本發(fā)明屬于生物工程領域，具體涉及一種檢測牛副流感病毒3型抗體的間接競爭酶聯(lián)適配體方法。

背景技術：

牛副流感病毒3型(BPIV-3)是副黏病毒科、呼吸道病毒屬的成員，能引起牛和其他反芻動物的呼吸道疾病綜合征(BRDC)。牛在運輸及處于其他應激環(huán)境時容易發(fā)生感染，表現(xiàn)出發(fā)熱和嚴重的鼻腔分泌物，甚至引發(fā)肺炎，是引起舍飼牛發(fā)病和死亡的主要原因，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，我國多數(shù)省份也嚴重流行。據(jù)王海勇對臨床千余份牛血清樣品的檢測結(jié)果顯示我國牛群BPIV-3抗體總體陽性率為77.6％，說明我國牛群已經(jīng)普遍感染BPIV。目前尚無治療BPIV3感染的有效藥物。隨著集約化飼養(yǎng)模式的迅速發(fā)展，牛呼吸道疾病綜合征的發(fā)病率也在不斷升高，控制BPIV-3感染、及時診斷，降低發(fā)病率成為目前亟待解決的問題。目前，該病的初步診斷依賴于血清學方法，確診需要進行病原分離和鑒定。常用的血清學方法主要基于病毒中和試驗、熒光抗體試驗、血凝抑制試驗等。病毒中和試驗和熒光抗體試驗操作復雜、耗時，不適于大規(guī)范樣品快速診斷；血凝抑制試驗雖然操作簡單，但需要在對病毒進行增殖的前提下，以BPIV-3病毒粒子為抗原進行檢測，不但耗時而且要求實驗室條件較高。因此，尋找快速、靈敏、可靠的診斷方法，對BPIV-3感染的控制及治療至關重要。

核酸適配體可與靶物質(zhì)以類似抗原-抗體的方式特異性結(jié)合，發(fā)揮生物學效應，是一種新興的具有識別功能的分子。適配體與抗體均具有結(jié)合靶物質(zhì)的功能，相比下來適配體具有分子量小、易于合成、篩選簡便、修飾多樣、親和力高、穩(wěn)定性強等優(yōu)點。適配體的大部分應用也是從抗體應用衍生而來，如光學適配體生物傳感器、質(zhì)量靈敏傳感器、電化學適配生傳感器、酶聯(lián)適配體學說、納米材料傳感器等。目前，核酸適配體已廣泛應用于化學分析與檢測、臨床診斷與治療及藥學等研究領域。最近幾年來，各種新型適配體檢測平臺和適配體治療藥物層出不窮。核酸適配體抗腫瘤藥物AS1411、具有凝血作用的核酸適配體ARC183、針對金黃色葡萄球菌外毒素B(SEB)的適配體等已經(jīng)到臨床應用階段。在獸醫(yī)學研究領域，結(jié)果顯示以核酸適配體建立的酶聯(lián)適配體方法具有很高的特異性和敏感性。為了獲得優(yōu)良的牛副流感病毒3型抗體檢測方法，我們應用前期研究篩選獲得的HN蛋白核酸適配體，優(yōu)化各步驟反應條件，建立了間接競爭酶聯(lián)適配體方法。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術的不足，而提供一種檢測牛副流感病毒3型抗體的間接競爭酶聯(lián)適配體方法，該方法具有良好的特異性，與商品化ELISA試劑盒相比，Ic-ELAA具有更高的陽性檢出率，更適合進行臨床牛副流感疾病的血清學調(diào)查。

本發(fā)明采用如下技術方案：

檢測牛副流感病毒3型抗體的間接競爭酶聯(lián)適配體方法，包括如下步驟：

步驟一，包被：確定HN蛋白包被濃度，吸取HN蛋白溶液包被于ELISA微孔板中，過夜；

步驟二，洗板：甩去包被液，用HEPEST洗滌微孔板三次，甩干；

步驟三，封閉：確定封閉液，向微孔中加入封閉液，37℃孵育2h；

步驟四，加核酸適配體和牛血清：確定核酸適配體Bio-WC-2濃度，并確定牛血清的稀釋倍數(shù)；甩去封閉液，用HEPEST洗滌三次，甩干，同時將Bio-WC-2和牛血清加入到封閉好的微孔中，孵育；

步驟五，洗板：甩去核酸適配體和牛血清，用HEPEST洗滌微孔板三次，甩干；

步驟六，加二抗：確定二抗的稀釋度，向微孔中加入稀釋的HRP-SA，孵育；

步驟七，顯色：甩去二抗，用HEPEST洗滌微孔板四次，拍干孔中殘留的洗滌液，將顯色液A、顯色液B等體積混合，吸取顯色液加入到微孔中，顯色；

步驟八，終止：每孔加入終止液終止顯色；

步驟九，讀數(shù)：使用自動酶標檢測儀讀取每孔在450nm波長處生物吸光度值(OD)；

步驟十，陰陽性臨界值的確定；

步驟十一，Ic-ELAA方法特異性檢測；

步驟十二，臨床牛血清檢測。

更進一步地，所述的檢測牛副流感病毒3型抗體的間接競爭酶聯(lián)適配體方法，包括如下步驟：步驟一，包被：吸取濃度為80ug/mL的HN蛋白溶液包被于96孔ELISA微孔板中，4℃過夜；

步驟二，洗板：甩去包被液，用300μL HEPEST洗滌微孔板三次，甩干，其中所述HEPEST為含0.05％Tween 20的HEPES；

步驟三，封閉：向微孔中加入200μL含1％BSA的HEPES液，37℃孵育2h；

步驟四，加核酸適配體和牛血清：確定核酸適配體Bio-WC-2濃度，并確定牛血清的稀釋倍數(shù)；甩去封閉液，用HEPEST洗滌三次，甩干，同時將50μL濃度為100nM的Bio-WC-2和50μL牛血清原液加入到封閉好的微孔中，37℃孵育1h；

步驟五，洗板：甩去核酸適配體和牛血清，用300μL HEPEST洗滌微孔板三次，甩干，其中所述HEPEST為含0.05％Tween 20的HEPES；

步驟六，加二抗：向微孔中加入100μL 1:6000稀釋的HRP-SA，37℃孵育1h；

步驟七，顯色：甩去二抗，用300μL HEPEST洗滌微孔板四次，拍干孔中殘留的洗滌液，將顯色液A、顯色液B等體積混合，吸取100μL顯色液加入到微孔中，37℃顯色10min；

步驟八，終止：每孔加入50μL終止液(2M H₂SO₄)終止顯色；

步驟九，讀數(shù)：使用自動酶標檢測儀讀取每孔在450nm波長處生物吸光度值(OD)；

步驟十，陰陽性臨界值的確定；

步驟十一，Ic-ELAA方法特異性檢測；

步驟十二，臨床牛血清檢測。

更進一步地，步驟一中所述HN蛋白包被濃度和步驟四中所述Bio-WC-2濃度的確定具體如下：將不同濃度的HN蛋白(10ug/mL、20ug/mL、40ug/mL、80ug/mL和160ug/mL)與不同適配體Bio-WC-2濃度(200nM、100nM、50nM)建立棋盤方陣進行I-ELAA試驗，用酶標儀檢測各孔OD₄₅₀值，通過計算Positive/Negative值來確定HN蛋白包被濃度和核酸適配體Bio-WC-2濃度，確定標準為P/N比值最高且陽性OD₄₅₀值在1.0左右，實驗程序同Ic-ELAA類似，區(qū)別是一抗為100μL Bio-WC-2，不加牛血清；HN蛋白包被條件為4℃過夜。

更進一步地，步驟三中所述封閉液的確定具體如下：將80ug/mL的HN蛋白包被酶標板，4℃包被過夜，洗滌，分別加入不同封閉液5％脫脂奶、10％脫脂奶、1％BSA、3％BSA或10％馬血清，進行I-ELAA試驗，用酶標儀檢測各孔OD₄₅₀值，通過計算P/N值來確定封閉液。

更進一步地，步驟六中所述二抗稀釋度的確定具體如下：將80ug/mL的HN蛋白包被酶標板，4℃包被過夜，1％BSA封閉并洗滌，加入100μL濃度為50nM的適配體Bio-WC-2，二抗HRP-SA按1:2000、1:4000、1:6000、1:8000倍比稀釋進行I-ELAA試驗，用酶標儀檢測各孔OD₄₅₀值，通過計算P/N值來確定封閉液。

更進一步地，步驟四中所述牛血清稀釋倍數(shù)的確定具體為：將80ug/mL的HN蛋白包被酶標板，4℃包被過夜后進行Ic-ELAA試驗，血清為已被證實的強陽性和陰性牛血清，分別做1:1、1:2、1:5、1:10倍稀釋，加入50μL濃度為100nM的Bio-WC-2和50μL不同稀釋倍數(shù)的牛血清，測定OD₄₅₀值，通過公式：PI(％)＝(1－樣本OD₄₅₀/適配體對照OD₄₅₀)×100％，計算PI值，由PI值的高低確定牛血清釋釋倍數(shù)。

更進一步地，步驟十中所述陰陽性臨界值的確定具體為：使用20份臨床采集的牛副流感陰性血清進行Ic-ELAA試驗，計算PI平均值，通過公式：PI_Cut-off＝PI平均值+2×方差(SD)計算陰、陽性臨界值，同時使用20份牛副流感陽性血清檢驗陰、陽性臨界值。

更進一步地，步驟十一中所述建立的Ic-ELAA方法特異性檢測具體為：用所述Ic-ELAA方法分別檢測牛呼吸道合胞體病毒、牛冠狀病毒、牛傳染性支氣管炎病毒感染牛的陽性血清。

更進一步地，步驟十二中所述臨床牛血清檢測具體為：選取50份臨床牛血清樣本，使用所述Ic-ELAA方法和商品化的BPIV3ELISA試劑盒進行檢測，并對檢測結(jié)果進行比較分析。

更進一步地，所述核酸適配體Bio-WC-2的序列如SEQ ID NO.1所示。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明應用前期研究篩選獲得的HN蛋白核酸適配體，優(yōu)化了蛋白包被濃度、適配體濃度、包被液、牛血清稀釋倍數(shù)及二抗稀釋度等各步驟反應條件，建立了檢測牛副流感病毒3型抗體的間接競爭酶聯(lián)適配體方法。該方法具有良好的特異性，與商品化ELISA試劑盒相比，Ic-ELAA方法具有更高的陽性檢出率，更適合進行臨床牛副流感疾病的血清學調(diào)查，及時診斷、隔離飼養(yǎng)陽性牛，減少由于呼吸道疾病的發(fā)生造成的經(jīng)濟損失。同時本發(fā)明建立的Ic-ELAA方法為進一步研發(fā)Ic-ELAA試劑盒和疫苗提供了物質(zhì)和技術保障。

附圖說明

圖1為40份陰性血清和陽性血清抑制率分布圖；

圖2為Ic-ELAA檢測不同病原抗血清，其中橫坐標1-5分別代表牛呼吸道合胞體病毒、牛冠狀病毒、牛傳染性支氣管炎病毒抗血清、牛副流感陰性血清和牛副流感陽性血清。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。

本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。

實施例1

本申請中所述HN蛋白溶液，由本實驗室原核表達和保存；

核酸適配體序列WC-2：

5’-BIO-CGGCGCATGCGTCGACCTGCAGCTAGTTAAAGGATAAGCAAGTCGCCGAGGCAACCAATGTGGGATCCGTCGACGAATTCCCTA，由上海生工生物工程股份公司合成。合成方式：單管合成10OD，摩爾量為12nmol。使用時溶于200μL HEPES緩沖液，95℃孵育10min。迅速冰浴10min后備用。

1、檢測牛副流感病毒3型抗體的間接競爭酶聯(lián)適配體方法如下：

包被：吸取100μL HN蛋白溶液包被于96孔ELISA微孔板中，4℃過夜。

洗板：甩去包被液，用300μL HEPEST(含0.05％Tween 20的HEPES)洗滌微孔板三次，甩干。

封閉：向微孔中加入200μL含3％BSA的HEPES液，37℃孵育2h。

加核酸適配體和牛血清：甩去封閉液，用HEPEST洗滌三次，甩干。同時將50μL Bio-WC-2和牛血清加入到封閉好的微孔中，37℃孵育1h。

洗板：甩去核酸適配體和牛血清，用300μL HEPEST(含0.05％Tween 20的HEPES)洗滌微孔板三次，甩干。

加二抗：向孔中加入100μL稀釋的HRP-SA，37℃孵育1h。

顯色：甩去二抗，用300μL HEPEST洗滌微孔板四次，拍干孔中殘留的洗滌液，將顯色液A、顯色液B等體積混合，吸取100μL顯色液加入到微孔中，37℃顯色10min。

終止：每孔加入終止液2M H₂SO₄50μL終止顯色。

讀數(shù)：使用自動酶標檢測儀讀取每孔在450nm波長處生物吸光度值(OD)。

陰陽性臨界值的確定：使用20份臨床采集的牛副流感陰性血清進行Ic-ELAA試驗，計算PI平均值，通過公式：PICut-off＝PI平均值+2×方差(SD)計算陰、陽性臨界值。同時使用20份牛副流感陽性血清檢驗陰、陽性臨界值。

建立的Ic-ELAA方法特異性檢測：用優(yōu)化的Ic-ELAA方法分別檢測牛呼吸道合胞體病毒、牛冠狀病毒、牛傳染性支氣管炎病毒感染牛的陽性血清，驗證本研究建立的Ic-ELAA方法與其他病毒陽性血清之間是否存在交叉反應。

臨床牛血清檢測：選取50份臨床牛血清樣本，使用建立的Ic-ELAA方法和商品化BPIV3ELISA試劑盒進行檢測，并對檢測結(jié)果進行比較分析。

商品化BPIV3ELISA試劑盒操作程序如下：

(1)加樣：吸取100μL 1:100倍稀釋的血清樣本、陽性對照和陰性對照至反應孔。

(2)孵育：21±3℃孵育30min。

(3)洗滌：吸取300μL wash solution洗板三次，拍干。

(4)二抗：吸取100μL 1:50倍稀釋的二抗至每個反應孔，21±3℃孵育30min。

(5)洗滌：重復步驟(3)。

(6)顯色：加入100μL底物至每孔，21±3℃避光反應10min。

(7)終止：加入50μL終止液。

(8)讀數(shù)：15min內(nèi)在450nm處讀取各孔OD₄₅₀值。

2、HN蛋白包被濃度和Bio-WC-2濃度的確定

將不同濃度的HN蛋白(10ug/mL、20ug/mL、40ug/mL、80ug/mL和160ug/mL)與不同適配體Bio-WC-2濃度(200nM、100nM、50nM)建立棋盤方陣進行I-ELAA試驗，用酶標儀檢測各孔OD₄₅₀值，通過計算Positive/Negative值來確定最佳HN蛋白包被濃度和核酸適配體Bio-WC-2濃度。確定標準為P/N比值最高且陽性OD₄₅₀值在1.0左右。實驗程序與Ic-ELAA類似，區(qū)別是一抗為100μL Bio-WC-2，不加牛血清；HN蛋白包被條件為4℃過夜。

3、封閉液的確定

將80ug/mL的HN蛋白包被酶標板，4℃包被過夜。洗滌，加入不同封閉液如5％脫脂奶、10％脫脂奶、1％BSA、3％BSA和10％馬血清，進行I-ELAA試驗，用酶標儀檢測各孔OD₄₅₀值，通過計算P/N值來確定最佳封閉液。

4、二抗稀釋度的確定

將80ug/mL的HN蛋白包被酶標板，4℃包被過夜，1％BSA封閉并洗滌，加入最佳濃度的適配體Bio-WC-2和最優(yōu)稀釋度的牛血清，洗滌，二抗HRP-SA按1:2000、1:4000、1:6000、1:8000倍比稀釋進行I-ELAA試驗，用酶標儀檢測各孔OD₄₅₀值，通過計算P/N值來確定最佳封閉液。

5、牛血清稀釋倍數(shù)的確定

將最佳濃度的HN蛋白包被酶標板，4℃包被過夜后進行Ic-ELAA試驗，血清為已被證實強陽性和陰性牛血清，分別做1:1、1:2、1:5、1:10倍稀釋。加入最佳濃度Bio-WC-2和稀釋好的牛血清各50μL。測定OD₄₅₀值，通過公式：PI(％)＝(1－樣本OD450/適配體對照OD450)×100％，計算PI，PI值越高，陰陽性血清之間差異越大，則為最佳牛血清釋釋倍數(shù)。

實施例2

1、最佳HN包被濃度和Bio-WC-2濃度的確定

將不同濃度的HN蛋白4℃過夜包被酶標板，1％BSA為封閉液，以I-ELAA試驗優(yōu)化最佳HN蛋白包被濃度和核酸適配體Bio-WC-2最佳反應濃度。結(jié)果如表1所示，選擇OD₄₅₀值接近1，且P/N值最大的條件為最佳條件，即HN蛋白包被濃度為80ug/mL，Bio-WC-2最佳濃度為50nM。在此實驗中，Bio-WC-2加入量為100μL，而在Ic-ELAA中Bio-WC-2加入量為50μL，則Bio-WC-2在后續(xù)的Ic-ELAA中濃度應為100nM。

表1最佳HN包被濃度和Bio-WC-2濃度的確定

2、封閉液的確定

將80ug/mL的HN蛋白包被酶標板，4℃包被過夜。洗滌，加入不同封閉液進行I-ELAA試驗，測定適配體Bio-WC-2和陰性對照孔的OD₄₅₀。測定結(jié)果如表2所示，當使用1％BSA為封閉液時，P/N值最高，且陽性值在1.0左右，因此，選擇1％BSA為封閉液。

表2最佳封閉液的確定

3、二抗稀釋度的確定

將80ug/mL的HN蛋白包被酶標板，4℃包被過夜，1％BSA封閉并洗滌，加入濃度為50nM的適配體Bio-WC-2，不同稀釋度二抗進行I-ELAA試驗。結(jié)果如表3所示，當二抗稀釋度為1:6000時，P/N值最高，且陽性值在1.0左右。因此，確定二抗稀釋度為1:6000。

表3 Ic-ELAA二抗稀釋度的確定

4、牛血清稀釋倍數(shù)的確定

將80ug/mL的HN蛋白包被酶標板，4℃包被過夜，1％BSA為封閉液，進行Ic-ELAA。其中適配體對照值平均值為1.050。根據(jù)公式PI(％)＝(1－樣本OD₄₅₀/適配體對照OD₄₅₀)×100％，計算陽性血清和陰性血清在不同稀釋度下的PI值。計算結(jié)果如表4所示，當血清樣本稀釋倍數(shù)為1:1，即使用血清原液時，陽性血清PI較高，且陰、陽性血清間差別最大。基于此結(jié)果，判定牛血清最佳稀釋度為1:1，即使用血清原液進行測定。

表4 Ic-ELAA牛血清最佳稀釋度的確定

5、陰陽性臨界值的確定

使用20份臨床采集的牛副流感陰性血清，按照上述最優(yōu)反應程序進行Ic-ELAA試驗，計算PI平均值，20份陰性血清PI計算結(jié)果如表5所示，20份陰性牛血清PI平均值為20.75％，SD為5.11％。由此計算得出PI_Cut-off值為30.97％。同時使用20份牛副流感陽性牛血清檢驗陰陽性臨界值，20份陽性血清PI計算結(jié)果如表5所示，所有陽性血清PI均大于31％，為更清楚準確的區(qū)分陰、陽性血清，如圖1所示，本方法設定35％為陰陽性臨界值。

表5 40份陰陽性血清PI值

6、Ic-ELAA方法特異性檢測

使用牛呼吸道合胞體病毒、牛冠狀病毒、牛傳染性支氣管炎病毒感染牛的陽性血清進行Ic-ELAA試驗，以檢驗Ic-ELAA特異性。檢測結(jié)果如圖2所示，僅有牛副流感陽性血清PI值大于35％，其余血清PI值均在臨界值以下，說明本研究建立的Ic-ELAA方法具有良好的特異性。

7、臨床牛血清的檢測

使用本研究建立的Ic-ELAA方法和商品化ELISA，對臨床采集的50份牛血清進行牛副流感病毒抗體檢測，并將檢測結(jié)果進行比較分析。檢測結(jié)果如表6所示，50份臨床血清樣本中，Ic-ELAA法檢測陽性數(shù)32，商品化ELISA為30個陽性，其中兩種方法檢測均為陽性的樣28個，Ic-ELAA方法與商品化試劑盒的符合率＝44/50*100％＝88％。建立的Ic-ELAA方法相對商品化ELISA試劑盒，陽性檢測率稍高。

表6建立的Ic-ELAA方法和商品化ELISA檢測臨床牛血清樣本

本申請利用前期研究篩選的牛副流感病毒3型HN蛋白核酸適配體Bio-WC-2，建立了間接競爭ELAA檢測方法。該方法的最優(yōu)反應條件為HN蛋白包被濃度為80ug/mL，Bio-WC-2最佳濃度為50nM，封閉液為1％BSA，牛血清稀釋倍數(shù)為血清原液，二抗稀釋度為1:6000，陰陽性臨界值為35％。該方法具有良好的特異性，與商品化ELISA試劑盒相比，Ic-ELAA具有更高的陽性檢出率，更適合進行臨床牛副流感疾病的血清學調(diào)查。

本申請中涉及的核苷酸序列如下表7所示：

表7序列表

本行業(yè)的技術人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。