本發(fā)明涉及煙用添加劑領(lǐng)域，具體涉及利用固定化酵母菌制備煙用楊梅提取物的制備方法。
背景技術(shù)：
加香加料是卷煙工藝中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是完善產(chǎn)品風(fēng)格的決定因素和提高卷煙香氣質(zhì)量的有效手段之一。目前煙用香精香料主要還是通過對(duì)天然動(dòng)植物的提取、化學(xué)合成制備。由于受到天然植物資源有限以及化學(xué)合成條件較苛刻限制。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，近年來，利用微生物發(fā)酵法制備煙用香原料，為煙用香原料的生產(chǎn)提供一條經(jīng)濟(jì)、高效的途徑，開發(fā)一些傳統(tǒng)方法無法生產(chǎn)的新型煙用香原料。
微生物固定化技術(shù)，是將特選的微生物固定在選證的載體上，使其高度密集并保持生物活性，在適應(yīng)條件下能夠快速、大量增殖的生物技術(shù)，能夠彌補(bǔ)懸浮微生物發(fā)酵處理效率低、固液分離困難、抗毒性差等缺點(diǎn)。因此，近年來，微生物固定化技術(shù)的研究非?；钴S，發(fā)展較快，已應(yīng)用到許多工業(yè)部門如食品發(fā)酵工業(yè)，環(huán)境保護(hù)，新能源開發(fā)以及生物傳感器等，并取得了深入發(fā)展，顯示出了強(qiáng)大的優(yōu)越性。主要涉及到以下幾個(gè)方面：在食品發(fā)酵工業(yè)中用于生產(chǎn)乙醇、啤酒、酸奶等；在環(huán)境保護(hù)中用于環(huán)境監(jiān)測和工業(yè)廢水的處理；在新能源開發(fā)中用于生產(chǎn)氫氣、甲烷、生化電池、微生物電池等；固定化微生物還可作為分子識(shí)別元件，用于制作各種生物傳感器。而隨著固定微生物技術(shù)的不斷成熟、完善，逐漸向高效低能耗、低成本、簡單化、安全自動(dòng)化、無污染等方向發(fā)展，在能源危機(jī)、資源短缺、環(huán)境污染日趨嚴(yán)重的情況下，由此將推動(dòng)其在廢水處理方面更加深入和廣泛的應(yīng)用，具有更加深遠(yuǎn)的意義。尤其在廢水處理方面，具有很大的應(yīng)用前景。但在利用微生物固定化技術(shù)制備煙用楊梅提取物卻未見報(bào)道。
楊梅(學(xué)名：myricarubra(lour.)s.etzucc.)是楊梅科楊梅屬小喬木或灌木植物，又稱圣生梅、白蒂梅、樹梅，具有極高的藥用和食用價(jià)值，在中國華東、湖南、廣東、廣西、貴州等地均有分布。以楊梅為原料的楊梅浸膏和楊梅提取物在卷煙中應(yīng)用也較廣泛，在卷煙中具有豐富煙香、增加特征楊梅香韻等作用。
酵母菌是一些單細(xì)胞真菌，是子囊菌、擔(dān)子菌等幾科單細(xì)胞真菌的通稱，一般泛指能發(fā)酵糖類的真菌，可用于釀造生產(chǎn)，該菌在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生乙酸乙酯、苯乙醇等香氣物質(zhì)，這些香氣物質(zhì)能夠賦予卷煙特征的甜香香氣，是一種生產(chǎn)煙用香料的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)香菌。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種固定化酵母菌制備煙用楊梅提取物的方法，利用固定化微生物技術(shù)，開發(fā)了一種新型的楊梅提取物。
一種固定化酵母菌制備煙用楊梅提取物的方法，包括以下步驟：
(1)取新鮮楊梅，去除果核，榨汁，121℃下滅菌20min，冷卻，過濾得到楊梅汁；
(2)酵母菌菌懸液配制：將酵母菌接種到肉湯培養(yǎng)基中，在溫度37℃、攪拌轉(zhuǎn)速為50rpm的條件下培養(yǎng)48h，取培養(yǎng)液于8000rpm下離心，離心后的濕菌體備用；
(3)酵母菌的海藻酸鈉-cacl2固定化：配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％～6％的海藻酸鈉溶液，然后加入其體積的3％～5％的所述步驟(2)中制備的酵母菌濕菌體，配制成混合液，用蠕動(dòng)泵經(jīng)過1～5mm孔徑的針頭將配制好的混合液逐滴加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％～6％的cacl2溶液中，成球，并將cacl2溶液和小球保存于-4℃條件下12～24h，取出小球，用無菌水沖洗，烘干備用；
(4)將楊梅汁與步驟(3)中制備的固定化酵母菌小球按照質(zhì)量比2:1～5:1混合，在溫度為20～25℃，攪拌轉(zhuǎn)速為1～5rpm的條件下發(fā)酵48～96h；然后置于4℃冷柜中保存7～14d，然后于常溫下放置12～24h；
(5)將步驟(4)發(fā)酵后發(fā)酵液過濾，得澄清發(fā)酵液，加入其質(zhì)量2～4倍的80％～95％酒精溶液，沉淀24～48h，過濾取上清液減壓濃縮至相對(duì)密度為1.15～1.20，得楊梅提取物。
本發(fā)明中采用的酵母菌為釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)hhl-1，于2009年11月20日保藏于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctccno:m209272。
進(jìn)一步的，所述步驟(2)中肉湯培養(yǎng)基的具體配方為(每升)：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g，最終ph7.3±0.1。
進(jìn)一步的，所述步驟(5)中減壓濃縮的條件：濃縮壓力0.1mpa，濃縮溫度55℃。
本發(fā)明采用的微生物固定化技術(shù)具有發(fā)酵處理效率高、固液分離容易、抗毒性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)生物工藝的不足。
本發(fā)明以楊梅為原料，利用固定化酵母菌發(fā)酵楊梅提取物，獲得了一種品質(zhì)優(yōu)良的煙用楊梅提取物，該提取物在卷煙中具有豐富煙香，透發(fā)煙香，增加果甜香韻，增加煙氣生津感，柔和細(xì)膩煙氣，減輕喉部刺激性等作用。與現(xiàn)有楊梅浸膏和楊梅提取物相比，該楊梅提取物在卷煙中香氣更加豐富，果香韻和甜香韻更加明顯，香氣透發(fā)性較好，刺激性降低；與懸浮酵母菌發(fā)酵相比，該方法制備的楊梅提取物中酯類香氣物質(zhì)含量增加了10.28％～15.69％，苯乙醇含量增加了22.19％～28.95％，卷煙效果評(píng)價(jià)中，香氣更加豐富，楊梅特征香韻更加明顯。該方法替代了楊梅提取物傳統(tǒng)的提取技術(shù)，更新了生物發(fā)酵制備工藝，使得其能夠在卷煙中適用性增加，對(duì)煙用楊梅提取物的制備提供了一條新途徑。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)的描述。
實(shí)施例1
(1)取新鮮楊梅，去除果核，榨汁，121℃下滅菌20min，冷卻，過濾得到楊梅汁；
(2)酵母菌菌懸液配制：將酵母菌接種到肉湯培養(yǎng)基中，肉湯培養(yǎng)基的具體配方為(每升)：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g，最終ph7.3±0.1，在溫度37℃、攪拌轉(zhuǎn)速為50rpm的條件下培養(yǎng)48h，取培養(yǎng)液于8000rpm下離心，離心后的濕菌體備用；
(3)酵母菌的海藻酸鈉-cacl2固定化：配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的海藻酸鈉溶液，然后加入其體積的3％的所述步驟(2)中制備的酵母菌濕菌體，配制成混合液，用蠕動(dòng)泵經(jīng)過1mm孔徑的針頭將配制好的混合液逐滴加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％的cacl2溶液中，成球，并將cacl2溶液和小球保存于-4℃條件下16h，取出小球，用無菌水沖洗，烘干備用；
(4)將楊梅汁與步驟(3)中制備的固定化酵母菌小球按照質(zhì)量比2:1混合，在溫度為20℃，攪拌轉(zhuǎn)速為5rpm的條件下發(fā)酵50h；然后置于4℃冷柜中保存8d，然后于常溫下放置12h；
(5)將步驟(4)發(fā)酵后發(fā)酵液過濾，得澄清發(fā)酵液，加入其質(zhì)量2倍的80％酒精溶液，沉淀28h，過濾取上清液，在壓力0.1mpa，溫度55℃下將其減壓濃縮至相對(duì)密度為1.15，得楊梅提取物。
實(shí)施例2
(1)取新鮮楊梅，去除果核，榨汁，121℃下滅菌20min，冷卻，過濾得到楊梅汁；
(2)酵母菌菌懸液配制：將酵母菌接種到肉湯培養(yǎng)基中，肉湯培養(yǎng)基的具體配方為(每升)：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g，最終ph7.3±0.1，在溫度37℃、攪拌轉(zhuǎn)速為50rpm的條件下培養(yǎng)48h，取培養(yǎng)液于8000rpm下離心，離心后的濕菌體備用；
(3)酵母菌的海藻酸鈉-cacl2固定化：配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的海藻酸鈉溶液，然后加入其體積的4％的所述步驟(2)中制備的酵母菌濕菌體，配制成混合液，用蠕動(dòng)泵經(jīng)過3mm孔徑的針頭將配制好的混合液逐滴加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的cacl2溶液中，成球，并將cacl2溶液和小球保存于-4℃條件下20h，取出小球，用無菌水沖洗，烘干備用；
(4)將楊梅汁與步驟(3)中制備的固定化酵母菌小球按照質(zhì)量比3:1混合，在溫度為24℃，攪拌轉(zhuǎn)速為4rpm的條件下發(fā)酵60h；然后置于4℃冷柜中保存10d，然后于常溫下放置18h；
(5)將步驟(4)發(fā)酵后發(fā)酵液過濾，得澄清發(fā)酵液，加入其質(zhì)量3倍的85％酒精溶液，沉淀30h，過濾取上清液，在壓力0.1mpa，溫度55℃下將其減壓濃縮至相對(duì)密度為1.18，得楊梅提取物。
實(shí)施例3
(1)取新鮮楊梅，去除果核，榨汁，121℃下滅菌20min，冷卻，過濾得到楊梅汁；
(2)酵母菌菌懸液配制：將酵母菌接種到肉湯培養(yǎng)基中，肉湯培養(yǎng)基的具體配方為(每升)：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g，最終ph7.3±0.1，在溫度37℃、攪拌轉(zhuǎn)速為50rpm的條件下培養(yǎng)48h，取培養(yǎng)液于8000rpm下離心，離心后的濕菌體備用；
(3)酵母菌的海藻酸鈉-cacl2固定化：配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的海藻酸鈉溶液，然后加入其體積的5％的所述步驟(2)中制備的酵母菌濕菌體，配制成混合液，用蠕動(dòng)泵經(jīng)過4mm孔徑的針頭將配制好的混合液逐滴加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6％的cacl2溶液中，成球，并將cacl2溶液和小球保存于-4℃條件下24h，取出小球，用無菌水沖洗，烘干備用；
(4)將楊梅汁與步驟(3)中制備的固定化酵母菌小球按照質(zhì)量比5:1混合，在溫度為25℃，攪拌轉(zhuǎn)速為1rpm的條件下發(fā)酵96h；然后置于4℃冷柜中保存14d，然后于常溫下放置24h；
(5)將步驟(4)發(fā)酵后發(fā)酵液過濾，得澄清發(fā)酵液，加入其質(zhì)量4倍的90％酒精溶液，沉淀40h，過濾取上清液，在壓力0.1mpa，溫度55℃下將其減壓濃縮至相對(duì)密度為1.20，得楊梅提取物。
上述實(shí)施例中制備的楊梅提取物具有豐富煙香，提升卷煙香氣質(zhì)量，增加卷煙香氣透發(fā)性，增加煙氣生津感，增加煙氣甜潤感，柔和細(xì)膩煙氣，降低刺激性，改善喉部舒適性，掩蓋雜氣，改善余味等作用。
對(duì)比實(shí)驗(yàn)，申請(qǐng)人將本發(fā)明制備的楊梅提取物與現(xiàn)有傳統(tǒng)提取方法制備的楊梅提取物、采用懸浮酵母菌發(fā)酵制備的楊梅提取物按照正常加香方式添加到煙絲中，制成卷煙，并進(jìn)行評(píng)吸，其評(píng)吸效果如表1所示：
表1三種不同工藝制備的楊梅提取物在卷煙中的感官評(píng)價(jià)效果比較
從上述對(duì)比實(shí)驗(yàn)可以看出來，本發(fā)明中制備的楊梅提取物添加到卷煙中效果更好，而且根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，與懸浮酵母菌發(fā)酵相比，該方法制備的楊梅提取物中酯類香氣物質(zhì)含量增加了10.28％～～15.69％，苯乙醇含量增加了22.19％～28.95％，卷煙效果評(píng)價(jià)中，香氣更加豐富，楊梅特征香韻更加明顯。
以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述，并不以此限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的設(shè)計(jì)思路上所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。