本發(fā)明涉及高純度還原型谷胱甘肽純化方法以及從酵母細(xì)胞中制備高純度還原型谷胱甘肽的工藝。屬于生物工程和藥物化合物領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

還原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)作為一種重要的藥物試劑，在臨床上主要用于化療、低氧血癥、肝臟疾病、有機(jī)磷、胺基或硝基化合物中毒的治療和輔助治療；同時谷胱甘肽的抗氧化性能又使得它在食品和化妝品加工業(yè)中作為添加劑而受到青睞。市場上用于銷售的產(chǎn)品主要包括：保肝護(hù)肝藥谷胱甘肽片(阿拓莫蘭)，治療中毒性肝損傷藥物雙益健(注射用還原型谷胱甘肽)，谷胱甘肽全身美白乳，谷胱甘肽祛斑精華等醫(yī)藥產(chǎn)品及化妝品。2015年，GSH國內(nèi)外市場每年以10％的速度遞增。日本Kyowa(協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社)和Ajinomoto(味之素株式會社)等公司早在20世紀(jì)80年代就實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化酵母發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的產(chǎn)業(yè)化，現(xiàn)已成為全世界谷胱甘肽的主要生產(chǎn)和供應(yīng)商，同時形成了技術(shù)壁壘。國內(nèi)山東金城醫(yī)藥化工股份有限公司引進(jìn)日本谷胱甘肽純化技術(shù)，成為國內(nèi)首家從酵母中生產(chǎn)谷胱甘肽的公司。

谷胱甘肽來源于動物、植物、微生物及化學(xué)合成。其中以酵母、小麥胚芽中的含量最為豐富。谷胱甘肽的純化方法主要包括離子交換法、電滲析法和雙水相法等，諸如此類方法多受限于谷胱甘肽的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性，導(dǎo)致純化倍數(shù)低、工藝流程繁雜、生產(chǎn)成本高。因此，開發(fā)低成本、可工業(yè)化的還原型谷胱甘肽純化工藝，對谷胱甘肽在食藥領(lǐng)域相關(guān)產(chǎn)品的研制尤為重要。同時為制定《富營養(yǎng)素酵母》國家標(biāo)準(zhǔn)編制提供理論和實(shí)踐參考。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，提供一種從酵母細(xì)胞中制備高純度還原型谷胱甘肽的方法，該方法能夠高效、低成本的應(yīng)用在酵母細(xì)胞生產(chǎn)谷胱甘肽的工業(yè)化，為食藥領(lǐng)域提供高純度還原型谷胱甘肽原料。同時為制定《富營養(yǎng)素酵母》國家標(biāo)準(zhǔn)編制提供理論和實(shí)踐參考。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種從酵母細(xì)胞中制備高純度還原型谷胱甘肽的方法，包括以下步驟：

(1)富含還原型谷胱甘肽酵母細(xì)胞的制備：以酵母細(xì)胞發(fā)酵法生產(chǎn)還原型谷胱甘肽，以酵母細(xì)胞干重計算，GSH含量為1-5％，富含還原型谷胱甘肽酵母細(xì)胞，包括：酵母乳、酵母干粉、酵母抽提物等形式。

(2)酵母細(xì)胞熱提取：取一定質(zhì)量的酵母細(xì)胞，以5-15倍，優(yōu)選為10倍體積的去離子水懸浮。調(diào)節(jié)pH值為2.0，在80-100℃，優(yōu)選為85-90℃下，攪拌0-30分鐘，優(yōu)選為5-15分鐘。完成后迅速置于冰水中冷卻至20℃以下，3000-10000rpm/min，優(yōu)選為7500rpm/min下離心10-30分鐘，優(yōu)選為15分鐘。除去沉淀物，留存輕相。

(3)GSH-Cu絡(luò)合物的制備：利用HPLC技術(shù)檢測步驟2)輕相中GSH的含量。在10-100rpm/min，優(yōu)選為50rpm/min攪拌狀態(tài)下，用NaOH調(diào)節(jié)輕相pH值為5.0-7.0，優(yōu)選為6.0。根據(jù)輕相中GSH的摩爾質(zhì)量，按照1:1-1:20，優(yōu)選為1:2-1:15的配比，添加CuSO₄。維持?jǐn)嚢?5-60分鐘，優(yōu)選為30分鐘。3000-10000rpm/min，優(yōu)選為7500rpm/min下離心20-40分鐘，優(yōu)選為30分鐘。留存重相。

(4)洗滌：取一定質(zhì)量的GSH-Cu絡(luò)合物，以100-200倍，優(yōu)選為150倍體積的純化水懸浮，維持?jǐn)嚢?0-40分鐘，優(yōu)選為30分鐘。3000-10000rpm/min，優(yōu)選為7500rpm/min下離心20-40分鐘，優(yōu)選為30分鐘。留存重相。

(5)解絡(luò)合：取一定質(zhì)量的GSH-Cu絡(luò)合物，以2-10倍，優(yōu)選為4倍體積的純化水懸浮，維持?jǐn)嚢?。通入H₂S氣體維持5分鐘。3000-10000rpm/min，優(yōu)選為7500rpm/min下離心10-30分鐘，優(yōu)選為15分鐘。除去沉淀物，留存輕相。通入的H₂S氣體包括：純凈H₂S氣體，或富含高濃度H₂S成分的工業(yè)甲烷廢氣，或在酸性條件下易產(chǎn)生H₂S的無機(jī)和有機(jī)鹽，如(NH₄)₂S，Na₂S等。

(6)脫色：步驟(5)中輕相用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2.0，按照5‰的比例加入活性炭，維持?jǐn)嚢璺磻?yīng)時間20-60分鐘，優(yōu)選為30分鐘。反應(yīng)完成后，用0.25μm濾膜過濾除去活性炭，留存濾液。

(7)濃縮：步驟(6)中濾液，通過減壓濃縮，得到含有500-1000g/L谷胱甘肽濃度的谷胱甘肽溶液，優(yōu)選濃度為800g/L。

(8)重結(jié)晶：維持?jǐn)嚢瑁诓襟E(7)中含谷胱甘肽溶液中，加入等量體積的50-80％(v/v)濃度的乙醇水溶液，優(yōu)選70％的乙醇水溶液，在-4-20℃，優(yōu)選為4℃，添加谷胱甘肽結(jié)晶作為晶種。晶種的添加量為20-200mg/L，優(yōu)選為50mg/L。繼續(xù)攪拌30分鐘后，停止攪拌，維持溫度6-20小時，優(yōu)選為12小時。得結(jié)晶漿液，過濾得高純度還原型谷胱甘肽物質(zhì)，還原型谷胱甘肽純度>98％。

本發(fā)明將制備出來的還原型谷胱甘肽用于醫(yī)藥試劑、食品和化妝品添加劑。

附圖說明

圖1是GSH-金屬絡(luò)合物的篩選結(jié)果。

圖2是酵母細(xì)胞90℃下熱水(pH 2.0)浸提15分鐘后水相HPLC圖譜。

圖3是酵母浸提液經(jīng)Cu²⁺絡(luò)合后輕相HPLC圖譜。

圖4是GSH-Cu絡(luò)合物水洗后輕相HPLC圖譜。

圖5是絡(luò)合物解絡(luò)合后輕相HPLC圖譜。

圖6是絡(luò)合物解絡(luò)合后輕相經(jīng)凍干后所得成分¹H NMR圖譜(400MHz,D₂O)。

圖7是絡(luò)合物解絡(luò)合后輕相經(jīng)凍干后所得成分¹³C NMR圖譜(400MHz,D₂O)。

圖8是重結(jié)晶后所得成分¹H NMR圖譜(400MHz,D₂O)。

圖9是重結(jié)晶后所得成分¹³C NMR圖譜(400MHz,D₂O)。

圖10是還原型GSH粗產(chǎn)品與重結(jié)晶產(chǎn)品外觀，其中，左上角是純度>98％的重結(jié)晶產(chǎn)品，右方是純度>90％的粗產(chǎn)品。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

(1)酵母細(xì)胞中GSH的提取

稱取酵母乳100.0g，加純水900mL，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2.0，90℃水浴浸提15min，再攪拌5min，迅速至于冰浴中冷卻至室溫。以7500r/min離心15min，留存上清液。

(2)GSH-Cu絡(luò)合物的制備

上述步驟中的酵母提取液400mL，用NaOH調(diào)節(jié)pH值為6.0，按GSH與CuSO₄·5H₂O摩爾質(zhì)量比為1:15加入CuSO₄·5H₂O進(jìn)行絡(luò)合，維持?jǐn)嚢?，?500r/min離心30min，得沉淀約500mg。

(3)洗滌

將上述步驟中的沉淀水洗3次，以150倍體積的純化水懸浮，維持?jǐn)嚢?0分鐘后，7500rpm/min下離心30分鐘。留存重相。

(4)解絡(luò)合

將上述步驟中水洗后的沉淀，加入2L水懸浮，通入H₂S氣體，維持?jǐn)嚢?分鐘，7500rpm/min下離心15分鐘。除去沉淀物，留存輕相。利用分光光度計檢測OD600值為0.022。利用HPLC技術(shù)對水相進(jìn)行定性、定量分析，還原型谷胱甘肽純度為90.5％。

(5)脫色

將上述步驟中輕相用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2.0，按照5‰的比例加入活性炭，維持?jǐn)嚢璺磻?yīng)時間30分鐘。反應(yīng)完成后，用0.25μm濾膜過濾除去活性炭，留存濾液。利用分光光度計檢測OD600值為0.002，脫色效果顯著。還原型谷胱甘肽絕對含量未發(fā)生顯著變化，還原型谷胱甘肽純度為89.4％。

(6)濃縮

將上述步驟中的水相通過減壓濃縮，得到濃度為800g/L的谷胱甘肽溶液。

(7)重結(jié)晶

維持?jǐn)嚢瑁谏鲜霾襟E中含谷胱甘肽溶液中，加入等量體積的70％(v/v)濃度的乙醇水溶液，在4℃，添加谷胱甘肽結(jié)晶作為晶種。晶種的添加量為50mg/L。繼續(xù)攪拌30分鐘后，停止攪拌，維持溫度12小時。得結(jié)晶漿液，過濾得高純度還原型谷胱甘肽物質(zhì)。還原型谷胱甘肽純度為98.5％。

圖1是GSH-金屬絡(luò)合物的篩選結(jié)果。圖中顯示Cu²⁺與GSH形成白色絡(luò)合物沉淀，而KMnO₄對GSH發(fā)生了氧化作用，生成褐色氧化產(chǎn)物。

圖4是GSH-Cu絡(luò)合物水洗后輕相HPLC圖譜。圖中顯示經(jīng)過2次洗滌后絕大部分水溶性雜質(zhì)被洗脫掉，且洗脫液中未檢出還原型GSH。

圖5是絡(luò)合物解絡(luò)合后輕相HPLC圖譜(還原型谷胱甘肽純度>90％，低峰線是還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品混合樣)。