本發(fā)明涉及藥學及醫(yī)學相關領域，特別涉及糖尿病的預防和治療；更具體地說，本發(fā)明涉及一類新型肽及其用途，以及含有該新型肽及其衍生物和類似物的藥物制劑，能用于預防、治療人糖尿病。

背景技術：

1型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus，T1DM)通常表現為胰腺炎(胰島周圍單核細胞浸潤)、β細胞壞死或減少(與發(fā)病時間成正相關)或炎性因子表達。T1DM主要是由自身免疫系統紊亂造成的，自身反應性T細胞和自身抗原活化B細胞擴增，從而激活自身免疫系統對胰腺β細胞進行攻擊，造成胰島素分泌不足所導致的。自身抗原免疫能夠干擾MHC class II復合體與自身反應性CD4T細胞反應，使抗原特異性T細胞對組織中的自身抗原無應答，減少Langerhans胰島炎性浸潤。因此，可以通過誘導自身抗原免疫耐受或抑制免疫反應來保護β細胞，并通過C-肽衡量殘余β細胞功能。

自身抗原熱休克蛋白65(Heat shock protein，Hsp65)通常位于胰腺β細胞的成熟胰島素分泌小管。DiaPep277是其上一個主要的T表位片段(原P277片段，VLGGGCALLRCIPALDSLTPANED)修飾后的合成肽，是位于C末端的24個aa(437-460)。P277能夠通過Toll樣受體2(TLR2)受體激活抗炎效應因子使免疫反應類型偏向調節(jié)型。II期臨床試驗結果表明在早期T1DM中，DiaPep277能夠更好的保持β細胞功能，維持C肽水平，減少外源胰島素需求。

但也有文獻表明，熱休克蛋白60(Heat shock protein，Hsp60)同時也能夠與血管內皮細胞上的TLR4結合，激活NF-κB通路，促進炎性基因和炎性因子表達，對血管內皮細胞造成損傷。動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)病人血清中可以檢測到高水平Hsp60抗體。P277肽免疫C57BL/6小鼠時也會引起嚴重的血管內皮損傷。此外，免疫高脂飼養(yǎng)新西蘭大白兔時會誘發(fā)嚴重的動脈粥樣硬化副作用，同時在動脈硬化斑塊周圍檢測到大量P277抗體聚集，該現象表明在P277肽中，同時存在調節(jié)細胞免疫應答的T表位和引發(fā)體液免疫的B表位。

通過表位掃描技術確定出精確B表位，在最大程度保證T表位完整性和B表位空間結構的前提下，通過單個或數個氨基酸突變或刪除改造B表位。確定B表位所在氨基酸序列后，將其刪除后，構建出新型糖尿病疫苗肽VP能有效調節(jié)體內免疫水平，有效預防和糖尿病。更重要的是，VP調節(jié)肽能夠基本上去除P277引起動脈粥樣硬化的副作用，對動脈血管內皮不會再有損傷。

技術實現要素：

發(fā)明目的：

本發(fā)明的目的是提供一種新型免疫調節(jié)肽，能夠在保證致動脈粥樣硬化副作用消除的前提下，有效預防糖尿病。

技術方案：

本免疫調節(jié)肽VP是根據P277野生型進行改造，刪除443-445位3個氨基酸“ALL”。起到消除P277致動脈粥樣硬化副作用，并維持其調節(jié)體內免疫反應狀態(tài)，從而保持預防和治療糖尿病的作用。

VP：VLGGGC RCIPALDSLTPANED

P277：VLGGGCALLRCIPALDSLTPANED

VP肽在預防或治療1型糖尿病藥物中的應用。

含有上述氨基酸序列、通過氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列，及其與藥物載體或相關活性物質組合而成的藥物制劑在預防或治療1型糖尿病藥物中的應用。

有益效果：

P277是人熱休克蛋白HSP60中的一段功能性多肽，由24個氨基酸組成，序列為437VLGGGCALLRCIPALDSLTPANED460。P277中同時含有與糖尿病相關的T表位和與動脈粥樣硬化有關的B表位。本發(fā)明中，VP肽將測得B表位氨基酸去除，但并未大幅度改變P277肽空間構象和生理功能，起到了略優(yōu)于P277的降糖作用。

本發(fā)明的優(yōu)點在于刪除P277肽中443-445位的B表位相關氨基酸，構建了一種無動脈粥樣硬化副作用的新型1型糖尿病預防肽。實驗結果證明，VP肽免疫新西蘭大白兔血脂四項指標(總膽固醇TC，總甘油三酯TG，低密度脂蛋白LDL，高密度脂蛋白HDL)降低，hs-CRP水平也明顯下調。主動脈中脂類聚集現象降低，致動脈粥樣硬化的副作用較P277肽顯著減輕，與PBS對照組無異。同時此疫苗肽VP能夠有效延遲小鼠T1DM發(fā)病，延長NOD小鼠生存時間，維持C肽水平及β細胞正常分泌功能，有效控制NOD小鼠血糖水平，并降低發(fā)病小鼠胰島炎級別。

附圖說明

圖1 VP肽對低脂或高脂飼養(yǎng)的新西蘭大白兔血清內血脂四項指標的影響

圖2 VP肽對低脂或高脂飼養(yǎng)的新西蘭大白兔血清內hs-CRP含量的影響

圖3 VP肽對心臟主動脈瓣油脂聚集的影響

圖4 VP肽對NOD小鼠血糖的影響；

圖5 VP肽對NOD小鼠體重的影響

圖6 VP肽對NOD小鼠累計發(fā)病率的影響

圖7 VP肽對NOD小鼠C肽水平的影響

圖8 VP肽對NOD小鼠胰島形態(tài)的影響

具體實施方式

下面結合一些實例對發(fā)明做進一步詳細說明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

實施例1：VP肽動脈粥樣硬化的副作用評價

1、新西蘭大白兔飼養(yǎng)及免疫

將新西蘭大白兔根據飼養(yǎng)條件不同分為2大組，分別為低脂組(LCD)24只，高脂組(HCD)24只。低脂組始終喂養(yǎng)普通飼料，高脂組始終飼喂高脂飼料，直至實驗結束。高脂飼料配方為在普通家兔飼料的基礎上添加1％膽固醇、6％豬油和10％的蛋黃粉。兩組同時分為PBS組、P277組、VP組、AP組四組，每組各6只。各組動物從第零周開始第一次免疫，共免疫四次，兩次間隔4周。將P277/VP/AP溶于無菌PBS中，濃度為1mg/mL.首次免疫采用CFA作為佐劑，此后三次加強免疫以IFA為佐劑。每只家兔注射1mL(即500μg多肽/只)，皮下6點免疫。PBS對照組僅用無菌PBS溶液代替蛋白溶液，其他步驟相同。

2、新西蘭大白兔血脂指標及hs-CRP水平

每四周耳動脈取血2-4mL，室溫凝固20min后，3000rpm離心10min。ELISA法檢測血清中TC、TG、LDL、HDL四項血脂指標。結果如圖1所示，LCD組內各免疫組血脂四項指標在觀測期內均無顯著性差異。VP組TC和HDL水平較PBS組明顯降低，而TG和LDL則較P277組明顯降低。LDL/HDL平衡中P277組明顯高于PBS組，存在一定程度的血脂紊亂，而VP組則與PBS組相似，均明顯低于P277組，表明基本去除此副作用。

同時以雙夾心ELISA法測定血清中hs-CRP水平，結果如圖2所示。各組實驗動物血清中hs-CRP在基礎狀態(tài)時均無顯著性差異。16周實驗期結束后，HCD+PBS組較LCD+PBS組hs-CRP含量明顯升高，LCD其余各組之間差異均無統計學意義。而HCD組內，VP組較P277組hs-CRP含量明顯降低。

3、新西蘭大白兔主動脈瓣油脂聚集評估

心臟主動脈瓣制作4μm冷凍切片后，行油紅染色，結果如圖3所示。LCD組各組油紅聚集程度均明顯低于HCD組，僅有少量油紅油滴沉積。而HCD組切片多有大量大塊油紅O附著。HCD組中，P277組油滴沉積嚴重程度明顯高于VP組，主動脈瓣膜上染色明顯。

實施例2：VP肽的糖尿病相關藥效學評價

1、動物免疫

將25只4周齡雌性NOD/LtJ小鼠隨機分為4組，AP組、VP組、P277組(陽性對照)和油劑組(空白對照)。從NOD第5周開始每兩周頸部皮下給藥1次，共3次，分別為第5，7，9周給藥。給藥前多肽溶于力保肪寧成1mg/mL，給藥量80μg/只。

2、對NOD小鼠體重血糖的影響

實驗開始后，每兩周NOD小鼠眼眶靜脈叢取血約0.5mL，用于血清收集；并測量小鼠體重。同時用血糖監(jiān)測儀尾尖取血測定NOD靜脈血糖濃度，直至實驗結束。前三次取血均需在給藥前完成，遵循先取血檢測再給藥的原則，每次采血點相同。血糖值達到血糖儀H1mmol/L(超過最高測量濃度)后，統一記為35mmol/L。若發(fā)病小鼠在觀測期內死亡，為便于分析，其血糖及體重均在整個觀測期內記為死亡前的最后一次測定值。體重實驗結果如圖4所示，血糖實驗結果如圖5所示。在小鼠血糖維持和體重控制方面，VP肽效果與P277肽相當，明顯優(yōu)于PBS對照組。

3、對NOD小鼠發(fā)病率的影響

觀測期內，每兩周動態(tài)觀測所有組NOD小鼠發(fā)病狀況，記錄NOD小鼠發(fā)病狀況和死亡時間。小鼠血糖升高后，連續(xù)兩周未禁食血糖值均≥11mmol/L，并伴有三多一少“多食、多飲、多尿，體重減少”的經典糖尿病病狀，即視為已發(fā)病。發(fā)病率統計結果如圖6所示。VP肽和P277肽均能明顯延緩NOD小鼠T1DM發(fā)病進程，且在此方面，VP肽作用更優(yōu)，從而能夠減輕發(fā)病程度，降低發(fā)病率。

4、對NOD小鼠血清中C肽水平的影響

每6周ELISA法檢測一次小鼠血清中C肽水平，結果如圖7所示。VP免疫組和P277免疫組NOD小鼠血清中C肽始終維持在較高水平，明顯優(yōu)于PBS組。這表明P277和VP多肽對胰島β細胞的分泌功能有明顯保護作用，其中VP又能更好地維持胰島素正常分泌，延緩T1DM發(fā)病。

5、對NOD小鼠胰島形態(tài)的影響

31周觀測期后，處死全部小鼠并取其胰腺，福爾馬林固定后HE染色，觀察胰腺狀態(tài)，結果如圖8所示。PBS對照組胰島幾乎已經完全破壞，難以找到明晰的胰島。僅找到數個病變疑似胰島，均出現大量空泡，無法維持完整的胰島形狀，難以找到胰島界限。P277組可以找到胰島，基本可以維持胰島正常形態(tài)，偶見空泡形成，但胰島界限明顯。VP組胰島數量較多，胰島形態(tài)正常，界限明顯，偶見炎性細胞浸潤。對照組胰島炎性程度明顯高于P277和VP組，故VP多肽可以較好的維持胰島形態(tài)，減少炎性浸潤，保護胰島功能。