一種脂肪酶l-1及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬生物化工和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種脂肪酶L-I及其編碼基因和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙酸肉桂醋是從肉桂中提取出的香料成分之一，是我國(guó)規(guī)定可使用的香料。大多 數(shù)乙酸肉桂醋是用化學(xué)方法合成的，只有少量是從天然植物中提取的?；瘜W(xué)法對(duì)條件的要 求高，需要在高溫高壓下完成，設(shè)備的消耗和能耗高，而且合成過(guò)程中會(huì)有多種副產(chǎn)物產(chǎn) 生，后續(xù)提取工藝復(fù)雜，對(duì)環(huán)境污染大。作為生物催化劑的酶具有反應(yīng)條件溫和、專(zhuān)一性高、 副產(chǎn)物少、環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)，可W克服上述化學(xué)法合成的缺點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于化工、 制藥、造紙、皮革、化妝品、食品等領(lǐng)域。
[000引脂肪酶（Lipase,EC3. 1. 1. 3)，又叫作立酷甘油水解酶，是一類(lèi)能夠?qū)⒘⒖岣视退?解為甘油和脂肪酸的酶，其來(lái)源非常廣泛，微生物、植物和動(dòng)物中都有存在。脂肪酶作為生 物催化劑多數(shù)可作用非天然底物，而且可拆分的底物多，立體選擇性高，不需要輔助因子， 是一種重要的手性催化劑。對(duì)脂肪酶研究的初期，其來(lái)源主要是動(dòng)植物，但動(dòng)植物來(lái)源的脂 肪酶原料來(lái)源受到很大限制，不能滿(mǎn)足工業(yè)需要，人們更多地將目光投向微生物，開(kāi)始尋找 微生物來(lái)源的脂肪酶，W滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的需求。已知能夠產(chǎn)生脂肪酶的微生物種類(lèi)繁多，細(xì) 菌、霉菌、放線(xiàn)菌中均有很多菌種可產(chǎn)生脂肪酶，微生物來(lái)源的脂肪酶的使用抑、溫度比動(dòng) 植物來(lái)源要更廣泛。1984年，Zaks發(fā)現(xiàn)酶在有機(jī)相中也具有催化活性，改變了 "酶只能在 水相中進(jìn)行催化"的傳統(tǒng)觀(guān)念，開(kāi)啟了非水相酶學(xué)的時(shí)代，并迅速成為應(yīng)用酶學(xué)研究中最活 躍，發(fā)展最為迅速的領(lǐng)域，酶的應(yīng)用范圍也得到了極大擴(kuò)展。海洋面積迂闊，蘊(yùn)藏著豐富的 微生物資源，對(duì)海洋的開(kāi)發(fā)也極大地?cái)U(kuò)展了人們獲取脂肪酶的手段和范圍。
[0004] 但是，大多數(shù)在工業(yè)中應(yīng)用的脂肪酶都是源于進(jìn)口，比如NovoNordisk公司的 月旨肪酉每Novozym435 (來(lái)自Candida曰nt曰rctic曰），Am曰noPh曰rm曰ceutic曰1公司的Lip曰se PS(來(lái)自Burkholderi曰cep曰Ci曰），F(xiàn)luk曰公司的Lip曰SeA(來(lái)自Candida曰nt曰rctic曰）等 等。運(yùn)些脂肪酶價(jià)格昂貴，生產(chǎn)技術(shù)受到制約，因此開(kāi)發(fā)具有自主產(chǎn)權(quán)的脂肪酶十分必要。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中脂肪酶價(jià)格昂貴、生產(chǎn)技術(shù)受到制約的不足，提 供一種新的脂肪酶L-I及其編碼基因和應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明從放線(xiàn)菌（Str巧tomycessp.)SCSIO13580中開(kāi)發(fā)了一種新的脂肪酶 及其編碼基因脂肪酶基因^1，構(gòu)建了含有脂肪酶基因1-1的重組表達(dá)載體和基因工程菌， 培養(yǎng)基因工程菌后獲得脂肪酶心1，其可應(yīng)用于催化制備乙酸肉桂醋。
[0007] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種脂肪酶kl，其氨基酸序列如SEQIDN0.2所示。
[0008] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種編碼所述的脂肪酶心1的脂肪酶基因。
[0009] 優(yōu)選，所述的脂肪酶基因1-1的核巧酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0010] 本發(fā)明還提供一種含有所述的脂肪酶基因1-1的重組表達(dá)載體。所述的表達(dá)載 體，優(yōu)選祀T28a(+)載體。
[0011] 本發(fā)明還提供一種含有所述的脂肪酶基因1-1的基因工程菌。所述的基因工程 菌，優(yōu)選大腸桿菌化21 0E3)。
[0012] 本發(fā)明的第S個(gè)目的是提供所述的脂肪酶L-I在制備乙酸肉桂醋中的應(yīng)用。
[0013] 優(yōu)選，其步驟為：取脂肪酶L-I于反應(yīng)介質(zhì)中，再加入肉桂醇和酷基供體，進(jìn)行反 應(yīng)，制備得到乙酸肉桂醋。
[0014] 所述的反應(yīng)介質(zhì)，優(yōu)選為1，4-二氧六環(huán)、四氨巧喃、叔下醇、異丙醇、二氯甲燒、甲 苯、環(huán)己燒、正己燒、正庚燒和異辛燒中的一種。
[0015] 所述的酷基供體，優(yōu)選為乙酸乙締醋、乙酸異丙締醋、乙酸酢、乙酸、乙酸仲下醋和 乙酸乙醋中的一種。
[0016] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供所述的脂肪酶L-I在耐受短鏈醇、控類(lèi)、丙酬、Tween-20或TritonX-IOO環(huán)境下進(jìn)行催化的應(yīng)用。
[0017] 所述的短鏈醇為甲醇、乙醇、異丙醇、叔下醇、異下醇、正戊醇或正己醇；所述的控 類(lèi)為甲苯、1,4-二氧六環(huán)、環(huán)己燒、正庚燒、正辛燒或正癸燒。
[0018] 本發(fā)明的脂肪酶基因1-1來(lái)自放線(xiàn)菌（Str巧tomycesSP.)SCSIO13580,保存在 中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所。本發(fā)明用生物信息學(xué)分析的方法，從基因組測(cè)序的放線(xiàn)菌 (Str巧tomycessp.)SCSIO13580中得到脂肪酶基因，全長(zhǎng)為IOOSbp(從起始密碼子到 終止密碼子），編碼334個(gè)氨基酸；該酶蛋白是一個(gè)全新的脂肪酶，與其它脂肪酶氨基酸序 列的最大相似度為51 %。通過(guò)克隆脂肪酶基因1-1并將其連接表達(dá)載體祀T-28a(+)后轉(zhuǎn) 化大腸桿菌化21 0E3)，培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá)后，得到了重組表達(dá)的脂肪酶kl。脂肪酶作 為催化劑催化肉桂醇和酷基供體進(jìn)行反應(yīng)，制備得到乙酸肉桂醋，獲得的乙酸肉桂醋產(chǎn)率 可達(dá)48. 3%。脂肪酶L-I具有穩(wěn)定性高、催化效率高的優(yōu)點(diǎn)，可用于生物醫(yī)藥、化妝品和精 細(xì)化工等領(lǐng)域。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1是不同酷基長(zhǎng)度的對(duì)硝基苯酪醋對(duì)脂肪酶L-I酶活的影響。
[0020] 圖2是脂肪酶的最適抑及抑穩(wěn)定性，A為最適抑曲線(xiàn)，B為抑穩(wěn)定性曲線(xiàn)。 [002。 圖3是脂肪酶的最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性，A為最適反應(yīng)溫度曲線(xiàn)，B為溫 度穩(wěn)定性曲線(xiàn)。
[0022] 圖4是脂肪酶心1合成乙酸肉桂醋的氣相色譜圖，按照保留時(shí)間先后依次為：1、內(nèi) 標(biāo)十二燒、2、肉桂醇和3、乙酸肉桂醋。
[002引圖5是脂肪酶純化、脫鹽的SDS-PAGE凝膠結(jié)果，其中，1為蛋白分子量標(biāo)記， 2為IPTG誘導(dǎo)前的總蛋白對(duì)照，3為IPTG誘導(dǎo)后的總蛋白對(duì)照，4為IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)胞上 清液，5為儀柱穿透液，6為儀柱純化蛋白，7為脫鹽蛋白（即圖中的脂肪酶蛋白，分子質(zhì)量： 38kD)O
【具體實(shí)施方式】
[0024] W下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[00巧]本發(fā)明的脂肪酶基因1-1來(lái)自于鏈霉菌（Str巧tomycessp. )SCSIO13580,保存 在中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所，該基因也可W通過(guò)人工合成等手段獲得。
[0026] 實(shí)施例1 :脂肪酶基因1-1引物設(shè)計(jì)及開(kāi)放閱讀框邊界確定
[0027] 提取放線(xiàn)菌（Streptomycessp. )SCSIO13580 的基因組DNA，經(jīng) 16SrRNA驗(yàn)證無(wú) 誤后，交至上海美吉生物科技有限公司測(cè)序。利用生物信息學(xué)手段對(duì)基因組進(jìn)行注釋?zhuān)?析其中的脂肪酶基因，確定了其中脂肪酶基因1-1的開(kāi)放閱讀框，其核巧酸序列如SEQID NO. 1所示，全長(zhǎng)為IOOSbp(從起始密碼子到終止密碼子），其編碼的脂肪酶L-I的氨基酸序 列如SEQIDN0.2所示，共334個(gè)氨基酸；該酶蛋白是一個(gè)全新的脂肪酶，與其它脂肪酶氨 基酸序列的最大相似度為51%。根據(jù)分析得到的脂肪酶基因1-1序列，設(shè)計(jì)全長(zhǎng)擴(kuò)增引物 如下：正向引物：5' -CACGGATCCATGAGGATCGATCCGCCCG-3 '，下劃線(xiàn)部分為BamHI酶切位 點(diǎn)；反向引物：5' -CATCTCGAGTTAGGCGGGCTGTGGGGTC-3 '，下劃線(xiàn)部分為HioI酶切位點(diǎn)。 [002引實(shí)施例2 :脂肪酶基因1-1的克隆及載體構(gòu)建
[0029] 2. 1PCR擴(kuò)增
[0030] 將實(shí)施例 1 設(shè)計(jì)的引物（正向引物 5' -CACGGATCCATGAGGATCGATCCGCCCG-3 '，反 向引物5' -CATCTCGAGTTAGGCGGGCTGTGGGGTC-3')送至上海生物工程有限公司合成引物， 合成的引物使用TE稀釋到10yM，提取放線(xiàn)菌（Str巧tomycessp.)SCSIO13580的總DNA 作為DNA模板，建立如表1所示反應(yīng)體系：
[00引]表IPCR反應(yīng)體系
[0032]
[0033] 使用W下PCR擴(kuò)增程序擴(kuò)增脂肪酶基因:a. 95°C變性5min;b. 95°C變性Imin, 55~65°C退火0. 5min，72°C延伸Imin20s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；c. 72°C延伸lOmin，冷卻到 10 °C。
[0034] 將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中，120V電壓下電泳20min，置于凝膠成像系統(tǒng)中觀(guān) 察?；厥?000 bp左右的條帶。PCR產(chǎn)物按照膠回收試劑盒的方法進(jìn)行回收，使用20yL無(wú) 菌水洗脫，得到純化回收的PCR產(chǎn)物。
[0035] 2. 2 酶切
[0036] 將純化回收的PCR產(chǎn)物使用W下體系進(jìn)行雙酶切，酶切時(shí)間Ih。酶切體系為：BamH 11y以化〇11yLDNA<0. 3yg，滅菌的雙蒸水加至30yL。酶切后純化回收得到經(jīng)過(guò)雙酶切 的PCR產(chǎn)物。
[0037]質(zhì)粒祀T-28a(+)的雙酶切：挑取含有該質(zhì)粒的大腸桿菌D冊(cè)a單菌落，過(guò)夜培養(yǎng)。 使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，用BamHI和化Ol按W下體系雙酶切酶切，酶切時(shí)間Ih。酶 切體系為：BamHIIyL質(zhì)粒DNA<lyg，滅菌的雙蒸水加至20yL。酶切后純化 回收得到經(jīng)過(guò)雙酶切的祀T-28a(+)載體。
[003引上述雙酶切使用的限制性?xún)?nèi)切酶為化ermo公司生產(chǎn)的快速內(nèi)切酶，酶切后的純 化回收使用核酸純化回收試劑盒（Magen，HipureGelPureDNAMicroKit),質(zhì)粒提取試 劑盒為上海捷瑞生物工程有限公司的質(zhì)粒小量制備試劑盒，操作方法按其使用說(shuō)明書(shū)。
[0039] 2. 3 連接
[0040] 將經(jīng)過(guò)雙酶切的PCR產(chǎn)物和雙酶切的祀T-28a(+)載體按照5 : 1的摩爾比例進(jìn) 行連接。連接使用的T4連接酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)公司，連接使用的酶量為抓/5yL 連接體系，連接溫度為22°C，連接時(shí)間20min。
[0041] 2. 4轉(zhuǎn)化及篩選
[0042] 取10yL連接產(chǎn)物與50yL大腸桿菌D冊(cè)a感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min，于42°C水 浴鍋熱激50s，冰浴2min后加入500yLLB液體培養(yǎng)基，37°C20化pm培養(yǎng)比。將培養(yǎng)物 4000巧m離屯、Imin后，棄上清400Ji以余下的100JiL涂布于含50JiL/mL卡那霉素的LB平 板，培養(yǎng)2化后挑選單菌落。單菌落于5mLLB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切 驗(yàn)證，酶切片段與基因大小相同的即為陽(yáng)性克隆。
[0043] 2. 5基因核巧酸序列測(cè)定
[0044] 將獲得的正確陽(yáng)性克隆送至上海美吉生物醫(yī)藥有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與 脂肪酶基因1-1核巧酸序列進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)是將脂肪酶基因(其核巧酸序列如SEQID NO. 1所示）插入到祀T-28a(+)質(zhì)粒中，結(jié)果完全正確后確認(rèn)得到帶有脂肪酶基因1-1的 祀T-28a(+