本發(fā)明涉及一種雙酶催化外消旋環(huán)氧苯乙烷制備(R)-苯乙二醇的方法，屬于生物催化技術領域。

背景技術：

手性環(huán)氧化物和鄰二醇能與多種親核試劑、親電試劑、酸和堿等發(fā)生反應，是一類高附加值的多功能合成子或砌塊，可用于藥物、精細化學品、農(nóng)藥和功能性材料等的合成，如白三烯、昆蟲信息素、甾類物質、β-腎上腺素阻斷劑、神經(jīng)保護劑和艾滋病毒蛋白酶抑制劑等。

環(huán)氧化物水解酶(Epoxide hydrolases,EHs,EC 3.3.2.-)能特異性催化外消旋環(huán)氧化物的水解動力學拆分或對映歸一性水解，獲得對映純的環(huán)氧化物或相應的鄰二醇。由于EHs具有來源廣、對映選擇性和區(qū)域選擇性較高、不需要輔助因子參與、反應條件溫和、對環(huán)境友好等特點，是一種很有潛力的生物催化劑。迄今為止，已報道了約40種對映選擇性較高的EHs(對映選擇率E>30)，其中大部分來源于微生物，主要用于催化外消旋環(huán)氧化物的水解動力學拆分，該方法固有的缺陷是獲得單一構型環(huán)氧化物或鄰二醇的理論產(chǎn)率僅為50％。與水解動力學拆分不同，對映歸一性水解可以突破這種局限，產(chǎn)物的最大產(chǎn)率可達100％。兩種具有互補對映選擇性和區(qū)域選擇性的EHs催化外消旋環(huán)氧化物水解，可以完全轉化為單一構型的鄰二醇。

目前，雖已有一些有關利用雙酶對映歸一性水解環(huán)氧苯乙烷底物的方法，普遍存在催化底物濃度、催化效率、產(chǎn)物得率和對映體純度低等缺陷，主要是由于底物溶解度較低、酶對底物的特異性及受產(chǎn)物抑制的影響，從而限制其工業(yè)化應用。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種利用雙酶法(AuEH2^A250I和VrEH3)對映歸一性水解外消旋環(huán)氧苯乙烷(rac-SO)制備高對映純產(chǎn)物(R)-苯乙二醇(PED)的方法。VrEH3是自身對映歸一性水解的酶，在攻擊(S)-SO的過程中同時攻擊(R)-SO，而AuEH2^A250I主要攻擊(R)-SO。

所述方法是向緩沖體系添加終濃度為20～200mM的rac-SO作為底物，同時加入環(huán)氧化物水解酶突變體AuEH2^A250I和環(huán)氧化物水解酶VrEH3，反應溫度為10℃至30℃。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述環(huán)氧化物水解酶突變體AuEH2^A250I是以重組表達該環(huán)氧化物水解酶突變體AuEH2^A250I的重組細胞的形式添加到緩沖體系中。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述環(huán)氧化物水解酶VrEH3是以重組表達該環(huán)氧化物水解酶VrEH3的重組細胞的形式添加到緩沖體系中。

在本發(fā)明的一種實施方式中，將重組大腸桿菌E.coli/(AuEH2^A250I)制成菌濃度為100mg/mL的、酶比活力為78mU/mg濕菌體的菌懸液，然后用于催化反應。

在本發(fā)明的一種實施方式中，將重組大腸桿菌E.coli/VrEH3制成菌濃度為100mg/mL的、酶比活力為6mU/mg濕菌體的菌懸液，然后用于催化反應。

在本發(fā)明的一種實施方式中，環(huán)氧化物水解酶突變體AuEH2^A250I與環(huán)氧化物水解酶VrEH3的用量參照兩酶活力比39：(24～42)。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述緩沖體系是100mmol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液。

在本發(fā)明的一種實施方式中，底物的初始反應濃度為50mM。

在本發(fā)明的一種實施方式中，環(huán)氧化物水解酶突變體AuEH2^A250I與環(huán)氧化物水解酶VrEH3的用量參照兩酶活力比39：42。

在本發(fā)明的一種實施方式中，反應溫度為25℃。

本發(fā)明以rac-SO為底物，E.coli/(VrEH3)和E.coli/(AuEH2^A250I)全細胞作為催化劑，利用兩種酶在催化水解rac-SO時具有互補的對映選擇性和區(qū)域選擇性的特性對映歸一性水解底物得到高對映純產(chǎn)物(R)-PED。本發(fā)明顯著提高了底物rac-SO的濃度、催化效率和(R)-苯乙二醇PED的對映體純度。與單酶催化相比，雙酶催化相同底物(10mM)的時間由5.5h縮短到了70min。底物濃度從20mM提高到了200mM，克服了單酶催化時底物濃度較高所產(chǎn)生的產(chǎn)物抑制酶活性及催化效率低的問題。催化10mM rac-SO制備(R)-PED的ee值為96.0％，與單酶催化的91％(VrEH3)和18.6％(AuEH2^A250I)相比有很大的提高。催化200mM rac-SO制備(R)-PED的ee值為94％。本發(fā)明是首次把來源于綠豆的VrEH3和來源于宇佐美曲霉的AuEH2^A250I結合對映歸一性水解rac-SO。具有適合于工業(yè)應用的理想特性，本發(fā)明為該酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論基礎，有較大的工業(yè)化應用潛力及經(jīng)濟價值。

附圖說明

圖1：雙酶先后催化反應進程圖

圖2：雙酶同時催化反應進程圖

具體實施方式

實施例1

編碼VrEH3的基因的核酸序列參見GenBank:KR013755.1。表達VrEH3的E.coli/VrEH3工程菌的構建步驟如下：合成目的基因，以pET-28a為表達載體，以E.coli BL21(DE3)為表達宿主構建得到重組菌E.coli/VrEH3。挑取E.coli/VrEH3單菌落于2mL LB培養(yǎng)基中37℃條件下培養(yǎng)12h，以2％(v/v)的接種量轉接入新鮮的100mL的LB培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)2h后，加入誘導劑IPTG至終濃度為0.05mM，35℃培養(yǎng)10h，誘導VrEH3的高效表達，8000rpm離心收集菌體，按照1g濕菌體10mL緩沖液的比例加入100mM，pH 7.0磷酸鹽緩沖液懸浮制備成菌濃為100mg/mL菌懸液保存待用。

AuEH2的氨基酸序列及重組表達該酶的工程菌E.coli/(reAuEH2)的構建參見公開號為CN102994470A的發(fā)明專利申請。突變體AuEH2^A250I是將公開號為CN102994470A的發(fā)明專利申請中的SEQ ID NO.2的氨基酸序列的第250位的丙氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔亟M表達突變體AuEH2^A250I的重組大腸桿菌E.coli/(AuEH2^A250I)的方法參照上述E.coli/(reAuEH2)的構建方法。挑取E.coli/(AuEH2^A250I)單菌落于2mL LB培養(yǎng)基中37℃條件下培養(yǎng)12h，以2％(v/v)的接種量轉接入新鮮的100mL的LB培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)2h后，加入誘導劑IPTG至終濃度為0.2mM，25℃培養(yǎng)8h，誘導AuEH2^A250I的高效表達，8000rpm離心收集菌體，按照1g濕菌體10mL緩沖液的比例加入100mM，pH 7.0磷酸鹽緩沖液懸浮制備成菌濃為100mg/mL菌懸液待用。

實施例2

VrEH3全細胞比酶活的測定方法：在1.5mL的EP管中加入800μL VrEH3菌懸液和150μL磷酸鉀緩沖液(100mM，pH＝7.0)，25℃預熱5min；加入50μL 200mM的rac-SO，反應15min后取100μL于1mL乙酸乙酯含(1mg/mL的正己醇為內標)進行萃取，經(jīng)無水硫酸鎂干燥后過0.22μm的有機膜。

AuEH2^A250I比酶活的測定方法：在1.5mL的EP管中加入33μLAuEH2^A250I菌懸液和917μL磷酸鉀緩沖液(100mM，pH＝7.0)，35℃預熱2min；加入50μL 200mM的rac-SO，反應15min后取100μL于1mL乙酸乙酯含(1mg/mL的正己醇為內標)進行萃取，經(jīng)無水硫酸鎂干燥后過0.22μm的有機膜。

上述有機膜過濾后的樣品分析采用氣相色譜儀GC-2010PLUS、手性氣相色譜柱CYCLOSIL-B和氫火焰離子化檢測器。進樣口和檢測器溫度均為250℃；初始柱溫100℃，以5℃/min升溫至210℃；載氣為氮氣，流速3.0mL/min，分流比1:50。在此檢測條件下，正己醇、(R)-SO、(S)-SO、(S)-PED和(R)-PED的保留時間分別為3.738、6.368、6.492、17.437和17.574min。產(chǎn)物的對映過剩率ee_p(％)＝[(S_P-R_P)/(S_P+R_P)]×100％；轉化率c(％)＝1-(S+R)/(S₀+R₀)；比酶活＝(S₀+R₀)×c/15min×100mg/mL×菌懸液體積。其中：S₀和R₀分別代表(S)-和(R)-SO的初始底物濃度，S和R分別代表(S)和(R)-SO的最終摩爾濃度。S_P和R_P分別代表(S)-和(R)-PED的最終摩爾濃度。AuEH2^A250I和VrEH3的全細胞比酶活分別為78mU/mg和6mU/mg濕菌體。

實施例3雙酶加入順序對轉化率和產(chǎn)物ee_p的影響

雙酶依次加入催化體系：在1mL的反應體系中，400μl VrEH3全細胞菌懸液于517μl 100mmol/L，pH 7.0的磷酸鹽緩沖液后25℃預熱5min，加入50μlrac-SO(終濃度為10mmol/L)開始反應，定期取樣GC檢測直至(S)-SO水解完全，此時加入33μlAuEH2^A250I全細胞菌懸液進行催化剩余構型底物(R)-SO。

雙酶同時加入催化體系：在1mL的反應體系中，400μl VrEH3與33μlAuEH2^A250I全細胞懸液加入到于517μl的100mmol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液，25℃預熱5min，加入50μl rac-SO(終濃度為10mmol/L)開始反應。在反應過程中定時取樣于1mL的乙酸乙酯中(含1mg/mL的正己醇為內標)，震蕩混勻，吸取上層有機相于適量的無水MgSO₄進行干燥，過0.22μm的有機膜后通過高效氣相色譜分析儀進行分析測定。

結果顯示，雙酶依次加入進行催化時反應3h時底物完全轉化，轉化率為100％，ee_p為95.1％。雙酶同時加入進行催化時底物完全轉化所需時間為100min，轉化率為100％，ee_p為95.2％。從ee_p和轉化率來看，這兩種催化模式?jīng)]有明顯的區(qū)別，但雙酶同時加入進行催化時所需的時間明顯比依次催化少。所以應選擇同時加入雙酶對外消旋環(huán)氧苯乙烷進行催化水解。

實施例4雙酶比例和溫度對對映歸一性水解的影響

AuEH2^A250I全細胞菌懸液和VrEH3全細胞菌懸液的比酶活分別為78mU/mg濕菌體和6mU/mg濕菌體，VrEH3是自身對映歸一性水解的酶，在攻擊(S)-SO的過程中同時攻擊(R)-SO，而AuEH2^A250I主要攻擊(R)-SO。反應體系中VrEH3和AuEH2^A250I全細胞菌懸液體積比在8:1至18:1(即400μl:50μl至400μl:25μl)范圍內變化時，在8:1到14:1的小范圍內，產(chǎn)物ee_p從91.9％升高到96.0％，在14:1到16:1的小范圍內，ee_p則降低到95.5％。

分別在10℃至30℃溫度條件下進行上述雙酶同時加入到催化體系中的催化水解反應，外消旋底物濃度為10mM，待底物完全水解完全時取樣，處理后氣相檢測，數(shù)據(jù)分析結果發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高，酶的對映選擇性降低，ee_p降低。當溫度從10℃升高到30℃時，ee_p從97％降低為94.9％。雖然低溫條件下可以提高酶的對映選擇性，但是低溫條件下不易操作，因此選擇25℃為最適的反應溫度(96％)。

實施例5初始底物濃度對雙酶對映歸一性水解的影響

在有關雙酶對映歸一性水解外消旋環(huán)氧苯乙烷的相關報道中，產(chǎn)物抑制是制約初始底物的最大障礙。

在1mL的反應體系中，400μl VrEH3與33μlAuEH2^A250I全細胞懸液加入到于517μl的100mmol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中，25℃預熱5min，加入100μl rac-SO使其終濃度為20mmol/L，開始反應，定期取樣GC檢測直至(S)-SO水解完全。同理，當反應體系中加入250μl rac-SO時底物終濃度為50mM。加入400μlrac-SO時終濃度為80mM。

當?shù)孜餄舛葹?0mM，反應進行16h時底物轉化率為68.7％、產(chǎn)物ee_p為73.9％，即使繼續(xù)延長反應時間，底物依然不能被完全轉化。因此綜合考慮反應時間(13h)與產(chǎn)物ee_p(94.4％)，50mM底物作為最適的初始底物濃度。

VrEH3和AuEH2^A250I全細胞懸液的濃度為100mg/mL，400μlVrEH3中濕菌體的重量為40mg，33μlAuEH2^A250I中濕菌體的重量為0.33mg，所以在1mL反應體系中VrEH3的濕菌體濃度為40mg/mL，AuEH2^A250I濕菌體的濃度為0.33mg/mL。

同樣的反應體系(1mL)，等比例擴大底物與酶的濃度，當?shù)孜餄舛确謩e擴大2倍，4倍，8倍即底物濃度為100mM,200mM，400mM時，反應體系中AuEH2^A250I的濕菌體的濃度為0.66mg/mL，1.32mg/mL和2.64mg/mL，VrEH3的菌懸液的濃度為80mg/mL，160mg/mL和320mg/mL。當?shù)孜餄舛葹?00mM時，底物不能被完全催化，分析原因為產(chǎn)物抑制了酶的活性。因此最高的底物濃度為200mM，此時反應時間和產(chǎn)物ee_p分別為13.5h和94％。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。