接利用T4DNA連接酶連接一端為平末端的接頭。本發(fā)明所采用的平末端連接接頭的方法在末端補(bǔ)平后無需進(jìn)行純化，可直接利用補(bǔ)平修復(fù)后的產(chǎn)物進(jìn)行連接，高保真DNA聚合酶雖然依然存在于連接反應(yīng)體系中，但因連接反應(yīng)的適宜溫度為16-22℃，而此時(shí)高保真DNA聚合酶幾乎沒有活性，所以不會干擾DNA與接頭的連接反應(yīng)而無需純化。本發(fā)明選取高保真DNA聚合酶最適合的反應(yīng)條件，即對反應(yīng)緩沖液體系、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行控制，已優(yōu)化DNA末端修復(fù)的效果，并縮短實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間。第二方面，本發(fā)明提供一種用于DNA末端補(bǔ)平和修復(fù)的包含高保真DNA聚合酶的混合液，所述混合液包含高保真DNA聚合酶、dNTPs、反應(yīng)緩沖液和去離子水。優(yōu)選地，所述包含高保真DNA聚合酶的混合液中高保真DNA聚合酶濃度為0.05-0.2U/μL，例如可以是0.05U/μL、0.1U/μL、0.15U/μL或0.2U/μL，進(jìn)一步優(yōu)選為0.1U/μL。優(yōu)選地，所述包含高保真DNA聚合酶的混合液所包含的dNTPs中的dATP、dCTP、dTTP和dGTP的濃度比為1:1:1:1，所述dNTPs總濃度為0.4-2mM，例如可以是0.4mM、0.8mM、1.6mM或2mM，進(jìn)一步優(yōu)選為0.8mM。優(yōu)選地，所述包含高保真DNA聚合酶的混合液所包含的反應(yīng)緩沖液包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4和MgSO4。優(yōu)選地，所述Tris-HCl濃度為5-60mM，pH值為pH8.0-pH9.0，例如可以濃度是5mM、20mM、40mM或60mM，pH值可以是pH8.0、pH8.5、pH8.8或pH9.0，進(jìn)一步優(yōu)選為40mM，pH8.8。優(yōu)選地，所述KCl濃度為10-40mM，例如可以是10mM、20mM、30mM或40mM，進(jìn)一步優(yōu)選為20mM。優(yōu)選地，訴述(NH4)2SO4濃度為10-50mM，例如可以是10mM、20mM、30mM、40mM或50mM，進(jìn)一步優(yōu)選為20mM。優(yōu)選地，所述MgSO4濃度為0-10mM，例如可以是0mM、4mM或10mM，進(jìn)一步優(yōu)選為4mM。優(yōu)選地，所述包含高保真DNA聚合酶的混合液為10μL，包括如下組分：加去離子水至10μL。第三方面，本發(fā)明提供一種如第二方面所述的包含高保真DNA聚合酶的混合液的使用方法，所述方法包括如下步驟：(1)取10μL包含經(jīng)過隨機(jī)打斷的待修復(fù)的DNA樣本4-12ng置于PCR管；(2)向步驟(1)中包含DNA樣本的PCR管中加入10μL包含高保真DNA聚合酶的混合液，渦旋混勻；(3)將步驟(2)包含DNA樣本和混合液的PCR管置于可控溫裝置，設(shè)置反應(yīng)溫度為72℃反應(yīng)10min。優(yōu)選地，步驟(2)所述打斷DNA樣本與混合液的體積比優(yōu)選為1:1。優(yōu)選地，步驟(3)所述可控溫裝置，可為烘箱、水浴鍋、PCR儀等，進(jìn)一步優(yōu)選為PCR儀；所述反應(yīng)溫度為65-75℃，例如可以是65℃、68℃、72℃或75℃，進(jìn)一步優(yōu)選為72℃；所述反應(yīng)10min可為反應(yīng)5-20min，例如可以是5min、10min或20min，進(jìn)一步優(yōu)選為10min。第四方面，本發(fā)明提供一種采用T4DNA連接酶進(jìn)行接頭連接。優(yōu)選地，所述T4DNA連接酶在進(jìn)行加接頭反應(yīng)的反應(yīng)體系中含量為100U-700U，例如可以是100U、175U、350U、525U或700U，進(jìn)一步優(yōu)選為350U。優(yōu)選地，所述采用T4DNA連接酶進(jìn)行接頭連接，其特征在于所述接頭為一端為平末端。優(yōu)選地，所述采用T4DNA連接酶進(jìn)行接頭連接，其方法包括如下步驟：(1)利用第三方面步驟(3)的PCR反應(yīng)管繼續(xù)配置連接反應(yīng)體系，連接體系為：末端修復(fù)反應(yīng)產(chǎn)物20μLT4DNA連接酶1μLT4DNA連接酶緩沖液10μL10μM接頭12μL10μM接頭22μL去離子水65μL總反應(yīng)體系為100μL。(2)將步驟(1)中的PCR反應(yīng)管置于反應(yīng)裝置，22℃連接30min。第五方面，本發(fā)明提供一種快速進(jìn)行DNA末端修復(fù)和加接頭的試劑盒，所述試劑盒包含如第二方面所述的包含高保真DNA聚合酶的混合液及第四方面所述的T4DNA連接酶及其緩沖液。第六方面，本發(fā)明提供如第一方面所述的方法，或第二方面所述的包含高保真DNA聚合酶的混合液，或第五方面所述的試劑盒在DNA片段末端補(bǔ)平修復(fù)及接頭連接實(shí)驗(yàn)如高通量測序文庫制備中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)本發(fā)明將DNA末端修復(fù)及加接頭整體實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間由2.5小時(shí)左右減少到40min左右，省去一步純化步驟，節(jié)約了工作時(shí)間，降低了試劑耗材成本，提高了文庫制備效率；(2)本發(fā)明采用高保真DNA聚合酶替代T4DNA聚合酶Klenow片段酶進(jìn)行末端補(bǔ)平和修復(fù)，前者較后二者相比，可達(dá)到相同實(shí)驗(yàn)效果，但成本更低廉；(3)本發(fā)明采用平末端連接接頭的方法，省去了加A步驟，無需T4多聚核苷酸激酶，進(jìn)一步降低了成本，縮短了反應(yīng)時(shí)間；(4)本發(fā)明方法可用于所有基于Illumina測序平臺的DNA文庫構(gòu)建，同時(shí)可應(yīng)用與其他類型的DNA補(bǔ)平修復(fù)及連接實(shí)驗(yàn)。具體實(shí)施方式為進(jìn)一步闡述本發(fā)明目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面結(jié)合本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例對本說明進(jìn)行詳細(xì)的闡述，但本發(fā)明并非局限于本實(shí)施例范圍內(nèi)。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)或產(chǎn)品說明書所描述的技術(shù)條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商的，均為本領(lǐng)域常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1(1)將待修復(fù)的擬南芥DNA樣本打斷，取打斷樣本5ng置于PCR管，用去離子水稀釋至終體積10μL。(2)配置包含高保真DNA聚合酶的混合液，組成成分如下：組分終含量Tris-HCl（pH8.8）40mMKCl20mM(NH4)2SO420mMMgSO44mMdNTP0.8mM高保真DNA聚合酶1U加去離子水至終體積為10μL。(3)將步驟(2)配置的混合液加入步驟(1)的含有待修復(fù)樣本的PCR管，在PCR儀上72℃反應(yīng)10min，完成DNA末端修復(fù)。(4)向步驟(2)末端修復(fù)樣品中加入連接體系（總體積80μL）如下：組分體積T4DNA連接酶1μLT4DNA連接酶緩沖液10μL10μM接頭12μL10μM接頭22μL去離子水65μL將步驟(4)配置的連接反應(yīng)體系置于PCR儀，22℃連接30min，完成DNA加接頭。綜上所述，本發(fā)明利用高保真DNA聚合酶進(jìn)行DNA末端補(bǔ)平修復(fù)，利用T4DNA連接酶進(jìn)行平末端加接頭反應(yīng)，整個(gè)DNA末端補(bǔ)平修復(fù)及加接頭實(shí)驗(yàn)過程僅需40min左右，省去中間純化步驟，節(jié)約了工作時(shí)間，降低了試劑耗材成本，提高了文庫制備效率。申請人聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行具體闡述，但本發(fā)明并不局限于上述實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明的任何改進(jìn)，對產(chǎn)品原料的等效替換及輔助成分的添加，具體實(shí)施方式的選擇等，都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3