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      細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母的制作方法

      文檔序號:12108883閱讀:810來源:國知局
      細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母的制作方法與工藝

      本發(fā)明屬于酶的基因工程技術(shù)領域,涉及一種細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母及構(gòu)建方法及應用。



      背景技術(shù):

      白色污染是全球所有城市都存在的一種環(huán)境污染,主要是指人們在日常生活中隨意丟棄的塑料垃圾對環(huán)境造成的破壞,包括常見的塑料杯、一次性飯盒、塑料袋等。這些塑料類產(chǎn)品以石油為原料,采用聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯等高分子化合物制成,難以進行降解,再加上生活中的塑料包裝大多呈白色,被人們使用并隨意丟棄后會呈現(xiàn)出丑、臟、亂、雜等無秩序、不協(xié)調(diào)的特點,干擾和刺激人們的視覺,讓人產(chǎn)生厭煩心理,所以被稱為白色污染。而白色污染物的很大一部分是PET(聚對苯二甲酸乙二醇酯)制品。目前,世界上PET的年產(chǎn)量達到了2700多萬噸,雖然PET不會直接對環(huán)境造成危害,但其廢棄物對大氣和微生物的抵抗性很強,在自然環(huán)境中的存在周期為16-48年,而且隨著PET產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展,其廢棄物的數(shù)量極其巨大,從環(huán)境行為和生態(tài)效應考慮,PET廢棄物已成為全球性的環(huán)境污染有機物。

      目前降解PET的方法主要有化學降解和生物降解兩大類,在實際應用中PET的化學分解法主要有水解法和醇解法,此外還有氨解、胺解和熱解等。但是這些方法通常成本較高、效率較低并且不環(huán)保,避免不了降解PET后給環(huán)境帶來二次污染;而生物降解方法相對化學降解工藝更簡單、更節(jié)能環(huán)保、且不會造成二次污染。因此生物降解將是從根本上解決廢棄PET污染的最好方法。

      聚對苯二甲酸乙二醇酯分解酶(PETase)是目前唯一一個在細菌中發(fā)現(xiàn)的能降解PET的酶,分子量約為32KD,能將PET降解為單(2-羥乙基)對苯二甲酸或?qū)Ρ蕉姿幔渥畲蟮膬?yōu)勢是,與其他能降解PET的真菌中的酶LCC、TfH、FsC相比,其在低溫段(20~40℃)的酶活顯著高于其他酶,這意味著在實際應用中較容易達到適宜的反應條件,工業(yè)應用前景較好。

      疏水蛋白HGF1/HFB1是一種絲狀真菌產(chǎn)生的小分子量(12KD左右)蛋白質(zhì),最主要的功能之一就是能夠自主裝在任何親/疏水界面形成一層兩親性的膜來改變界面的性質(zhì),并且該蛋白具較強耐高溫、耐酸堿和較低免疫原性等的特點。但目前尚未有細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組菌的報道。

      參考文獻:

      [1]Shosuke Yoshida,Kazumi Hiraga,Toshihiko Takehana,Ikuo Taniguchi,Hironao Yamaji,Yasuhito Maeda,Kiyotsuna Toyohara,Kenji Miyamoto,Yoshiharu Kimura,Kohei Oda.A bacterium that degrades and assimilates poly(ethylene terephthalate)[J].science,2016(351):1196-1199.

      [2]Li Xiuhua,Wang Ziying.Research Progress on Degradation of PET[J].塑料科技,2011(4):110-114.



      技術(shù)實現(xiàn)要素:

      本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供一種細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母。

      本發(fā)明的第二個目的是提供一種細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母的構(gòu)建。

      本發(fā)明的第三個目的是提供一種細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母的應用。

      本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:

      細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母的構(gòu)建,包括如下步驟:

      (1)從畢赤酵母GS115基因組中克隆出錨定蛋白基因;化學合成疏水蛋白基因和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因;

      (2)利用PCR將錨定蛋白基因的核苷酸序列和SEQ ID NO.1的核苷酸序列連接得到融合序列1;利用PCR將錨定蛋白基因的核苷酸序列和疏水蛋白基因連接得到融合序列2;

      (3)將融合序列1連接到畢赤酵母表達載體上,得到融合表達載體1;將融合序列2連接到畢赤酵母表達載體上,得到融合表達載體2;

      (4)將融合表達載體1和融合表達載體2轉(zhuǎn)入表達宿主畢赤酵母中,得到細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母。

      錨定蛋白基因優(yōu)選:SEQ ID No.3所示的GCW51、SEQ ID No.4所示的GCW61或SEQ ID No.8所示的GCW21。

      疏水蛋白基因優(yōu)選SEQ ID NO.2所示的HGF1基因、SEQ ID NO.9所示的HFB1基因、SEQ ID NO.10所示的SC3基因或SEQ ID NO.11所示的HFB2基因。

      畢赤酵母表達載體優(yōu)選:ppic9、ppic9k、ppiczaA、ppiczaB、ppiczaC。

      上述構(gòu)建方法構(gòu)建的細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母。

      上述細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母在全細胞催化分解PET的用途。

      本發(fā)明的有益效果:

      本發(fā)明應用整合載體進行表達,避免了選擇壓力且載體不容易丟失。當PETase在細胞表面表達時,相當于做了酶的固定化,將其固著定位于細胞表面。經(jīng)固定化后的酶與游離酶相比具有穩(wěn)定性高、回收方便、易于控制、可反復使用、成本低廉等優(yōu)點,避免了蛋白純化的繁瑣。而利用疏水蛋白與PETase在畢赤酵母中進行共展示,由于疏水蛋白具有雙親性,會自發(fā)以親水面與酵母細胞表面結(jié)合,疏水面朝外,增強重組畢赤酵母的穩(wěn)定性。

      附圖說明

      圖1為重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1/P.pastoris PETase-GCW51-HFB1的Western Blot圖;其中:

      圖1A為重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1的Western Blot圖;

      圖1B為重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HFB1的Western Blot圖。

      圖2為重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1/P.pastoris PETase-GCW51-HFB1的相對酶活。

      圖3為重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1/P.pastoris PETase-GCW51-HFB1的免疫熒光檢測結(jié)果圖;其中:

      圖3-1為重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1的免疫熒光檢測結(jié)果圖;

      圖3-2為重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HFB1的免疫熒光檢測結(jié)果圖;

      具體實施方案

      下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。

      錨定蛋白GCW21(NCBI Reference Sequence:XM_002491407);

      錨定蛋白GCW51(NCBI Reference Sequence:XP_002493782);

      錨定蛋白GCW61(NCBI Reference Sequence:XP_002494322)序列。

      畢赤酵母GS115(pichia pastoris GS115)市售。也可以用其它的畢赤酵母應用于本發(fā)明。

      ppic9、ppic9k、ppiczaA、ppiczaB、ppiczaC,均為市售。

      大腸桿菌(E.coli)DH5α,市售。

      實施例1 細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母(P.pastoris PETase-GCW51-HGF1)的制備及應用:

      一、從畢赤酵母GS115基因組中克隆出如SEQ ID No.3所示的GCW51錨定蛋白基因、如SEQ ID No.4所示的GCW61錨定蛋白基因;具體步驟如下:

      畢赤酵母GS115接種于YPD培養(yǎng)基中,過夜培養(yǎng),離心收集細胞,利用提基因組試劑盒提取得到GS115酵母菌基因組DNA。

      根據(jù)如SEQ ID No.3所示的GCW51序列、如SEQ ID No.4所示的GCW61序列,利用上游引物51-F/61-F和下游引物51-R/61-R,其中劃線部分為酶切位點,以P.pastoris GS115基因組DNA為模板,擴增GCW51、GCW61基因。

      51-F:GGTGGTGGAGGTAGTGGAGGAGGTGGTAGTGATGACGATGACTCATTAC

      51-R:CCGGAATTCCTAGATCAATAGGGCAATGG

      61-F:GGTGGTGGAGGTAGTGGAGGAGGTGGTAGTAACAACCTATCAAACGAGAGT

      61-R:ATAGTTTAGCGGCCGCTTAAATCAATAGAGCAACACCGGC

      PCR反應產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,回收目的基因片段,得GCW51基因、GCW61基因。

      二、化學合成如SEQ ID NO.2所示的疏水蛋白HGF1基因和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因。

      三、利用PCR將如SEQ ID No.3所示的GCW51錨定蛋白基因的核苷酸序列和SEQ ID NO.1的核苷酸序列連接得到融合序列1;利用PCR將如SEQ ID No.4所示的GCW61錨定蛋白基因的核苷酸序列和如SEQ ID NO.2所示的疏水蛋白基因HGF1的核苷酸序列連接得到融合序列2,具體步驟如下:

      根據(jù)化學合成如SEQ ID NO.2所示的疏水蛋白基因HGF1和如SEQ ID NO.1所示的

      PETase基因,設計上游引物P-F/hg-F和下游引物P-R/hg-R,其中下劃線部分為酶切位點,以合成序列為模板擴增PETase基因和HGF1基因。

      P-F:CCGCTCGAGAAAAGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGCAAACCAATCCTTATGCCCGTG

      P-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGCTACAGTTGGCGGTACGAA

      hg-F:CCGGAATTCCAACAGTGCACCACTGG

      hg-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGACGTTAACCGGAACACATC

      PCR反應產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,回收目的基因片段,得PETase基因、HGF1基因。

      將所得PETase與GCW51以如SEQ ID No.5所示的linker為重疊區(qū)進行overlap pcr;將所得HGF1與GCW61以如SEQ ID No.5所示的linker為重疊區(qū)進行overlap pcr。

      PCR反應產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,回收目的基因片段,得如SEQ ID No.6所示的PETase-linker-GCW51基因(融合序列1)和如SEQ ID No.7所示的HGF1-linker-GCW61基因(融合序列2)。

      四、將融合序列1連接到畢赤酵母表達載體ppic9上,得到融合表達載體1;將融合序列2連接到畢赤酵母表達載體ppiczaA上,得到融合表達載體2,具體步驟如下:

      將PETase-linker-GCW51基因和ppic9載體同時用Xho I和EcoR I雙酶切后,將得到的酶切PETase-linker-GCW51基因片段連接到雙酶切后的ppic9載體上;將HGF1-linker-GCW61基因和ppiczaA載體同時用EcoR I和Not I雙酶切后,將得到的酶切HGF1-linker-GCW61基因片段連接到雙酶切后的ppiczaA載體上;將上述兩種連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞E.coli DH5α中,并挑取陽性克隆,在LB液體培養(yǎng)基上擴增后提取質(zhì)粒,得連接有PETase-linker-GCW51的融合表達載體p9P51(融合表達載體1)和連接有HGF1-linker-GCW61基因的融合表達載體pAHG61(融合表達載體2)。

      用Xho I和EcoR I雙酶切質(zhì)粒p9P51,并用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證;用EcoR I和Not I雙酶切質(zhì)粒pAHG61并用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證;

      在上述步驟中,所述的目的基因片段與載體的連接采用thermo公司的T4DNA連接酶進行連接。

      在上述步驟中,所述的連接產(chǎn)物的大腸桿菌的轉(zhuǎn)化,按如下方法進行:

      (1)取一管感受態(tài)細胞E.coli DH5α于冰上緩慢溶解,加入要轉(zhuǎn)化的質(zhì)?;蜻B接產(chǎn)物(10μL),輕混后冰浴30min;

      (2)42℃熱激90s后,迅速冰浴5min;

      (3)加入900μL,37℃溫浴的LB培養(yǎng)基,37℃搖床培養(yǎng)1h;

      (4)取200微升涂布于含氨芐青霉素(100μg/mL)的LB選擇平板(對于p9P51載體而言)和含zeocin(25μg/mL)的LB選擇平板(對于pAHG61載體而言)上,37℃倒置培養(yǎng)12-16h;

      (5)挑取單克隆,進行后續(xù)質(zhì)粒提取以及驗證實驗。

      在上述步驟中,所述的連接產(chǎn)物陽性克隆驗證,按如下方法進行:

      (1)從篩選平板上挑取p9P51轉(zhuǎn)化子,接入5mL LB液體培養(yǎng)基中(含100μg/mL氨芐青霉素),37℃搖床培養(yǎng)12-16h;從篩選平板上挑取pAHG61轉(zhuǎn)化子,接入5mL低鹽LB液體培養(yǎng)基(氯化鈉濃度為普通LB培養(yǎng)基一半)中(含25μg/mLzeocin),37℃、避光搖床培養(yǎng)12-16h

      (2)取5mL菌液,用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒;

      (3)取1μL質(zhì)粒提取液進行Nanodrop檢測,檢測提取的質(zhì)粒濃度;

      (4)將提取的質(zhì)粒進行雙酶切,驗證基因片段與載體的連接效果;

      (5)將酶切驗證正確的重組質(zhì)粒進行測序或者進行其他實驗,測序委托金唯智生物公司完成。

      五、將融合表達載體1和融合表達載體2轉(zhuǎn)入表達宿主畢赤酵母中,得到細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1,具體步驟如下:

      電擊法轉(zhuǎn)化P.pastoris GS115細胞感受態(tài)制備

      (1)從新鮮的畢赤酵母GS115(His-)平板上挑取單菌落,轉(zhuǎn)接至5mL YPD試管培養(yǎng)基中,30℃,250rpm培養(yǎng)過夜;

      (2)第二天從試管培養(yǎng)物中取0.1-0.5ml過夜培養(yǎng)物,接種至含500ml新鮮YPD培養(yǎng)基的2L搖瓶,過夜生長至OD600約為1.3-1.5;

      (3)從搖床上取酵母培養(yǎng)物,4℃,1500g離心5分鐘以收集細胞,之后在100mLYPD-HEPES-DTT(100ml YPD中加入20ml pH 8.0的HEPES緩沖液,再加入2.5ml新鮮配制的1M的DTT)培養(yǎng)基中重新懸浮細胞,30℃在搖床上培養(yǎng)15分鐘;從搖床上取下細胞,冰浴半小時;

      (4)從搖床上取下細胞,冰浴半小時;4℃,1500g離心5分鐘以收集細胞,再用250ml預冷的滅菌水懸浮細胞;;

      (5)如上離心,再用20ml預冷的1M山梨醇懸浮細胞;

      (6)如上離心,用1ml預冷的1M山梨醇懸浮細胞,至終體積約1.5ml;如上離心,用500μL冷超純水重新懸浮細胞,冰浴中備用。

      電擊法轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化子驗證

      (1)取80μL上述細胞與5-20ug線性化的p9P51載體和pAHG61載體DNA混合,轉(zhuǎn)入預冷的0.2cm電轉(zhuǎn)杯中,在冰上放置5min;

      (2)擦干電轉(zhuǎn)杯外壁水滴,放在電轉(zhuǎn)儀上;

      (3)設置酵母參數(shù)“fungi”,“pic”,點擊Pulse;

      (4)取出電轉(zhuǎn)杯,立即加入600微升L冰預冷1mol/L山梨醇,用槍輕輕吹打,在溫和轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中,30℃靜置培養(yǎng)1h后加入600微升YPD培養(yǎng)基,30℃,200rpm搖床分別培養(yǎng)1h、3h后分成200-600μL等份,涂于含75微克/毫升zeocin的YPDS平板上(設置感受態(tài)中不加入載體的對照組);30℃避光培養(yǎng)48h后挑取單菌落于MD平板上進行篩選,陽性菌落菌株為細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母,命名為P.pastoris PETase-GCW51-HGF1;

      (5)提取轉(zhuǎn)化子(P.pastoris PETase-GCW51-HGF1)的基因組DNA,進行PCR驗證,比較電泳條帶位置是否與陽性對照相同,PCR采用的引物為AOX上下游引物、P-51-F/R以及hg-61-F/R,對陽性菌進行甘油保菌。

      P-51-F:CCGCTCGAGAAAAGAGATT

      P-51-R:CCGGAATTCCTAGATCAATAGGGCAATGG

      hg-61-F:CCGGAATTCCAACAGTGCA

      hg-61-R:ATAGTTTAGCGGCCGCTTAAATC

      六、細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母P.pastoris

      PETase-GCW51-HGF1的應用,具體步驟如下:

      Western Blot實驗

      一、P.pastoris PETase-GCW51-HGF1的SDS-PAGE電泳

      二、轉(zhuǎn)膜

      (1)轉(zhuǎn)一張膜需準備6張7.0~8.3cm的濾紙和1張7.3~8.6cm的硝酸纖維素膜。切濾紙和膜時一定要戴手套。

      (2)在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、濾紙和膜。

      (3)將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊,在墊子上墊三層濾紙。

      (4)要先將玻璃板撬掉才可剝膠,撬的時候動作要輕,要在兩個邊上輕輕的反復撬。撬一會兒玻璃板便開始松動,直到撬去玻板。除去小玻璃板后,將濃縮膠輕輕刮去(濃縮膠影響操作),要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上,用手調(diào)整使其與濾紙對齊,輕輕搟去氣泡。將膜蓋于膠上,要蓋滿整個膠(膜蓋下后不可再移動)并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個海綿墊,合起夾子。整個操作在轉(zhuǎn)移液中進行。

      (5)將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中,要使夾的黑面對槽的黑面,夾的白面對槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱,在槽的一邊放一塊冰來降溫。一般用100V轉(zhuǎn)移1h。

      三、免疫反應

      (1)將膜轉(zhuǎn)移至含有封閉液的盒中,室溫下脫色搖床上搖動封閉1h后,用PBST在室溫下脫色搖床上洗三次,每次10min。

      (2)將一抗用PBST稀釋至適當濃度,4℃過夜孵育后,用PBST在室溫下脫色搖床上洗三次,每次10min。

      (3)將二抗用PBST稀釋至適當濃度,室溫下孵育1h后,用PBST在室溫下脫色搖床上洗三次,每次10min。

      四、化學發(fā)光,顯影,定影

      圖1A的結(jié)果說明PETase和HGF1在重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1成功表達。

      HPLC測酶活實驗

      配置酶活反應所用到的一系列Buffer PBS緩沖液:用800ml雙蒸水溶解8g NaCl,0.2g KCl,1.44g Na2HPO4,0.24g KH2PO4,用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4,加水至1L,抽濾除菌。

      Glycine/NaOH Buffer:0.2M Glycine溶液50ml;0.2M NaOH溶液8.8ml

      混勻定容200ml,互相調(diào)pH到9.0

      磷酸磷酸二氫鈉緩沖液pH=2.50:0.02M H3PO4 1L;0.02M NaH2PO4 1L,

      在1L燒杯中先加200~300ml磷酸,再往里兌磷酸二氫鈉,直到pH=2.50

      甲醇:甲醇一瓶為500ml,直接將兩瓶抽濾到一個1L的大瓶子里,有機濾紙。

      終止液:90mL PBS+10mL DMSO

      1.制樣(設置1個實驗組和1個對照組)。

      a.取適量P.pastoris PETase-GCW51-HGF1菌液于EP管,3000g,4℃離心5min,去上清。

      b.加入適量甘氨酸氫氧化鈉緩沖液(pH=9.0)重懸菌液,離心去上清。

      c.重復一次。

      d.設置不同P.pastoris PETase-GCW51-HGF1菌量梯度(2ml、1ml、0.5ml、0.1ml、0.01ml)。

      e.加入100微升甘氨酸氫氧化鈉緩沖液重懸菌液。

      2.實驗組加入提前處理好的PET膜,對照組不加PET膜

      3.在恒溫搖床里40℃,18h,220rpm孵育反應。

      4.凍菌:剩余菌體用PBS洗兩次,用20%甘油重懸,凍存。

      5.反應結(jié)束后,4℃5000g離心10min

      6.取上清,加入終止液

      7.85℃滅活10min

      8.12000rpm,離心10min,取100微升于新的EP管內(nèi)。

      9.將配好的磷酸/磷酸二氫鈉緩沖液(pH=2.5)和甲醇超聲30min。

      10.過HPLC,上樣100微升,記錄好順序。

      圖2的結(jié)果說明重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1能降解PET,且較野生型PETase酶活有顯著提升。

      免疫熒光檢測

      (1)取200uLP.pastoris PETase-GCW51-HGF1誘導培養(yǎng)液于4℃,12000rpm,離心1min,保留菌體。

      (2)PBS緩沖液對重組酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1細胞進行重懸,于4℃,12000rpm,離心1min,棄上清留菌體。

      (3)利用200uL的3mg/mLBSA的PBS緩沖液重懸菌體,于室溫下反應1h,期間應使菌體上下混勻,于4℃,12000rpm,離心1min,保留菌體。

      (4)利用含1uL一抗的200uL的3mg/mLBSA的PBS緩沖液重懸菌體,于4℃過夜處理,期間應使菌體上下混勻。次日于4℃,12000rpm,離心1min,保留菌體。

      (5)PBS緩沖液對重組酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1細胞進行重懸,室溫處理10min,于4℃,12000rpm,離心1min,棄上清留菌體。

      (6)步驟(5)重復兩次。

      (7)利用含1uL二抗的200uL的PBS緩沖液重懸菌體,避光室溫處理1h,期間應使菌體上下混勻,于4℃,12000rpm,離心1min,保留菌體。

      (8)PBS緩沖液對重組酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1細胞進行重懸,避光室溫處理5min,期間應使菌體上下混勻,于4℃,12000rpm,離心1min,棄上清留菌體。

      (9)步驟(8)重復一次。

      (10)用200uL的PBS緩沖液重懸,每次取10uL于潔靜載玻片制片。

      圖3-1的結(jié)果說明PETase基因成功展示在重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1表面。

      實施例2 細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母P.pastoris

      PETase-GCW51-HFB1的制備及應用,包括如下步驟:

      一、同實施例1步驟一。

      二、化學合成如SEQ ID NO.9所示的疏水蛋白基因HFB1和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因。

      三、利用PCR將如SEQ ID No.3所示的GCW51錨定蛋白基因的核苷酸序列和SEQ ID NO.1的核苷酸序列連接得到融合序列1;利用PCR將如SEQ ID No.4所示的GCW61錨定蛋白基因的核苷酸序列和如SEQ ID NO.9所示的疏水蛋白基因HFB1的核苷酸序列連接得到融合序列2,具體步驟如下:

      根據(jù)化學合成如SEQ ID NO.9所示的疏水蛋白基因HFB1和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因,設計上游引物P-F/hf-F和下游引物P-R/hf-R,其中下劃線部分為酶切位點,以合成序列為模板擴增PETase基因和HFB1基因。

      P-F:CCGCTCGAGAAAAGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGCAAACCAATCCTTATGCCCGTG

      P-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGCTACAGTTGGCGGTACGAA

      hf-F:CCGGAATTCAGCAACGGCAACGGCAATGT

      hf-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCAGCACCGACGGCGGTCT

      PCR反應產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,回收目的基因片段,得PETase基因、HFB1基因。

      將所得PETase與GCW51以如SEQ ID No.5所示的linker為重疊區(qū)進行overlap pcr;將所得HFB1與GCW61以如SEQ ID No.5所示的linker為重疊區(qū)進行overlap pcr

      PCR反應產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,回收目的基因片段,得如SEQ ID No.6所示的PETase-linker-GCW51基因(融合序列1)和如SEQ ID No.12所示的HFB1-linker-GCW61基因(融合序列2)。

      四、將融合序列1連接到畢赤酵母表達載體ppic9上,得到融合表達載體1;將融合序列2連接到畢赤酵母表達載體ppiczaA上,得到融合表達載體2,具體步驟見實施例1步驟四。

      五、將融合表達載體1和融合表達載體2轉(zhuǎn)入表達宿主畢赤酵母中,得到細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HFB1,具體步驟如下:

      電擊法轉(zhuǎn)化P.pastoris GS115細胞感受態(tài)制備

      (1)從新鮮的畢赤酵母GS115(His-)平板上挑取單菌落,轉(zhuǎn)接至5mL YPD試管培養(yǎng)基中,30℃,250rpm培養(yǎng)過夜;

      (2)第二天從試管培養(yǎng)物中取0.1-0.5ml過夜培養(yǎng)物,接種至含500ml新鮮YPD培養(yǎng)基的2L搖瓶,過夜生長至OD600約為1.3-1.5;

      (3)從搖床上取酵母培養(yǎng)物,4℃,1500g離心5分鐘以收集細胞,之后在100mLYPD-HEPES-DTT(100ml YPD中加入20ml pH 8.0的HEPES緩沖液,再加入2.5ml新鮮配制的1M的DTT)培養(yǎng)基中重新懸浮細胞,30℃在搖床上培養(yǎng)15分鐘;從搖床上取下細胞,冰浴半小時;

      (4)從搖床上取下細胞,冰浴半小時;4℃,1500g離心5分鐘以收集細胞,再用250ml預冷的滅菌水懸浮細胞;;

      (5)如上離心,再用20ml預冷的1M山梨醇懸浮細胞;

      (6)如上離心,用1ml預冷的1M山梨醇懸浮細胞,至終體積約1.5ml;如上離心,用500μL冷超純水重新懸浮細胞,冰浴中備用。

      電擊法轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化子驗證

      (1)取80μL上述細胞與5-20ug線性化的p9P51載體和pAHF61載體DNA混合,轉(zhuǎn)入預冷的0.2cm電轉(zhuǎn)杯中,在冰上放置5min;

      (2)擦干電轉(zhuǎn)杯外壁水滴,放在電轉(zhuǎn)儀上;

      (3)設置酵母參數(shù)“fungi”,“pic”,點擊Pulse;

      (4)取出電轉(zhuǎn)杯,立即加入600微升L冰預冷1mol/L山梨醇,用槍輕輕吹打,在溫和轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中,30℃靜置培養(yǎng)1h后加入600微升YPD培養(yǎng)基,30℃,200rpm搖床分別培養(yǎng)1h、3h后分成200-600μL等份,涂于含75微克/毫升zeocin的YPDS平板上(設置感受態(tài)中不加入載體的對照組);30℃避光培養(yǎng)48h后挑取單菌落于MD平板上進行篩選,陽性菌落菌株細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母,命名為P.pastoris PETase-GCW51-HFB1;

      (5)提取轉(zhuǎn)化子(P.pastoris PETase-GCW51-HFB1)的基因組DNA,進行PCR驗證,比較電泳條帶位置是否與陽性對照相同,PCR采用的引物為AOX上下游引物、P-51-F/R以及hf-61-F/R,對陽性菌進行甘油保菌。

      P-51-F:CCGCTCGAGAAAAGAGATT

      P-51-R:CCGGAATTCCTAGATCAATAGGGCAATGG

      hf-61-F:CCGGAATTCAGCAACGGCAAC

      hf-61-R:ATAGTTTAGCGGCCGCTTAAATC

      六、細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HFB1的應用,具體步驟同實施例1步驟六。

      圖1B的結(jié)果說明PETase和HFB1在重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HFB1中成功表達。

      圖2的結(jié)果說明重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HFB1能降解PET,且較野生型PETase酶活有顯著提升。

      圖3-2的結(jié)果說明PETase基因成功展示在重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HFB1表面。

      用SC3疏水蛋白(SEQ ID NO.10)或HFB2疏水蛋白(SEQ ID NO.11),替代本實施例的疏水蛋白基因HFB1,其它參照本實施例,制備出細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母,命名為P.pastoris PETase-GCW51-SC3;或細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母,命名為P.pastoris PETase-GCW51-HFB2。

      實施例3 細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW21-HGF1的制備及應用,包括如下步驟:

      一、從畢赤酵母GS115基因組中克隆出如SEQ ID No.8所示的GCW21錨定蛋白基因、如SEQ ID No.4所示的GCW61錨定蛋白基因;具體步驟如下:

      畢赤酵母GS115接種于YPD培養(yǎng)基中,過夜培養(yǎng),離心收集細胞,利用提基因組試劑盒提取得到GS115酵母菌基因組DNA。

      根據(jù)如SEQ ID No.8所示的GCW21序列、如SEQ ID No.4所示的GCW61序列,利用上游引物21-F/61-F和下游引物21-R/61-R,其中劃線部分為酶切位點,以P.pastoris GS115基因組DNA為模板,擴增GCW21、GCW61基因。

      21-F:GGTGGTGGAGGTAGTGGAGGAGGTGGTAGTGACCAGCGAATCTCTGTCAC

      21-R:CCGGAATTCTTATAACAAAGCAGCGGCGGCAATT

      61-F:GGTGGTGGAGGTAGTGGAGGAGGTGGTAGTAACAACCTATCAAACGAGAGT

      61-R:ATAGTTTAGCGGCCGCTTAAATCAATAGAGCAACACCGGC

      PCR反應產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,回收目的基因片段,得GCW21基因、GCW61基因。

      二、化學合成如SEQ ID NO.2所示的疏水蛋白HGF1基因和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因。

      三、利用PCR將如SEQ ID No.8所示的GCW21錨定蛋白基因的核苷酸序列和SEQ ID NO.1的核苷酸序列連接得到融合序列1;利用PCR將如SEQ ID No.4所示的GCW61錨定蛋白基因的核苷酸序列和如SEQ ID NO.2所示的疏水蛋白基因HGF1的核苷酸序列連接得到融合序列2,具體步驟如下:

      根據(jù)化學合成如SEQ ID NO.2所示的疏水蛋白基因HGF1和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因,設計上游引物P-F/hg-F和下游引物P-R/hg-R,以合成序列為模板擴增PETase基因和HGF1基因。

      P-F:CCGCTCGAGAAAAGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGCAAACCAATCCTTATGCCCGTG

      P-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGCTACAGTTGGCGGTACGAA

      hg-F:CCGGAATTCCAACAGTGCACCACTGG

      hg-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGACGTTAACCGGAACACATC

      PCR反應產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,回收目的基因片段,得PETase基因、HGF1基因。

      將所得PETase與GCW21以如SEQ ID No.5所示的linker為重疊區(qū)進行overlap pcr;將所得HGF1與GCW61以如SEQ ID No.5所示的linker為重疊區(qū)進行overlap pcr

      PCR反應產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,回收目的基因片段,得如SEQ ID No.28所示的PETase-linker-GCW21基因(融合序列1)和如SEQ ID No.7所示的HGF1-linker-GCW61基因(融合序列2)。

      四、將融合序列1連接到畢赤酵母表達載體ppic9上,得到融合表達載體1;將融合序列2連接到畢赤酵母表達載體ppiczaA上,得到融合表達載體2,具體步驟同實施例1步驟四。

      五、將融合表達載體1和融合表達載體2轉(zhuǎn)入表達宿主畢赤酵母中,得到細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW21-HGF1,具體步驟如下。

      電擊法轉(zhuǎn)化P.pastoris GS115細胞感受態(tài)制備

      (1)從新鮮的畢赤酵母GS115(His-)平板上挑取單菌落,轉(zhuǎn)接至5mL YPD試管培養(yǎng)基中,30℃,250rpm培養(yǎng)過夜;

      (2)第二天從試管培養(yǎng)物中取0.1-0.5ml過夜培養(yǎng)物,接種至含500ml新鮮YPD培養(yǎng)基的2L搖瓶,過夜生長至OD600約為1.3-1.5;

      (3)從搖床上取酵母培養(yǎng)物,4℃,1500g離心5分鐘以收集細胞,之后在100mLYPD-HEPES-DTT(100ml YPD中加入20ml pH 8.0的HEPES緩沖液,再加入2.5ml新鮮配制的1M的DTT)培養(yǎng)基中重新懸浮細胞,30℃在搖床上培養(yǎng)15分鐘;從搖床上取下細胞,冰浴半小時;

      (4)從搖床上取下細胞,冰浴半小時;4℃,1500g離心5分鐘以收集細胞,再用250ml預冷的滅菌水懸浮細胞;;

      (5)如上離心,再用20ml預冷的1M山梨醇懸浮細胞;

      (6)如上離心,用1ml預冷的1M山梨醇懸浮細胞,至終體積約1.5ml;如上離心,用500μL冷超純水重新懸浮細胞,冰浴中備用。

      電擊法轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化子驗證

      (1)取80μL上述細胞與5-20ug線性化的p9P21載體和pAHG61載體DNA混合,轉(zhuǎn)入預冷的0.2cm電轉(zhuǎn)杯中,在冰上放置5min;

      (2)擦干電轉(zhuǎn)杯外壁水滴,放在電轉(zhuǎn)儀上;

      (3)設置酵母參數(shù)“fungi”,“pic”,點擊Pulse;

      (4)取出電轉(zhuǎn)杯,立即加入600微升L冰預冷1mol/L山梨醇,用槍輕輕吹打,在溫和轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中,30℃靜置培養(yǎng)1h后加入600微升YPD培養(yǎng)基,30℃,200rpm搖床分別培養(yǎng)1h、3h后分成200-600μL等份,涂于含75微克/毫升zeocin的YPDS平板上(設置感受態(tài)中不加入載體的對照組);30℃避光培養(yǎng)48h后挑取單菌落于MD平板上進行篩選,陽性菌落菌株細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母,命名為P.pastoris PETase-GCW21-HGF1;

      (5)提取轉(zhuǎn)化子(P.pastoris PETase-GCW21-HGF1)的基因組DNA,進行PCR驗證,比較電泳條帶位置是否與陽性對照相同,PCR采用的引物為AOX上下游引物、P-21-F/R以及hg-61-F/R,對陽性菌進行甘油保菌。

      P-21-F:CCGCTCGAGAAAAGAGATT

      P-21-R:CCGGAATTCTTATAACAAAGCAGCG

      hg-61-F:CCGGAATTCCAACAGTGCA

      hg-61-R:ATAGTTTAGCGGCCGCTTAAATC

      六.HPLC測酶活實驗

      操作步驟參照實施例1的HPLC測酶活實驗,實驗結(jié)果說明重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW21-HGF1能降解PET,且較野生型PETase酶活有顯著提升。

      實施例4 細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW21-HFB1的制備及應用,包括如下步驟:

      一、同實施例3步驟一;

      二、化學合成如SEQ ID NO.9所示的疏水蛋白基因HFB1和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因。

      三、利用PCR將如SEQ ID No.8所示的GCW21錨定蛋白基因的核苷酸序列和SEQ ID NO.1的核苷酸序列連接得到融合序列1;利用PCR將如SEQ ID No.4所示的GCW61錨定蛋白基因的核苷酸序列和如SEQ ID NO.9所示的疏水蛋白基因HFB1的核苷酸序列連接得到融合序列2,具體步驟如下:

      根據(jù)化學合成如SEQ ID NO.9所示的疏水蛋白基因HFB1和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因,設計上游引物P-F/hf-F和下游引物P-R/hf-R,以合成序列為模板擴增PETase基因和HGF1基因。

      P-F:CCGCTCGAGAAAAGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGCAAACCAATCCTTATGCCCGTG

      P-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGCTACAGTTGGCGGTACGAA

      hf-F:CCGGAATTCAGCAACGGCAACGGCAATGT

      hf-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCAGCACCGACGGCGGTCT

      PCR反應產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,回收目的基因片段,得PETase基因、HFB1基因。

      將所得PETase與GCW21以如SEQ ID No.5所示的linker為重疊區(qū)進行overlap pcr;將所得HFB1與GCW61以如SEQ ID No.5所示的linker為重疊區(qū)進行overlap pcr

      PCR反應產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,回收目的基因片段,得如SEQ ID No.28所示的PETase-linker-GCW21基因(融合序列1)和如SEQ ID No.12所示的HFB1-linker-GCW61基因(融合序列2)。

      四、將融合序列1連接到畢赤酵母表達載體ppic9上,得到融合表達載體1;將融合序列2連接到畢赤酵母表達載體ppiczaA上,得到融合表達載體2,具體步驟同實施例1步驟四。

      五、將融合表達載體1和融合表達載體2轉(zhuǎn)入表達宿主畢赤酵母中,得到細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW21-HFB1,具體步驟如下。

      電擊法轉(zhuǎn)化P.pastoris GS115細胞感受態(tài)制備

      (1)從新鮮的畢赤酵母GS115(His-)平板上挑取單菌落,轉(zhuǎn)接至5mL YPD試管培養(yǎng)基中,30℃,250rpm培養(yǎng)過夜;

      (2)第二天從試管培養(yǎng)物中取0.1-0.5ml過夜培養(yǎng)物,接種至含500ml新鮮YPD培養(yǎng)基的2L搖瓶,過夜生長至OD600約為1.3-1.5;

      (3)從搖床上取酵母培養(yǎng)物,4℃,1500g離心5分鐘以收集細胞,之后在100mLYPD-HEPES-DTT(100ml YPD中加入20ml pH 8.0的HEPES緩沖液,再加入2.5ml新鮮配制的1M的DTT)培養(yǎng)基中重新懸浮細胞,30℃在搖床上培養(yǎng)15分鐘;從搖床上取下細胞,冰浴半小時;

      (4)從搖床上取下細胞,冰浴半小時;4℃,1500g離心5分鐘以收集細胞,再用250ml預冷的滅菌水懸浮細胞;;

      (5)如上離心,再用20ml預冷的1M山梨醇懸浮細胞;

      (6)如上離心,用1ml預冷的1M山梨醇懸浮細胞,至終體積約1.5ml;如上離心,用500μL冷超純水重新懸浮細胞,冰浴中備用。

      電擊法轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化子驗證

      (1)取80μL上述細胞與5-20ug線性化的p9P21載體和pAHF61載體DNA混合,轉(zhuǎn)入預冷的0.2cm電轉(zhuǎn)杯中,在冰上放置5min;

      (2)擦干電轉(zhuǎn)杯外壁水滴,放在電轉(zhuǎn)儀上;

      (3)設置酵母參數(shù)“fungi”,“pic”,點擊Pulse;

      (4)取出電轉(zhuǎn)杯,立即加入600微升L冰預冷1mol/L山梨醇,用槍輕輕吹打,在溫和轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中,30℃靜置培養(yǎng)1h后加入600微升YPD培養(yǎng)基,30℃,200rpm搖床分別培養(yǎng)1h、3h后分成200-600μL等份,涂于含75微克/毫升zeocin的YPDS平板上(設置感受態(tài)中不加入載體的對照組);30℃避光培養(yǎng)48h后挑取單菌落于MD平板上進行篩選,陽性菌落菌株細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母,命名為P.pastoris PETase-GCW21-HFB1;

      (5)提取轉(zhuǎn)化子(P.pastoris PETase-GCW21-HFB1)的基因組DNA,進行PCR驗證,比較電泳條帶位置是否與陽性對照相同,PCR采用的引物為AOX上下游引物、P-21-F/R以及hf-61-F/R,對陽性菌進行甘油保菌。

      P-21-F:CCGCTCGAGAAAAGAGATT

      P-21-R:CCGGAATTCTTATAACAAAGCAGCG

      hf-61-F:CCGGAATTCAGCAACGGCAAC

      hf-61-R:ATAGTTTAGCGGCCGCTTAAATC

      六.HPLC測酶活實驗

      操作步驟參照實施例1的HPLC測酶活實驗,實驗結(jié)果說明重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW21-HFB1能降解PET,且較野生型PETase酶活有顯著提升。

      實施例5 細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW61-HGF1的制備及應用,包括如下步驟:

      一、從畢赤酵母GS115基因組中克隆出如SEQ ID No.4所示的GCW61錨定蛋白基因;具體步驟如下:

      畢赤酵母GS115接種于YPD培養(yǎng)基中,過夜培養(yǎng),離心收集細胞,利用提基因組試劑盒提取得到GS115酵母菌基因組DNA。

      根據(jù)如SEQ ID No.4所示的GCW61序列,利用上游引物61-F’/61-F和下游引物61-R’/61-R,其中劃線部分為酶切位點,以P.pastoris GS115基因組DNA為模板,擴增GCW61基因。

      61-F’:GGTGGTGGAGGTAGTGGAGGAGGTGGTAGTAACAACCTATCAAACGAGAG

      61-R’:CCGGAATTCTTAAATCAATAGAGCAACACCG

      61-F:GGTGGTGGAGGTAGTGGAGGAGGTGGTAGTAACAACCTATCAAACGAGAGT

      61-R:ATAGTTTAGCGGCCGCTTAAATCAATAGAGCAACACCGGC

      PCR反應產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,回收目的基因片段,得GCW61基因。

      二、化學合成如SEQ ID NO.2所示的疏水蛋白HGF1基因和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因。

      三、利用PCR將如SEQ ID No.4所示的GCW61錨定蛋白基因的核苷酸序列和SEQ ID NO.1的核苷酸序列連接得到融合序列1;利用PCR將如SEQ ID No.4所示的GCW61錨定蛋白基因的核苷酸序列和如SEQ ID NO.2所示的疏水蛋白基因HGF1的核苷酸序列連接得到融合序列2,具體步驟如下:

      根據(jù)化學合成如SEQ ID NO.2所示的疏水蛋白基因HGF1和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因,設計上游引物P-F/hg-F和下游引物P-R/hg-R,以合成序列為模板擴增PETase基因和HGF1基因。

      P-F:CCGCTCGAGAAAAGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGCAAACCAATCCTTATGCCCGTG

      P-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGCTACAGTTGGCGGTACGAA

      hg-F:CCGGAATTCCAACAGTGCACCACTGG

      hg-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGACGTTAACCGGAACACATC

      PCR反應產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,回收目的基因片段,得PETase基因、HGF1基因。

      將所得PETase與GCW61以如SEQ ID No.5所示的linker為重疊區(qū)進行overlap pcr;將所得HGF1與GCW61以如SEQ ID No.5所示的linker為重疊區(qū)進行overlap pcr

      PCR反應產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,回收目的基因片段,得如SEQ ID No.29所示的PETase-linker-GCW61基因(融合序列1)和如SEQ ID No.7所示的HGF1-linker-GCW61基因(融合序列2)。

      四、將融合序列1連接到畢赤酵母表達載體ppic9上,得到融合表達載體1;將融合序列2連接到畢赤酵母表達載體ppiczaA上,得到融合表達載體2,具體步驟同實施例1步驟四。

      五、將融合表達載體1和融合表達載體2轉(zhuǎn)入表達宿主畢赤酵母中,得到細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW61-HGF1,具體步驟如下。

      電擊法轉(zhuǎn)化P.pastoris GS115細胞感受態(tài)制備

      (1)從新鮮的畢赤酵母GS115(His-)平板上挑取單菌落,轉(zhuǎn)接至5mL YPD試管培養(yǎng)基中,30℃,250rpm培養(yǎng)過夜;

      (2)第二天從試管培養(yǎng)物中取0.1-0.5ml過夜培養(yǎng)物,接種至含500ml新鮮YPD培養(yǎng)基的2L搖瓶,過夜生長至OD600約為1.3-1.5;

      (3)從搖床上取酵母培養(yǎng)物,4℃,1500g離心5分鐘以收集細胞,之后在100mLYPD-HEPES-DTT(100ml YPD中加入20ml pH 8.0的HEPES緩沖液,再加入2.5ml新鮮配制的1M的DTT)培養(yǎng)基中重新懸浮細胞,30℃在搖床上培養(yǎng)15分鐘;從搖床上取下細胞,冰浴半小時;

      (4)從搖床上取下細胞,冰浴半小時;4℃,1500g離心5分鐘以收集細胞,再用250ml預冷的滅菌水懸浮細胞;;

      (5)如上離心,再用20ml預冷的1M山梨醇懸浮細胞;

      (6)如上離心,用1ml預冷的1M山梨醇懸浮細胞,至終體積約1.5ml;如上離心,用500μL冷超純水重新懸浮細胞,冰浴中備用。

      電擊法轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化子驗證

      (1)取80μL上述細胞與5-20ug線性化的p9P61載體和pAHG61載體DNA混合,轉(zhuǎn)入預冷的0.2cm電轉(zhuǎn)杯中,在冰上放置5min;

      (2)擦干電轉(zhuǎn)杯外壁水滴,放在電轉(zhuǎn)儀上;

      (3)設置酵母參數(shù)“fungi”,“pic”,點擊Pulse;

      (4)取出電轉(zhuǎn)杯,立即加入600微升L冰預冷1mol/L山梨醇,用槍輕輕吹打,在溫和轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中,30℃靜置培養(yǎng)1h后加入600微升YPD培養(yǎng)基,30℃,200rpm搖床分別培養(yǎng)1h、3h后分成200-600μL等份,涂于含75微克/毫升zeocin的YPDS平板上(設置感受態(tài)中不加入載體的對照組);30℃避光培養(yǎng)48h后挑取單菌落于MD平板上進行篩選,陽性菌落菌株細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母,命名為P.pastoris PETase-GCW61-HGF1;

      (5)提取轉(zhuǎn)化子(P.pastoris PETase-GCW61-HGF1)的基因組DNA,進行PCR驗證,比較電泳條帶位置是否與陽性對照相同,PCR采用的引物為AOX上下游引物、P-61-F/R以及hg-61-F/R,對陽性菌進行甘油保菌。

      P-61-F:CCGCTCGAGAAAAGAGATT

      P-61-R:CCGGAATTCTTAAATCAATAGAGCAACACCG

      hg-61-F:CCGGAATTCCAACAGTGCA

      hg-61-R:ATAGTTTAGCGGCCGCTTAAATC

      六.HPLC測酶活實驗

      操作步驟參照實施例1的HPLC測酶活實驗,實驗結(jié)果說明重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW61-HGF1能降解PET,且較野生型PETase酶活有顯著提升。

      實施例6 細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW61-HFB1的制備及應用,包括如下步驟:

      一、同實施例5步驟一。

      二、化學合成如SEQ ID NO.9所示的疏水蛋白基因HFB1和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因。

      三、利用PCR將如SEQ ID No.4所示的GCW61錨定蛋白基因的核苷酸序列和SEQ ID NO.1的核苷酸序列連接得到融合序列1;利用PCR將如SEQ ID No.4所示的GCW61錨定蛋白基因的核苷酸序列和如SEQ ID NO.9所示的疏水蛋白基因HFB1的核苷酸序列連接得到融合序列2,具體步驟如下:

      化學合成如SEQ ID NO.9所示的疏水蛋白基因HFB1和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因,設計上游引物P-F/hf-F和下游引物P-R/hf-R,以合成序列為模板擴增PETase基因和HFB1基因。

      P-F:CCGCTCGAGAAAAGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGCAAACCAATCCTTATGCCCGTG

      P-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGCTACAGTTGGCGGTACGAA

      hf-F:CCGGAATTCAGCAACGGCAACGGCAATGT

      hf-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCAGCACCGACGGCGGTCT

      PCR反應產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,回收目的基因片段,得PETase基因、HFB1基因。

      將所得PETase與GCW61以如SEQ ID No.5所示的linker為重疊區(qū)進行overlap pcr;將所得HFB1與GCW61以如SEQ ID No.5所示的linker為重疊區(qū)進行overlap pcr

      PCR反應產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,回收目的基因片段,得如SEQ ID No.29所示的PETase-linker-GCW61基因(融合序列1)和如SEQ ID No.12所示的HFB1-linker-GCW61基因(融合序列2)。

      四、將融合序列1連接到畢赤酵母表達載體ppic9上,得到融合表達載體1;將融合序列2連接到畢赤酵母表達載體ppiczaA上,得到融合表達載體2,具體步驟同實施例1步驟四。

      五、將融合表達載體1和融合表達載體2轉(zhuǎn)入表達宿主畢赤酵母中,得到細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW61-HFB1,具體步驟如下。

      電擊法轉(zhuǎn)化P.pastoris GS115細胞感受態(tài)制備

      (1)從新鮮的畢赤酵母GS115(His-)平板上挑取單菌落,轉(zhuǎn)接至5mL YPD試管培養(yǎng)基中,30℃,250rpm培養(yǎng)過夜;

      (2)第二天從試管培養(yǎng)物中取0.1-0.5ml過夜培養(yǎng)物,接種至含500ml新鮮YPD培養(yǎng)基的2L搖瓶,過夜生長至OD600約為1.3-1.5;

      (3)從搖床上取酵母培養(yǎng)物,4℃,1500g離心5分鐘以收集細胞,之后在100mLYPD-HEPES-DTT(100ml YPD中加入20ml pH 8.0的HEPES緩沖液,再加入2.5ml新鮮配制的1M的DTT)培養(yǎng)基中重新懸浮細胞,30℃在搖床上培養(yǎng)15分鐘;從搖床上取下細胞,冰浴半小時;

      (4)從搖床上取下細胞,冰浴半小時;4℃,1500g離心5分鐘以收集細胞,再用250ml預冷的滅菌水懸浮細胞;;

      (5)如上離心,再用20ml預冷的1M山梨醇懸浮細胞;

      (6)如上離心,用1ml預冷的1M山梨醇懸浮細胞,至終體積約1.5ml;如上離心,用500μL冷超純水重新懸浮細胞,冰浴中備用。

      電擊法轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化子驗證

      (1)取80μL上述細胞與5-20ug線性化的p9P61載體和pAHF61載體DNA混合,轉(zhuǎn)入預冷的0.2cm電轉(zhuǎn)杯中,在冰上放置5min;

      (2)擦干電轉(zhuǎn)杯外壁水滴,放在電轉(zhuǎn)儀上;

      (3)設置酵母參數(shù)“fungi”,“pic”,點擊Pulse;

      (4)取出電轉(zhuǎn)杯,立即加入600微升L冰預冷1mol/L山梨醇,用槍輕輕吹打,在溫和轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中,30℃靜置培養(yǎng)1h后加入600微升YPD培養(yǎng)基,30℃,200rpm搖床分別培養(yǎng)1h、3h后分成200-600μL等份,涂于含75微克/毫升zeocin的YPDS平板上(設置感受態(tài)中不加入載體的對照組);30℃避光培養(yǎng)48h后挑取單菌落于MD平板上進行篩選,陽性菌落菌株細胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母,命名為P.pastoris PETase-GCW61-HFB1;

      (5)提取轉(zhuǎn)化子(P.pastoris PETase-GCW61-HFB1)的基因組DNA,進行PCR驗證,比較電泳條帶位置是否與陽性對照相同,PCR采用的引物為AOX上下游引物、P-61-F/R以及hf-61-F/R,對陽性菌進行甘油保菌。

      P-61-F:CCGCTCGAGAAAAGAGATT

      P-61-R:CCGGAATTCTTAAATCAATAGAGCAACACCG

      hf-61-F:CCGGAATTCAGCAACGGCAAC

      hf-61-R:ATAGTTTAGCGGCCGCTTAAATC

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