本發(fā)明屬于中藥化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種操作簡便，經(jīng)濟(jì)，方便，快速高效，對多糖結(jié)構(gòu)和活性均無影響，無有機(jī)溶劑殘留，高收率和純度的何首烏脫色多糖制備方法。

背景技術(shù)：

何首烏多糖具有抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化及抗老年癡呆癥等生物活性，是何首烏的重要功能性成分。通常情況下，傳統(tǒng)的水提醇沉法是獲取何首烏多糖的主要手段，但所得的多糖產(chǎn)品色澤深、雜質(zhì)較多，嚴(yán)重影響多糖的純度、色度、穩(wěn)定性及生物活性，也阻礙了對多糖結(jié)構(gòu)與其生物活性關(guān)系的深入研究。

為了提高何首烏多糖產(chǎn)品質(zhì)量，目前主要采用活性炭吸附、雙氧水氧化、DEAE纖維素柱層析、大孔樹脂吸附法等方法進(jìn)行純化脫色處理，但尚不能達(dá)到理想的效果。如活性炭吸附法雖然經(jīng)濟(jì)，但其脫色時間較長，脫色效果差且多糖保留率低。雙氧水氧化法脫色效果雖好，但反應(yīng)過程會對多糖結(jié)構(gòu)造成一定破壞，影響其生物活性。DEAE纖維素柱層析法雖然能取得較好的脫色效果，但DEAE纖維素柱使用壽命短，使用成本太高。大孔樹脂吸附法則存在脫色時間長，脫色效率低，樣品處理量小，溶劑耗量大等缺陷，如專利文獻(xiàn)CN102731667A公開的大孔樹脂吸附法，樣品處理濃度僅為5-15g/L，脫色純化時間需4-8h，溶劑用量極大，脫色效率太低。

因此，研究一種經(jīng)濟(jì)、方便、快速高效、對多糖結(jié)構(gòu)和活性無影響、無有機(jī)溶劑殘留、高收率和純度的何首烏脫色脫色多糖制備方法，具有重要的價值和應(yīng)用前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種經(jīng)濟(jì)、方便、快速高效、對多糖結(jié)構(gòu)無破壞和對活性無影響、無有機(jī)溶劑殘留、高收率和純度的何首烏脫色多糖制備方法。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下的技術(shù)方案：

一種何首烏脫色多糖的制備方法，其特征在于所述的何首烏脫色多糖是以何首烏多糖粗品樣品為原料，通過以聚甲基丙烯酸酯類MCI GEL反相精細(xì)分離填料為層析柱填料的加壓層析系統(tǒng)柱層析分離得到。

根據(jù)本發(fā)明的制備方法，所述的何首烏多糖粗品樣品為濃度為0.01～0.2g/mL的何首烏多糖粗品水溶液。優(yōu)選地，所述的何首烏多糖粗品樣品為濃度為0.05～0.1g/mL的何首烏多糖粗品水溶液。

根據(jù)本發(fā)明的制備方法，所述的加壓層析系統(tǒng)為中低壓加壓層析系統(tǒng)。優(yōu)選地，所述的加壓層析系統(tǒng)的最大耐壓為40bar。

根據(jù)本發(fā)明的制備方法，所述的加壓層析系統(tǒng)包括一根最大耐壓40bar的中壓柱、一臺低壓泵以及餾分收集器。優(yōu)選地，所述的加壓層析系統(tǒng)包括一根最大耐壓40bar的中壓玻璃柱、一臺二元低壓泵以及可計時收集的餾分收集器。

根據(jù)本發(fā)明的制備方法，所述的柱層析分離條件是以粒徑為50～70μm的聚甲基丙烯酸酯類MCI GEL反相精細(xì)分離填料為柱填料，以水為洗脫溶劑，設(shè)置泵流速1～20mL/min，多糖粗品樣品與分離填料柱體積之比為1:3～1:20，洗脫溶劑體積為1～10倍柱體積，收集水相冷凍干燥，獲得本發(fā)明的何首烏多糖。其中，優(yōu)選地，所述的泵流速設(shè)置為3～20mL/min，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的泵流速設(shè)置為3-10mL/min；優(yōu)選地，所述的多糖樣品與分離填料柱體積之比為1:5-1:20，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的多糖樣品與分離填料柱體積之比為1:5-1:10；優(yōu)選地，所述的洗脫溶劑體積為1.5-10倍柱體積，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的洗脫溶劑體積為1.5-5倍柱體積。

在另一些實施方案中，本發(fā)明的制備方法，所述的柱層析分離條件是以粒徑為50～70μm的聚甲基丙烯酸酯類MCI GEL反相精細(xì)分離填料為柱填料，柱體積為400～1000mL，以水為洗脫溶劑，設(shè)置泵流速1-20mL/min，多糖粗品樣品與分離填料柱體積之比為1:3～1:20，進(jìn)樣完畢后吸附0-10min，洗脫溶劑體積為1-10倍柱體積，收集水相冷凍干燥，獲得本發(fā)明的何首烏多糖。其中，優(yōu)選地，所述的泵流速設(shè)置為3～20mL/min，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的泵流速設(shè)置為3-10mL/min；優(yōu)選地，所述的多糖樣品與分離填料柱體積之比為1:5-1:20，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的多糖樣品與分離填料柱體積之比為1:5-1:10；優(yōu)選地，所述的洗脫溶劑體積為1.5-10倍柱體積，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的洗脫溶劑體積為1.5-5倍柱體積。

根據(jù)本發(fā)明的制備方法，還可以進(jìn)一步包括如下步驟：用有機(jī)相沖洗經(jīng)水相洗脫的分離柱，再用水相置換有機(jī)相，平衡分離柱后重復(fù)步驟(2)的柱層析分離步驟，所述的有機(jī)相選擇甲醇、異丙醇、丙酮中的一種或多種，有機(jī)相沖洗體積為1-10倍柱體積。優(yōu)選地，所述的有機(jī)相為甲醇，沖洗體積為3-10倍柱體積。

在一些具體的實施方案中，本發(fā)明提供的何首烏脫色多糖的制備方法，包括以下步驟：

(1)將何首烏多糖粗品配制成多糖粗品樣品；

(2)以聚甲基丙烯酸酯類MCI GEL反相精細(xì)分離填料為層析填料，通過加壓層析系統(tǒng)柱層析，收集水相冷凍干燥得到；

其中，

步驟(1)的何首烏多糖粗品樣品為濃度為0.01-0.2g/mL的多糖粗品水溶液；優(yōu)選地，所述何首烏多糖粗品樣品為濃度為0.05-0.1g/mL的多糖粗品水溶液；

步驟(2)的加壓層析系統(tǒng)為最大耐壓為40bar的中低壓加壓層析系統(tǒng)；

步驟(2)的柱層析條件為：以粒徑為50～70μm的聚甲基丙烯酸酯類MCI GEL反相精細(xì)分離填料為柱填料，以水為洗脫溶劑，設(shè)置泵流速1～20mL/min，多糖粗品樣品與分離填料柱體積之比為1:3～1:20，洗脫溶劑體積為1～10倍柱體積，其中，所述的水優(yōu)選為蒸餾水。

在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供的何首烏脫色多糖的制備方法，其中步驟(1)的何首烏多糖粗品樣品的配制方法是將何首烏多糖與水按照質(zhì)量(g)體積(mL)比為1:100-1:5的比例溶解，并過濾。

在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供的何首烏脫色多糖的制備方法，其中步驟(1)的何首烏多糖粗品樣品的配制方法是將何首烏多糖與水按照質(zhì)量(g)體積(mL)比為1:20-1:5的比例溶解，并過濾。

在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供的何首烏脫色多糖的制備方法，其中步驟(1)的何首烏多糖粗品樣品的配制方法是將何首烏多糖與水按照質(zhì)量(g)體積(mL)比為1:20-1:10的比例溶解，并過濾。

在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供的何首烏脫色多糖的制備方法，其中步驟(1)的何首烏多糖粗品樣品的配制方法是在50-80℃下，將何首烏多糖與水按照質(zhì)量(g)體積(mL)比為1:100-1:5的比例溶解，過濾后冷卻至室溫。

在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供的何首烏脫色多糖的制備方法，其中步驟(1)的何首烏多糖粗品樣品的配制方法是在50-80℃下，將何首烏多糖與水按照質(zhì)量(g)體積(mL)比為1:20-1:5的比例溶解，過濾后冷卻至室溫。

在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供的何首烏脫色多糖的制備方法，其中步驟(1)的何首烏多糖粗品樣品的配制方法是在50-80℃下，將何首烏多糖與水按照質(zhì)量(g)體積(mL)比為1:20-1:10的比例溶解，過濾后冷卻至室溫。

在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供的何首烏脫色多糖的制備方法，其中步驟(2)的柱層析條件是以粒徑為50～70μm的聚甲基丙烯酸酯類MCI GEL反相精細(xì)分離填料為柱填料，以水為洗脫溶劑，設(shè)置泵流速3～20mL/min，多糖粗品樣品與分離填料柱體積之比為1:5～1:10，洗脫溶劑體積為1.5～10倍柱體積，其中，所述的水優(yōu)選為蒸餾水。

在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供的何首烏脫色多糖的制備方法，其中步驟(2)的柱層析條件是以粒徑為50～70μm的聚甲基丙烯酸酯類MCI GEL反相精細(xì)分離填料為柱填料，以水為洗脫溶劑，設(shè)置泵流速3～10mL/min，多糖粗品樣品與分離填料柱體積之比為1:5～1:10，洗脫溶劑體積為1.5～5倍柱體積，其中，所述的水優(yōu)選為蒸餾水。

在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供的何首烏脫色多糖的制備方法，其中步驟(2)的柱層析分離條件是以粒徑為50～70μm的聚甲基丙烯酸酯類MCI GEL反相精細(xì)分離填料為柱填料，柱體積為400～1000mL，以水為洗脫溶劑，設(shè)置泵流速3～20mL/min，多糖粗品樣品與分離填料柱體積之比為1:3～1:20，進(jìn)樣完畢后吸附0-10min，洗脫溶劑體積為3～10倍柱體積。

在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供的何首烏脫色多糖的制備方法，還可以進(jìn)一步包括如下步驟：用有機(jī)相沖洗經(jīng)水相洗脫的分離柱，再用水相平衡分離柱后重復(fù)步驟(2)的柱層析分離步驟，所述的有機(jī)相選擇甲醇、異丙醇、丙酮中的一種或多種，有機(jī)相沖洗體積為1-10倍柱體積。優(yōu)選地，所述的有機(jī)相選擇甲醇、異丙醇、丙酮中的一種或多種，有機(jī)相沖洗體積為3-10倍柱體積。

本發(fā)明提供的較佳實施方案是本發(fā)明的何首烏脫色多糖的制備方法，包括以下步驟：

(1)將何首烏多糖粗品和蒸餾水按照質(zhì)量(g)體積(mL)比為1:20-1:10的比例溶解，并過濾，配制成濃度為0.05～0.1g/mL的多糖粗品水溶液；

(2)以粒徑為50～70μm的聚甲基丙烯酸酯類MCI GEL反相精細(xì)分離填料為柱填料，以水為洗脫溶劑，柱體積為400～1000mL，設(shè)置泵流速3～10mL/min，多糖粗品樣品與分離填料柱體積之比為1:5～1:10，進(jìn)樣完畢后吸附0-10min，洗脫溶劑體積為1.5～5倍柱體積，收集水相冷凍干燥。

本發(fā)明提供的另一些較佳實施方案是本發(fā)明的何首烏脫色多糖的制備方法，包括以下步驟：

(1)將何首烏多糖粗品和蒸餾水按照質(zhì)量(g)體積(mL)比為1:20-1:10的比例溶解，并過濾，配制成濃度為0.05～0.1g/mL的多糖粗品水溶液；

(2)以粒徑為50～70μm的聚甲基丙烯酸酯類MCI GEL反相精細(xì)分離填料為柱填料，以水為洗脫溶劑，柱體積為400～1000mL，設(shè)置泵流速3～10mL/min，多糖粗品樣品與分離填料柱體積之比為1:5～1:10，進(jìn)樣完畢后吸附0-10min，洗脫溶劑體積為1.5～5倍柱體積，收集水相冷凍干燥。

(3)用選自甲醇、丙酮或異丙醇中一種或多種的有機(jī)相沖洗分離柱，有機(jī)相體積為3～10倍柱體積，再用水相置換有機(jī)相，平衡分離柱，重復(fù)步驟(2)。

本發(fā)明提供的何首烏脫色多糖制備方法，采用聚甲基丙烯酸酯類MCI GEL反相精細(xì)分離填料為柱填料，中低壓加壓系統(tǒng)分離，常溫下即可快速連續(xù)地實現(xiàn)何首烏多糖的脫色純化，不破壞何首烏多糖的結(jié)構(gòu)和活性，脫色時間短，最大處理濃度可達(dá)0.2g/mL，進(jìn)樣量大，經(jīng)有機(jī)相沖洗分離柱后，可用水相置換有機(jī)相，平衡柱子后進(jìn)行新一輪的多糖分離制備，實現(xiàn)了多糖的中小批量連續(xù)制備，大大提高了多糖樣品的處理量，純化脫色效率高。本發(fā)明提供的快速制備方法制備的何首烏多糖，脫色后多糖含量提高至85％以上，保留率超過90％，產(chǎn)品外觀由脫色前的棕色變?yōu)槊撋蟮幕野咨?，純化脫色效果明顯。此外，本發(fā)明制備的多糖全部來源于水相洗脫部分，并直接通過冷凍干燥除去水分，避免了常規(guī)脫色方法中可能帶來的活性炭或有機(jī)溶劑殘留的問題，不僅簡便了后續(xù)處理步驟，而且保證了多糖產(chǎn)品的安全性。

術(shù)語解釋

本發(fā)明所述的何首烏多糖粗品是指以生何首烏藥材飲片為原料，通過傳統(tǒng)水提醇沉法制備的粗多糖或水提法制備的何首烏多糖提取液。例如采用傳統(tǒng)水提醇沉法，以生何首烏藥材飲片為原料，將除去雜質(zhì)的何首烏粉碎，先用石油醚脫脂，再用蒸餾水提取，最后加入乙醇醇沉，取沉淀得到何首烏粗多糖；或者以生何首烏藥材飲片為原料，將除去雜質(zhì)的何首烏粉碎，先用石油醚脫脂，再用蒸餾水提取，將提取液直接濃縮獲得何首烏多糖提取液。

本發(fā)明所述的何首烏多糖粗品樣品是指與水配制成合適濃度的多糖粗品水溶液。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)闡述，但本發(fā)明不限于這些實施例。本文中使用的試劑和原料均為商購所得。

實施例1何首烏多糖粗品的制備

步驟A脫脂：以生何首烏藥材飲片為原料，將除去雜質(zhì)的何首烏粉碎，經(jīng)100目鐵篩過篩，收集過篩的原料粉末用石油醚以體積比為1:8，在90℃水浴環(huán)境中提取0.5h，過濾，取濾渣重復(fù)石油醚脫脂2次；收集脫脂后的濾渣，揮干表面有機(jī)溶劑得到脫脂處理的何首烏藥材原料。

步驟B提?。簩⒉襟EA獲得的脫脂處理的何首烏藥材原料和蒸餾水按照質(zhì)量(g)體積(mL)料液比1:6，85℃下，在多功能提取罐中進(jìn)行提取，提取2h，過濾，濾渣重復(fù)提取3次。收集并合并提取液，濃縮至原體積的1/10獲得何首烏多糖提取液。

實施例2何首烏多糖粗品的制備

步驟A脫脂：同實施例1步驟A的方法獲得脫脂處理的何首烏藥材原料。

步驟B提?。簩⒉襟EA獲得的脫脂處理的何首烏藥材原料和蒸餾水按照質(zhì)量(g)體積(mL)料液比1:6，85℃下在多功能提取罐中進(jìn)行提取2h，過濾，濾渣重復(fù)提取2次，收集并合并提取液，濃縮至原體積的1/10。

步驟C醇沉：將步驟B獲得的何首烏多糖濃縮液冷卻至室溫后，加入4倍體積的無水乙醇，4℃靜置24h，離心30min，轉(zhuǎn)速3000r/min，取沉淀真空干燥，得到何首烏粗多糖。

采用苯酚-硫酸法測量實施例1-2制備的何首烏中多糖含量范圍為30％-60％。

實施例3何首烏脫色多糖的制備

將實施例1獲得的何首烏多糖提取液或?qū)嵤├?獲得的何首烏粗多糖和蒸餾水按照質(zhì)量(g)體積(mL)比1:20溶解，過濾，取濾液作為進(jìn)樣樣品。

以400mL 50～70μm的聚甲基丙烯酸酯類MCI GEL反相精細(xì)分離填料為柱填料，以水為洗脫溶劑。取80mL進(jìn)樣樣品以1.0mL/min的速度泵入分離柱中，進(jìn)樣完畢后吸附10min，調(diào)整泵流速為10mL/min，待柱壓穩(wěn)定后，用5倍柱體積水相洗脫，設(shè)置餾分收集器每5min收集一管，采用苯酚-硫酸法逐管檢測，收集呈陽性反應(yīng)者。濃縮并冷凍干燥得到何首烏脫色多糖，產(chǎn)品為灰白色。

實施例4何首烏脫色多糖的制備

將實施例1獲得的何首烏多糖提取液或?qū)嵤├?獲得的何首烏粗多糖和蒸餾水按照質(zhì)量(g)體積(mL)比1:15溶解，過濾，取濾液作為進(jìn)樣樣本。

以1000mL 50～70μm的聚甲基丙烯酸酯類MCI GEL反相精細(xì)分離填料為柱填料，以水為洗脫溶劑。將125mL進(jìn)樣樣品以3.0mL/min的速度泵入分離柱中，進(jìn)樣完畢后吸附10min，調(diào)整泵流速為3.0mL/min，待柱壓穩(wěn)定后，用1.5倍柱體積水相洗脫，設(shè)置餾分收集器每5min收集一管，采用苯酚-硫酸法逐管檢測，收集呈陽性反應(yīng)者，，冷凍干燥得到何首烏脫色多糖，產(chǎn)品為灰白色。

實施例5何首烏脫色多糖的制備

將實施例1獲得的何首烏多糖提取液或?qū)嵤├?獲得的何首烏粗多糖和蒸餾水按照質(zhì)量(g)體積(mL)比1:10溶解，過濾，取濾液作為進(jìn)樣樣本。

以600mL 50～70μm的聚甲基丙烯酸酯類MCI GEL反相精細(xì)分離填料為柱填料，以水為洗脫溶劑。將60mL進(jìn)樣樣本以1.0mL/min的速度泵入分離柱中，進(jìn)樣完畢后靜態(tài)吸附5min，調(diào)整泵流速為5.0mL/min，待柱壓穩(wěn)定后，先以3倍柱體積蒸餾水洗脫，收集水相部分濃縮，冷凍干燥得到何首烏脫色多糖，產(chǎn)品為灰白色。

繼續(xù)用3倍柱體積的甲醇沖洗分離柱，換水相置換出分離柱的甲醇，平衡分離柱后，取60mL進(jìn)樣樣品以2.0mL/min的速度泵入分離柱中，進(jìn)樣完畢后靜態(tài)吸附10min，調(diào)整泵流速為8.0mL/min，待柱壓穩(wěn)定后，以3倍柱體積蒸餾水洗脫，收集水相部分濃縮，冷凍干燥得到何首烏脫色多糖，產(chǎn)品為灰白色。

實施例6何首烏脫色多糖的制備

將實施例1獲得的何首烏多糖提取液或?qū)嵤├?獲得的何首烏粗多糖和蒸餾水按照質(zhì)量(g)體積(mL)比1:10溶解，過濾，取濾液作為進(jìn)樣樣本。

以1000mL 50～70μm的聚甲基丙烯酸酯類MCI GEL反相精細(xì)分離填料為柱填料，以水為洗脫溶劑。將50mL進(jìn)樣樣本以1.0mL/min的速度泵入分離柱中，進(jìn)樣完畢后靜態(tài)吸附5min，調(diào)整泵流速為10.0mL/min，待柱壓穩(wěn)定后，以1倍柱體積蒸餾水洗脫，收集水相部分濃縮，冷凍干燥得到何首烏脫色多糖，產(chǎn)品為灰白色。

繼續(xù)用2倍柱體積的丙酮沖洗分離柱，換水相置換出分離柱的丙酮，平衡分離柱后，取75mL進(jìn)樣樣品以3.0mL/min的速度泵入分離柱中，進(jìn)樣完畢后靜態(tài)吸附10min，調(diào)整泵流速為10.0mL/min，待柱壓穩(wěn)定后，以3倍柱體積蒸餾水洗脫，收集水相部分濃縮，冷凍干燥得到何首烏脫色多糖，產(chǎn)品為灰白色。

繼續(xù)用2倍柱體積的異丙醇沖洗分離柱，換水相置換出分離柱的異丙醇，平衡分離柱后，取50mL進(jìn)樣樣品以2.0mL/min的速度泵入分離柱中，進(jìn)樣完畢后靜態(tài)吸附10min，調(diào)整泵流速為5.0mL/min，待柱壓穩(wěn)定后，以2倍柱體積蒸餾水洗脫，收集水相部分濃縮，冷凍干燥得到何首烏脫色多糖，產(chǎn)品為灰白色。

實施例1-6制備得到的何首烏脫色多糖均為灰白色，經(jīng)苯酚-硫酸法檢測多糖含量范圍85-90％，多糖保留率90％以上。