本發(fā)明涉及生物分子標記技術領域，特別涉及一種提高轉基因丹參中陽性率的方法。
背景技術：
丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)是唇形科鼠尾草屬多年生草本植物，主要以其干燥根以及根莖入藥，廣泛用于治療心腦血管疾病，是一種臨床需求量不斷增加的常用藥用植物。伴隨著丹參基因組學、轉錄組學研究的快速發(fā)展，丹參已經(jīng)成為一種潛在的模式植物。
目前丹參的遺傳轉化研究也得到了廣泛關注，主要有如下幾方面：上海師范大學的開國銀教授用發(fā)根農(nóng)桿菌獲得轉基因丹參的毛狀根；陜西師范大學的王喆之教授、東北林業(yè)大學的唐中華教授、長春中醫(yī)藥大學張輝教授課題組以丹參葉片作為外植體，采用葉盤轉化法獲得轉基因丹參植株。葉盤轉化法是將健康的帶傷口的無菌葉片在農(nóng)桿菌菌液中浸泡后，共培養(yǎng)2至3天，轉移到含抑制劑的培養(yǎng)基上去除農(nóng)桿菌，同時加入抗生素進行選擇培養(yǎng)最終獲得再生植株。葉盤法操作簡單，重復性高，是丹參根癌農(nóng)桿菌轉化的常用方法
進一步地，陜西師范大學的王喆之教授等建立了誘導丹參植株的轉基因體系，其首先將繼代培養(yǎng)約10天的丹參幼嫩葉片作為外植體，切成0.5cm2的小塊，在含有1mg/L 6-BA和0.1mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上預培養(yǎng)一天后置于包含質(zhì)粒pCAMBIA 2301的根癌農(nóng)桿菌EHA105制備成的菌液中侵染后重新放置于新的含有1mg/L 6-BA和0.1mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3天后在含有200mg/L頭孢霉素和60mg/L卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上進行抗性篩選，每10天更換一次培養(yǎng)基直到獲得抗性芽，小心切下?lián)Q至1/2MS選擇培養(yǎng)基中進行生根篩選，最終獲得陽性轉基因植株(參考Yan Y P,Wang Z Z.Genetic transformation of the medicinal plant Salvia miltiorrhiza,by Agrobacterium tumefaciens-mediated method[J].Plant Cell Tissue&Organ Culture,2007,88(2):175-184.；李晉.擬南芥抗寒基因ICE1轉化丹參的研究[D].西安，陜西師范大學，2013)；東北林業(yè)大學唐中華教授為以丹參無菌苗葉片為外植體，采用pCAMBIA 2301作植物表達載體通過農(nóng)桿菌LBA4404介導優(yōu)化并建立了遺傳轉化體系，在含1mg/L 6-BA和0.5mg/L2,4-D的MS共培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3天，轉移到含有400mg/L的特美汀、1mg/L6-BA和0.5mg/L 2,4-D的MS除菌培養(yǎng)基上去除多余的農(nóng)桿菌，每10天繼代一次，待長出幼芽后在含50mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基上篩選幼芽后，轉移到含有0.2mg/L IBA的1/2MS培養(yǎng)基上促進發(fā)根，最終獲得轉基因植株(成海寧.丹參遺傳轉化體系的構建及SmGGPPS和SmKSL的轉基因研究[D].哈爾濱，東北林業(yè)大學,2014)。
目前文獻報道中丹參的葉盤轉化法多采用卡那霉素進行篩選，卡那霉素作為篩選抗性基因NPTII的常用抗生素，主要是通過與30S核糖體結合，影響mRNA密碼的讀取，從而導致蛋白翻譯受阻。但由于丹參品種繁多且品間差異大、外植體培養(yǎng)條件及狀態(tài)不同等原因，本實驗室在對已經(jīng)完成測序工作的99-3品系的丹參進行遺傳轉化研究中發(fā)現(xiàn)99-3丹參葉片對卡那霉素敏感，用它做篩選抗生素時葉片生長容易停止，實驗重現(xiàn)性差。雖然也有報道如長春中醫(yī)藥大學的胥彬對丹參侵染過程中適宜的潮霉素Hyg抗性的濃度篩選，用20mg/L、15mg/L、10mg/L、5mg/L、2.5mg/L進行丹參適宜Hyg適宜抗性的選擇時發(fā)現(xiàn)20mg/L、15mg/L、10mg/L、5mg/L的篩選培養(yǎng)基上丹參外植體全部褐化死亡，選用2.5mg/L的Hyg進行篩選，但轉基因的植株中陽性率較低。本實驗前期在用10mg/L的Hyg進行篩選時比較容易獲得丹參再生植株，但陽性率依然不高，因此有必要尋找一種獲得高陽性率的丹參遺傳轉化方法。
技術實現(xiàn)要素：
鑒于此，有必要針對傳統(tǒng)技術存在的問題，提供了一種快速、簡便、高陽性率的提高轉基因丹參中陽性率的方法。
為達到發(fā)明目的，提供一種提高轉基因丹參中陽性率的方法，所述方法包括：取丹參組培苗的葉片，將葉片去除葉片邊緣后剪切成葉盤；將剪切好的葉盤放置于不含潮霉素的第一固體培養(yǎng)基上，在25℃，光照16h/黑暗8h的條件下預培養(yǎng)兩天；將帶質(zhì)粒的農(nóng)桿菌接種于含卡那霉素50mg/L和利福平25mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4-0.8；取2mL農(nóng)桿菌菌液離心，去除上清液，收集菌體后用MS重懸至30-40mL用于侵染；將預培養(yǎng)過后的丹參葉片放入含有農(nóng)桿菌的MS培養(yǎng)基中侵染10-15min，中間輕輕晃動以使菌液充分接觸葉片；取出侵染后的葉盤，置于無菌濾紙上以吸干表面殘余的菌液；將去除表面菌液的葉盤置于新的第一固體培養(yǎng)基上，在25℃，黑暗條件下共培養(yǎng)3天；2-3天后將共培養(yǎng)過后的葉片轉移至含有潮霉素的第二固體培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)，10-15天更換一次第二固體培養(yǎng)基以免抗生素失效；將成功分化出的小芽轉移至含有潮霉素的第三固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待葉片長得較大時再轉移至含有潮霉素和吲哚丁酸的第四固體培養(yǎng)基上誘導生根和促進植株生長，其中，所述第二固體培養(yǎng)基、第三固體培養(yǎng)基和第四固體培養(yǎng)基中的潮霉素濃度相同。
在其中一個實施例中，所述第二固體培養(yǎng)基、第三固體培養(yǎng)基和第四固體培養(yǎng)基中的潮霉素濃度為50mg/L。
在其中一個實施例中，所述第一固體培養(yǎng)基的成分為：MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/L NAA；所述第二固體培養(yǎng)基的成分為：MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+50mg/L Hyg+300mg/L Cef；所述第三固體培養(yǎng)基的成分為：MS+50mg/L Hyg+300mg/L Cef；所述第四固體培養(yǎng)基的成分為：1/2MS+0.2mg/L IBA+50mg/L Hyg+300mg/L Cef。
在其中一個實施例中，取生長旺盛、顏色鮮綠的生長4-7周的健碩的丹參組培苗的葉片。
在其中一個實施例中，將葉片去除葉片邊緣后剪切成1cm2大小的葉盤。
在其中一個實施例中，所述將帶質(zhì)粒的農(nóng)桿菌接種于含卡那霉素50mg/L和利福平25mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4-0.8步驟中的農(nóng)桿菌采用GV3101農(nóng)桿菌菌株。
在其中一個實施例中，所述將帶質(zhì)粒的農(nóng)桿菌接種于含卡那霉素50mg/L和利福平25mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4-0.8步驟中的農(nóng)桿菌的質(zhì)粒中含有pri-miR828序列。
本發(fā)明的有益效果包括：上述的提高轉基因丹參中陽性率的方法，將Hyg的濃度提高到較高濃度(例如50mg/L Hyg)，最終建立起陽性率接近100％的效率，高效可靠地丹參植株遺傳轉化體系，為進一步利用基因工程技術改良丹參品質(zhì)奠定了基礎。
具體實施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例對本發(fā)明提高轉基因丹參中陽性率的方法進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
如圖1所示，為一個實施例中的一種提高轉基因丹參中陽性率的方法的步驟流程圖。具體包括以下步驟：
步驟101，取丹參組培苗的葉片，將葉片去除葉片邊緣后剪切成葉盤。
本實施例中，取生長4-7周的丹參組培苗的葉片，去除葉片邊緣后剪切成約1cm2大小的葉盤，剪切過程應當快速。
步驟102，將葉盤放置于不含潮霉素的第一固體培養(yǎng)基上，在25℃，光照16h/黑暗8h的條件下預培養(yǎng)兩天。
本實施例中，將剪切好的葉盤放置于第一固體培養(yǎng)基SmT1(MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA)固體培養(yǎng)基上25℃，光照16h/黑暗8h的條件下預培養(yǎng)兩天。
步驟103，將帶質(zhì)粒的農(nóng)桿菌接種于含卡那霉素50mg/L和利福平25mg/L的LB(Luria-Bertani培養(yǎng)基)液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4-0.8。
本實施例中，將帶含有pri-miR828序列的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101接種于含卡那霉素50mg/L和利福平25mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4-0.8。
步驟104，取2mL農(nóng)桿菌菌液離心，去除上清液，收集菌體后用MS(MS culture medium)液體培養(yǎng)基重懸至30-40mL用于侵染。
本實施例中，取2mL農(nóng)桿菌菌液離心(4000rpm離心10min)，去除上清液(LB培養(yǎng)基)，收集菌體后用MS重懸至30-40mL用于侵染。
步驟105，將預培養(yǎng)過后的葉片放入含有農(nóng)桿菌的MS培養(yǎng)基中侵染10-15min，中間輕輕晃動以使菌液充分接觸葉片。
本實施例中，將預培養(yǎng)過后的丹參葉片放入含有農(nóng)桿菌的MS培養(yǎng)基中侵染10-15min，中間輕輕晃動以使菌液充分接觸葉片。
步驟106，取出侵染后的葉盤，置于無菌濾紙上以吸干表面殘余的菌液。
步驟107，將去除表面菌液的葉盤置于新的第一固體培養(yǎng)基上，在25℃，黑暗條件下共培養(yǎng)3天。
本實施例中，將去除表面菌液的葉盤置于新的第一固體培養(yǎng)基SmT1培養(yǎng)基上，25℃，黑暗條件下共培養(yǎng)3天。
步驟108，2-3天后將共培養(yǎng)過后的葉片轉移至含有潮霉素的第二固體培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)，每隔10-15天更換一次第二固體培養(yǎng)基以免抗生素失效。
本實施例中，2-3天后，將共培養(yǎng)過后的葉片轉移至第二固體培養(yǎng)基SmT2(MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+50mg/L Hyg+300mg/L Cef)培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)，10-15天更換一次SmT2培養(yǎng)基以免抗生素失效。
步驟109，將成功分化出的小芽轉移至含有潮霉素的第三固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待葉片長得較大時再轉移至含有潮霉素和吲哚丁酸，即促進發(fā)根能力較強的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的第四固體培養(yǎng)基上誘導生根和促進植株生長，其中，第二固體培養(yǎng)基、第三固體培養(yǎng)基和第四固體培養(yǎng)基中的潮霉素濃度相同。
本實施例中，將成功分化出的小芽轉移至第三固體培養(yǎng)基SmT3(MS+50mg/L Hyg+300mg/L Cef)培養(yǎng)基上，待葉片長得較大時再轉移至含吲哚丁酸的第四固體培養(yǎng)基SmT4(1/2MS+0.2mg/L IBA+50mg/L hyg+300mg/L Cef)上誘導生根和促進植株生長。
本發(fā)明提供的一種提高轉基因丹參中陽性率的方法，應用根癌農(nóng)桿菌介導的葉盤轉化法操作簡便、重復性高、能快速、有效獲得轉基因丹參植株。目前丹參植株遺傳轉化體系多采用卡那霉素進行篩選，但本實驗室在對已經(jīng)完成測序工作的99-3品系的丹參進行遺傳轉化研究中發(fā)現(xiàn)99-3丹參葉片對卡那霉素敏感，用它做篩選抗生素時葉片生長容易停止，實驗重現(xiàn)性差。本技術采用50mg/L Hyg進行篩選時，不僅獲得了陽性轉基因植株，而且陽性率極高，接近100％?？傊景l(fā)明建立了一種以丹參葉片作為外植體，通過根癌農(nóng)桿菌的遺傳轉化法將攜帶外源質(zhì)粒轉入丹參外植體中的高效可靠、簡便的丹參植株提高陽性率的轉化方法。
以上所述實施例的各技術特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術特征的組合不存在矛盾，都應當認為是本說明書記載的范圍。
以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。