專利名稱：：癌癥的檢測與治療的制作方法癌癥的檢測與治療本發(fā)明涉及檢測和治療黑素瘤和皮膚癌的方法和組合物。更特別地，本發(fā)明揭示了BCSC-1表達在黑素瘤和皮膚癌細胞中改變，使得可以設(shè)計針對這種病變的有效檢測方法和試劑盒。本發(fā)明還揭示了恢復(fù)或增加黑素瘤和皮膚癌細胞中BCSC-1的表達會抑制致腫瘤性，并且代表一種新的且有效的治療黑素瘤和皮膚癌的方法。本發(fā)明可用于檢測黑素瘤和皮膚癌的存在、階段或類型，以及任何患所述疾病的傾向。本發(fā)明可用于任何哺乳動物對象，特別是人對象。黑素瘤是一種侵潤性癌癥，具有導致廣泛轉(zhuǎn)移的傾向。由于目前唯一成功的治療是當腫瘤限于皮膚時進行切除，因此早期診斷是必需的。不幸的是，黑素瘤對常規(guī)的化療在很大程度上具有抗性，迫切需要針對轉(zhuǎn)移的黑素瘤的新治療方法。為了研究色素性皮損和黑素瘤的基因表達譜，使用DATAS技術(shù)研究了良性痣和轉(zhuǎn)移性黑素瘤的選擇性剪接的全局分析。使用這種方法產(chǎn)生了良性痣-轉(zhuǎn)移性黑素瘤的DATAS文庫，其包括217個在良性痣與轉(zhuǎn)移性黑素瘤之間差異表達的克隆。一些克隆通過實時PCR而進行了掃描，它們基于參與細胞凋亡、細胞周期、代謝等可能參與黑素瘤的進展。在這些基因中，我們鑒別了BCSC-1(Martinet.al.PNAS2003)在轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者中始終是被下調(diào)的。我們通過實時PCR在良性痣、非典型痣、原發(fā)黑素瘤或轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者的的70個皮膚活檢樣品中進一步研究了BCSC-1表達。結(jié)果示出在所有黑素瘤患者中BCSC、1表達與健康供體相比均降低。這些結(jié)果在進行分析的黑素瘤細胞系和所有黑素瘤患者中均得以證實。重要的是，當BCSC-1基因在黑素瘤細胞系中異位表達時，黑素瘤細胞終止增殖并經(jīng)歷細胞凋亡。BCSC蛋白在這些細胞中的表達通過Western印跡證實。另外，我們也揭示了當在體內(nèi)注射時，BCSC-1降低轉(zhuǎn)移性黑素瘤的小鼠模型中肺轉(zhuǎn)移的數(shù)目?？傊景l(fā)明揭示了BCSC-1在皮膚癌中是被下調(diào)的，且在所述癌細胞中BCSC-1表達的誘導導致腫瘤進展的抑制。這些數(shù)據(jù)示出BCSC-1在黑素瘤和皮膚癌的發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用，并且代表黑素瘤和皮膚癌的一種新的預(yù)后標志物以及藥物開發(fā)的有價值靶位。本發(fā)明的第一個目的在于檢測對象中黑素瘤或皮膚癌的存在、階段或類型的方法，所述方法包括在體外或離體檢測對象樣品中改變的BCSC-1基因表達的存在情況，這種改變的BCSC-1基因表達的存在指示所述對象中黑素瘤或皮膚癌的存在、階段或類型。根據(jù)本發(fā)明方法的特定實施方案，所述改變的表達是所述樣品中BCSC-1基因的表達降低，更優(yōu)選是所述樣品中BCSC-1基因的長同種型表達降低。本發(fā)明的另一目的在于檢測對象中癌癥的存在、階段或類型的方法，所述方法包括體外或離體地確定所述對象樣品中BCSC-1基因或蛋白質(zhì)的長同種型的(相對)量，所述量是所述對象中癌癥的存在、階段或類型的指示。在一個特殊的實施方案中，將確定的量與對照值或平均值進行對比，或者與在對照樣品中測量的值進行對比。在另一個實施方案中，確定BCSC-1長同種型/BCSC-l短同種型的比率，這個比率的任何降低均是這種癌癥的存在的指示。這種方法可用于檢測任何癌癥，特別是實體癌癥。在這點上，本發(fā)明的另一目的在于檢測對象中癌癥的存在、階段或類型的方法，所述方法包括體外或離體地確定BCSC-1長同種型/BCSC-l短同種型的比率，這個比率與對照條件或參考值或平均值相比降低則是這種癌癥的存在的指示。這種方法可用于檢測任何癌癥，特別是實體癌癥。本發(fā)明的另一目的在于檢測對象中癌癥的存在、階段或類型的方法，所述方法包括體外或離體地確定所述對象的體液樣品中BCSC-1蛋白的(相對)量，這個量是所述對象中癌癥的存在、階段或類型的指示。典型地，確定BCSC-1蛋白的長同種型的(相對)量，這個量與對照值或參考值相比降低是癌癥存在的指示。在一個典型的實施方案中，所述體液樣品得自(例如通過稀釋、濃縮、純化、分離等)全血、血清、血漿、尿液等。這種方法可用于檢測任何癌癥，特別是實體癌癥。本發(fā)明的另一目的在于一種評價對象中黑素瘤和皮膚癌的治療功效的方法，所述方法包括對比(體外或離體)在所述治療之前與之后的對象樣品中的BCSC-1基因表達，所述表達增加是對治療的陽性應(yīng)答的指示。本發(fā)明還涉及BCSC-1蛋白或者編碼BCSC-1蛋白的核酸在生產(chǎn)治療黑素瘤或皮膚癌的藥物中的應(yīng)用，以及相應(yīng)的治療方法。本發(fā)明還涉及BCSC-1激動劑在生產(chǎn)治療黑素瘤或皮膚癌的藥物組合物中的應(yīng)用，以及相應(yīng)的治療方法。本發(fā)明的另一方面在于刺激BCSC-1基因表達的化合物在生產(chǎn)治療黑素瘤或皮膚癌的藥物組合物中的應(yīng)用，以及相應(yīng)的治療方法。本發(fā)明還涉及治療需要治療的對象的黑素瘤或皮膚癌的方法，包括給予所述對象有效量的上述化合物。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述對象具有改變的BCSC-1基因表達。本發(fā)明進一步涉及選擇對于黑素瘤或皮膚癌具有生物學活性的化合物的方法，所述方法包括選擇模擬或剌激BCSC-1表達或活性的化合物的步驟。在一個特定的實施方案中，所述方法包括將測試化合物與包含報道構(gòu)建體的重組宿主細胞接觸以及選擇剌激所述報道基因表達的測試化合物，所述報道構(gòu)建體包含在BCSC-1基因啟動子控制下的報道基因。所述皮膚癌可以選自基底細胞癌、鱗狀細胞癌、Merkel細胞癌、原發(fā)性皮膚淋巴瘤，以及選自皮膚或相關(guān)表面組織的任何其它細胞增殖性疾病。BCSC-1基因表達可以通過本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)檢測，例如通過測序、選擇性雜交、選擇性擴增和/或特異性配體結(jié)合。在一個特定的實施方案中，本發(fā)明使用可以檢測BCSC-1的長同種型、或者區(qū)分長與短同種型、或者測量長同種型/短同種型的比率的試劑和/或技術(shù)。本發(fā)明的另一方面涉及核酸引物，其可以(特異性)擴增BCSC-1的長同種型，或者可以區(qū)分長與短同種型。本發(fā)明的另一方面涉及核酸探針，其(特異性)雜交BCSC-1的長同種型，或者可以區(qū)分長與短同種型。本發(fā)明的另一方面涉及抗體(包括其衍生物及生產(chǎn)雜交瘤)，其(特異性)結(jié)合BCSC-1蛋白的長同種型或者可以區(qū)分長與短同種型。本發(fā)明進一步涉及包含上述引物、探針或抗體的試劑盒。這種試劑盒包含容器或支持物，和/或進行擴增、雜交或結(jié)合反應(yīng)的試劑。本發(fā)明的一特定方面在于包含引物、探針和/或抗體的組合物，其被設(shè)計為特異性檢測BCSC-1的至少一種同種型。附圖簡述圖h色素性皮損的進展模型。圖2:BCSC-1表達在黑素瘤患者中被下調(diào)。由實時PCR檢測良性痣或黑素瘤皮損患者的皮膚活檢組織中BCSC-1基因的RNA表達。值O表示這個基因在良性痣患者(健康供體)中的平均表達水平。具有轉(zhuǎn)移性黑素瘤的所有患者與健康供體中的平均表達值相比均示出較低的表達水平(低約20倍)。圖3:BCSC-1的長同種型在黑素瘤患者中被選擇性下調(diào)。本領(lǐng)域己經(jīng)描述了一些同種型。不同外顯子的實時PCR分析示出僅在長同種型中存在的外顯子(外顯子13-18)是在黑素瘤患者中降低的外顯子。圖4:BCSC-1表達在黑素瘤患者和黑素瘤細胞系中被下調(diào)。所述結(jié)果在較大的患者群及在黑素瘤細胞系中被證實。BCSC-1基因的較長同種型的表達在黑素瘤患者和黑素瘤細胞系中明顯降低。圖5:BCSC-1的異位表達降低黑素瘤細胞增殖。黑素瘤細胞系用編碼BCSC-1的慢病毒載體(lentivector)轉(zhuǎn)導。表達BCSC-1的黑素瘤細胞與陰性對照相比阻止或顯著降低其增殖。這種作用在也用BCSC載體轉(zhuǎn)導的非黑素瘤細胞系(Hda)中未觀測到。圖6:BCSC-1的異位表達通過Western印跡和實時PCR證實。(左側(cè))BCSC-1蛋白的產(chǎn)生通過Western印跡證實，使用抗-HA抗體在用增加量(2和20nl)的編碼BCSC-1的慢病毒載體轉(zhuǎn)導的SK-Mel23細胞中在第12天證實，但是在空載體轉(zhuǎn)導的細胞中無BCSC-l蛋白產(chǎn)生(C-)。用BCSC-1的長同種型和短同種型的載體轉(zhuǎn)染的293T用作陽性對照，也用抗HA抗體檢測BCSC-1。(右側(cè))實時PCR示出SK-Mel23細胞在轉(zhuǎn)導之前及用空載體轉(zhuǎn)導的第8天不表達可檢測水平的BCSC-1。然而，用BCSC-1載體轉(zhuǎn)導的SK-Md23細胞表達高水平的BCSC-1mRNA。圖7:BCSC-1的異位表達阻斷黑素瘤細胞系增殖。圖8:BCSC-1阻斷細胞周期G2-M期中的黑素瘤細胞。圖9:編碼BCSC-1的Hda細胞在細胞周期的G2和M期被停滯。A)用BCSC-1的短同種型轉(zhuǎn)導的Hela細胞；B)用BCSC-1的長同種型轉(zhuǎn)導的Hela細胞。圖10:BCSC-1降低轉(zhuǎn)移性黑素瘤的小鼠模型中的肺轉(zhuǎn)移數(shù)目。發(fā)明詳述黑素瘤的發(fā)生率不斷增加。這是一種迅速蔓延的癌癥，具有導致廣泛分布的傾向。需要基于研究全局基因表達的新方法，以了解基本的黑素瘤發(fā)生事件。如圖1所示，可以使用形態(tài)學技術(shù)分析良性痣(左側(cè))、發(fā)育不良性痣(中間)和惡性黑素瘤(右側(cè))之間的轉(zhuǎn)變。然而，目前僅部分了解控制這些轉(zhuǎn)變的分子機制。為了鑒別控制良性痣與黑素瘤之間轉(zhuǎn)變的分子機制，我們選擇使用稱作DATAS(具有選擇性剪接的轉(zhuǎn)錄體的差異分析)的基因表達譜技術(shù)研究色素性黑素瘤中的選擇性剪接。通過這種全局基因表達分析，我們獲得了得自腫瘤相關(guān)剪接事件的新序列。對從共70名患者的活檢組織(包括良性痣(陰性對照)及不同階段色素性皮損的活檢組織)中提取的RNA進行實時半定量RT-PCR，我們可以證實BCSC-1在轉(zhuǎn)移性疾病患者中被選擇性下調(diào)。此外，我們可以鑒別BCSC-1的長同種型在黑素瘤中被選擇性下調(diào)，而其短同種型基本不受影響。再者，用HA標記的編碼BCSC-1的慢病毒載體在黑素瘤細胞系中的異位表達誘導這些細胞的增殖顯著降低?？傊?，我們的結(jié)果鑒別了一種新基因(BCSC-1)，其在黑素瘤和皮膚癌中被選擇性下調(diào)。僅是選擇的這個基因的"長"同種型(c,f)在轉(zhuǎn)移性黑素瘤中被下調(diào)，而"短"同種型看起來不受影響，由此可以開發(fā)更具特異性的診斷工具以檢測轉(zhuǎn)移性腫瘤中缺少的同種型。最后，異位表達減緩轉(zhuǎn)移性黑素瘤細胞系的細胞增殖，提示BCSC-1在轉(zhuǎn)移性疾病迸展中起作用。本發(fā)明因此提出使用BCSC-1基因和相應(yīng)的表達產(chǎn)物來診斷及治療黑素瘤和皮膚癌，以及用于篩選治療活性藥物。本發(fā)明因此可用于各種對象，特別是人，包括成人和兒童。定義在本發(fā)明中，術(shù)語"BCSC-1基因"是指細胞或生物體中所有BCSC-1核苷酸序列，包括編碼序列、非編碼序列、控制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的調(diào)節(jié)序列(例如啟動子、增強子、終止子等)，以及所有相應(yīng)的表達產(chǎn)物如RNA(例如mRNA)。術(shù)語"基因"應(yīng)解釋為包括任何類型的編碼核酸，包括基因組DNA(gDNA)、互補DNA(cDNA)、合成或半合成DNA，以及任何形式的相應(yīng)RNA。術(shù)語基因特別包括重組核酸，即例如通過裝配、切割、連接或擴增序列而人工產(chǎn)生的任何非天然產(chǎn)生的核酸分子。基因典型是雙鏈的，盡管也可以包括其他形式，如單鏈形式?；蚩梢缘米愿鞣N來源，且可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)獲得，例如通過篩選DNA文庫或者通過從各種天然來源中擴增而獲得。重組核酸可以通過常規(guī)技術(shù)制備，包括化學合成技術(shù)、遺傳工程技術(shù)、酶學技術(shù)或者所述技術(shù)的組合。BCSC-1基因序列可以在基因庫中找到，例如NM—014622和NM一198315。也見SEQIDNO:14所示，其中外顯子邊界以粗體字表示，起始和終止密碼子以下劃線示出。術(shù)語"BCSC-1基因"包括上述任何編碼序列的任何變體、片段或類似物。這些變體包括例如由于個體之間的等位基因變異而天然存在的變體(例如多態(tài)性)、突變的等位基因、選擇性剪接形式等。術(shù)語變體還包括來自其它來源或生物體的BCSC-1基因序列。變體優(yōu)選與上述編碼序列基本同源，即具有至少大約65%的核苷酸序列相同性，典型具有至少大約75%相同性，優(yōu)選具有至少大約85%相同性，更優(yōu)選具有至少95%序列相同性。BCSC-1基因的變體和類似物典型包括與上述序列(或其互補鏈)在嚴格雜交條件下雜交的核酸序列。典型的嚴格雜交條件包括溫度高于30°C，優(yōu)選高于35°C，更優(yōu)選超過42。C，和/或鹽度低于大約500mM,優(yōu)選低于200mM。雜交條件可以由技術(shù)人員通過更改溫度、鹽度和/或其它試劑如SDS、SSC等的濃度而調(diào)節(jié)。BCSC-1基因的片段是指上述序列的至少大約8個連續(xù)核苷酸的任何部分，優(yōu)選至少大約15個核苷酸，更優(yōu)選至少大約20個核苷酸，進一步優(yōu)選至少30個核苷酸。片段包括長度在8-100個核苷酸、優(yōu)選15-100個核苷酸、更優(yōu)選20-100個核苷酸的所有可能的核酸。存在BCSC-1基因的一些同種型，其得自選擇性剪接。在這點上，BCSC-1的長同種型和短同種型可以根據(jù)其保留的外顯子(的數(shù)目)而定義。更特別地，BCSC-1基因組DNA包含18個外顯子，其可以被選擇性剪接。每個外顯子的位置在SEQIDNO:14中標示出，并概括于下表中，其中位置參考SEQIDNO:14的cDNA序列而指定。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>在本發(fā)明中，長BCSC-1同種型是包含外顯子13-18的至少一個外顯子的核苷酸序列或相應(yīng)氨基酸序列的同種型。短BCSC-1同種型是不包含外顯子13-18的任一外顯子的核苷酸序列或相應(yīng)氨基酸序列的同種型。長BCSC-1同種型的例子包含外顯子1-13、1-14、1-15、1-16、1-17或1-18的核苷酸序列或相應(yīng)的氨基酸序列。長同種型見NM—014622，其含有外顯子11-18的所有外顯子。相似地，缺失外顯子8-16但含有外顯子18的AY366504和AY366507描述的同種型在本發(fā)明中是長同種型。長同種型的其它例子在AY366508中揭示。BCSC-1蛋白是指由上述BCSC-1基因編碼的任何蛋白質(zhì)或多肽。術(shù)語"多肽"是指包含一段氨基酸序列的任何分子。該術(shù)語包括各種長度的分子，例如肽和蛋白質(zhì)。所述多肽可以被修飾，例如通過糖基化和/或?；?或化學反應(yīng)或化學結(jié)合進行修飾，并且可包含一或幾個非天然或合成的氨基酸。BCSC-1多肽的特定例子包括NM—014622或NM—198315(也見SEQIDNO:13)中描述的所有或部分序列。檢測/診斷本發(fā)明現(xiàn)在提供了基于監(jiān)測對象中BCSC-1基因同種型的診斷方法。在本發(fā)明中，術(shù)語"診斷"包括在各個階段包括早期、臨床前期和晚期在成人或兒童中進行檢測、監(jiān)測、給藥、對比等。診斷典型包括預(yù)后、評價患病傾向或發(fā)病的危險性、鑒定最適合對象的治療方案(藥物遺傳學)等。本發(fā)明的一般目的在于檢測對象中癌癥的存在、階段或類型的方法，所述方法包括在體外或離體檢測對象樣品中改變的長同種型BCSC-1基因表達的存在，這種改變的長同種型BCSC-1基因表達的存在是所述對象中癌癥的存在、階段或類型的指示。本發(fā)明的另一方面是檢測對象中癌癥、特別是實體癌癥的方法，包括檢測所述對象樣品中BCSC-1長同種型，其表達的降低是癌癥的存在、階段或類型的指示。本發(fā)明的特定目的在于檢測對象中黑素瘤或皮膚癌的存在、階段或類型的方法，所述方法包括在體外或離體檢測對象樣品中改變的BCSC-1基因表達的存在，這種改變的BCSC-1基因表達的存在是所述對象中黑素瘤或皮膚癌的存在、階段或類型的指示。本發(fā)明的另一目的是如上所述的方法，包括提供對象樣品的第一個步驟。診斷劑用于分析和預(yù)測對治療或藥物的應(yīng)答或者對治療或藥物的副作用，其可用于確定個體是否應(yīng)該用特定的治療藥物進行治療。例如，如果診斷劑表明個體對于用特定藥物進行治療將出現(xiàn)陽性應(yīng)答，則該藥物可以給予該個體。反之，如果診斷劑表明個體很可能對于特定藥物的治療將出現(xiàn)陰性應(yīng)答，則可以改用另一種治療方案。陰性應(yīng)答可以解釋為不存在有效的反應(yīng)或者存在毒性副作用。改變的BCSC-1表達可以通過本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)確定，例如在RNA或多肽水平確定。如本發(fā)明所揭示，BCSC-1表達在黑素瘤或皮膚癌細胞中被改變。更特別地，在黑素瘤或皮膚癌細胞中BCSC-1的表達水平與在非癌細胞中相比或者與平均值相比降低。更特別地，在癌細胞中長BCSC-1同種型的表達水平與在非癌細胞中相比或者與平均值相比降低。因此，在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法包括檢測BCSC-1基因、特別是其長同種型的表達水平降低的步驟。在典型的實施方案中，所述方法包括確定樣品中BCSC-1RNA或多肽、特別是BCSC-1RNA或多肽長同種型的(相對)量的步驟，并將所述量與參考值或平均值對比或者與在對照組織(例如非癌細胞)中測量的值對比，其中較低的值是癌癥存在的指示。在另一個特定的實施方案中，所述方法包括分別確定長BCSC-1RNA或蛋白質(zhì)同種型/短BCSC-1RNA或蛋白質(zhì)同種型的比率，這個比率與對照/參考值或樣品相比的任何變化均是癌癥存在的指示。盡管可以確定一些長同種型的(相對)量，但是測量僅一個長同種型或者確定一個長同種型/一個短同種型的比率即足夠。這種測量可例如基于使用相應(yīng)的探針或引物檢測外顯子13、14、15、16、17或18，或者使用特異性配體檢測編碼的氨基酸殘基，如下文所述。另外，本發(fā)明還包含檢測BCSC-1基因或多肽中與癌癥相關(guān)的結(jié)構(gòu)變化。BCSC-1基因或多肽中的這種變化可以是編碼區(qū)和/或非編碼區(qū)中單獨或組合的任何形式的突變、缺失、重排和/或插入。突變更特別包括點突變。缺失可包含基因的編碼區(qū)或非編碼區(qū)中兩或多個殘基的任何區(qū)域，如缺失兩個殘基直至整個基因。典型的缺失影響較小的區(qū)域，如低于大約50個連續(xù)堿基對的結(jié)構(gòu)域(內(nèi)含子)或重復(fù)序列或片段，但是也可以出現(xiàn)較大的缺失。插入可包含在所述基因的編碼區(qū)或非編碼區(qū)中加入一或幾個殘基。插入可典型包含在所述基因中加入l-50個堿基對。重排包括序列的倒位。BCSC-1的結(jié)構(gòu)變化可導致產(chǎn)生終止密碼子、移碼突變、氨基酸取代、特定的RNA剪接或加工、產(chǎn)物不穩(wěn)定性、截短的多肽產(chǎn)生等。所述變化可導致功能、穩(wěn)定性、靶向或結(jié)構(gòu)改變的BCSC-1多肽產(chǎn)生。本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)可用于檢測或量化改變的BCSC-1表達，包括測序、雜交、擴增和/或結(jié)合特異性配體(如抗體)。其它合適的方法包括等位基因特異性寡核苷酸(ASO)、等位基因特異性擴增、Southern印跡(對于DNA)、Northern印跡(對于RNA)、單鏈構(gòu)象分析(SSCA)、PFGE、熒光原位雜交(FISH)、凝膠移位、夾板變性梯度凝膠電泳、異源雙鏈分析、RNase保護、化學錯配裂解、ELISA、放射性免疫測定(RIA)和免疫-酶學測定(正MA)。擴增可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)進行，例如通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、鏈置換擴增(SDA)及基于核酸序列的擴增(NASBA)。這些技術(shù)可以使用可商購的試劑和方案進行。優(yōu)選的技術(shù)使用等位基因特異性PCR或PCR-SSCP。擴增通常需要使用核酸引物以起始反應(yīng)。用于從BCSC-1基因或RNA中擴增序列的核酸引物與BCSC-1基因或RNA的一部分互補且與其特異性雜交。可用于所有或部分BCSC-1基因或RNA的引物可以基于BCSC-1自身的序列設(shè)計。用于本發(fā)明中的最優(yōu)選的引物可以擴增BCSC-1的長同種型，即含有與位于BCSC-1基因或RNA的外顯子13-18任一外顯子內(nèi)的序列互補且與其特異性雜交的序列。在這方面，本發(fā)明還涉及核酸引物，所述核酸引物與位于BCSC-1基因或RNA的外顯子13-18任一外顯子內(nèi)的序列互補且與其特異性雜交。這種引物的使用可以檢測樣品中BCSC-1基因或RNA的長同種型。本發(fā)明的典型的引物是長度為大約5-60個核苷酸、更優(yōu)選大約8-25個核苷酸的單鏈核酸分子。該序列可以直接衍生自BCSC-1基因的序列。優(yōu)選完全互補，以保證高度特異性。然而，容許存在一些錯配。這種引物的特定例子在實驗部分的表1中揭示(SEQIDNO:1-12)。本發(fā)明還涉及上述核酸引物或核酸引物對在檢測對象中癌癥的存在或者易患病傾向的方法中的應(yīng)用，或者在評價對象對于癌癥治療方案的應(yīng)答的方法中的應(yīng)用。在另一個實施方案中，通過使用選擇性雜交的技術(shù)進行檢測。特定的檢測技術(shù)包括使用特異于BCSC-1基因或RNA的核酸探針，隨后檢測雜交體的存在和/或(相對)量。所述探針可以于懸浮液中或者固定于基質(zhì)或支持物上(如在核酸陣列或芯片技術(shù)中)。所述探針典型地被標記以便于檢測雜交體。在這點上，本發(fā)明的一個特定實施方案包括將對象樣品與特異于BCSC-1的長同種型的核酸探針接觸，并評價雜交體的形成。在一個特定的實施方案中，所述方法包括將對象樣品同時與分別特異于BCSC-1的各種長同種型的一系列探針接觸。在本發(fā)明中，探針是指與BCSC-1基因或RNA(的靶部分)互補且能特異性雜交、并適于檢測其在樣品中的存在或者(相對)量的多核苷酸序列。探針優(yōu)選與BCSC-1基因或RNA的序列完全互補。探針典型包含長度為8-1000個核苷酸的單鏈核酸，例如10-800個核苷酸、更優(yōu)選15-700個核苷酸、典型為20-500個核苷酸。應(yīng)了解也可以使用較長的探針。本發(fā)明優(yōu)選的探針是長度為8-500個核苷酸的單鏈核酸分子，其可特異性雜交BCSC-1基因或RNA的外顯子13-18任一外顯子內(nèi)包含的區(qū)域。特異性是指與靶序列雜交產(chǎn)生特異性信號，該信號有別于通過非特異性雜交產(chǎn)生的信號。優(yōu)選完全互補的序列以設(shè)計本發(fā)明的探針。然而，應(yīng)了解可以容許一定程度的錯配，只要所述特異性信號有別于非特異性雜交產(chǎn)生的信號即可。所述探針的序列可以衍生自本發(fā)明提供的BCSC-1基因和RNA的序列?？梢詫λ鎏结樳M行核苷酸取代以及化學修飾。完成這種化學修飾可以增加雜交體的穩(wěn)定性(例如嵌入基團)或者對所述探針進行標記。所述標記的典型例子包括但非限于放射性標記、熒光標記、發(fā)光標記、酶標記等。本發(fā)明還涉及上述核酸探針在檢測對象中癌癥進展的存在、類型或階段的方法中的應(yīng)用，或者在評價對象對于癌癥治療方案的應(yīng)答的方法中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及包含上述探針的核酸芯片。這種芯片可以通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)原位產(chǎn)生或者通過保藏克隆而產(chǎn)生，且典型包含在基質(zhì)上展示的核酸陣列，所述基質(zhì)例如是(玻璃、聚合物、金屬等)載玻片。如上文所述，BCSC-1基因表達中的變化也可以通過檢測BCSC-1多肽的存在或(相對)量而檢測。在這點上，本發(fā)明的一個特定實施方案包括將樣品(其可包含生物學體液如血液、血漿、血清等)與特異于BCSC-1多肽的配體接觸，并確定復(fù)合物的形成?？梢允褂貌煌愋偷呐潴w，如特異性抗體。在一個特定的實施方案中，將所述樣品與特異于BCSC-1多肽的抗體接觸，并確定免疫復(fù)合物的形成。可以使用各種檢測免疫復(fù)合物的方法，如ELISA、放射性免疫測定(RIA)及免疫-酶測定(正MA)。15在本發(fā)明中，抗體是指多克隆抗體、單克隆抗體以及其基本具有相同抗原特異性的任何片段或衍生物。片段包括Fab、Fab'2、CDR區(qū)域等。衍生物包括單鏈抗體、人抗體、多功能抗體等。最優(yōu)選的配體特異于BCSC-1的長同種型，即結(jié)合外顯子13-18任一外顯子編碼的氨基酸序列中包含的表位。特異于BCSC-1多肽的抗體是指選擇性結(jié)合BCSC-1多肽的抗體。更特別地，其是指對抗BCSC-1多肽或者其包含表位的片段而產(chǎn)生的抗體。盡管可以發(fā)生對于其它抗原的非特異性結(jié)合，但是與靶BCSC-1多肽的結(jié)合是以高度親和性發(fā)生，且可以可靠地有別于非特異性結(jié)合。在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的方法包括將對象樣品與特異于BCSC-1多肽的抗體(包被的支持物)接觸，并確定免疫復(fù)合物的存在。在一個特定的實施方案中，所述樣品可以同時或并行或相繼與各種特異于不同BCSC-1同種型的抗體(包被的支持物)接觸。在另一特定的實施方案中，本發(fā)明涉及檢測對象中癌癥的存在或易患病傾向的方法，所述方法包括體外或離體將對象樣品(其可包括生物學體液如血液、血漿、血清等)與特異于BCSC-1多肽的長同種型接觸，并確定形成的復(fù)合物的(相對)量，這個量是癌癥存在或易患病傾向的指示。本發(fā)明還涉及上述配體、優(yōu)選抗體、其片段或衍生物在檢測對象中癌癥的存在、階段或類型的方法中的應(yīng)用，或者在評價對象對于癌癥治療方案的應(yīng)答的方法中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及診斷試劑盒，其包含檢測對象樣品中BCSC-1基因、RNA或多肽的存在或(相對)量的產(chǎn)品和試劑。本發(fā)明的診斷試劑盒包含本發(fā)明中描述的任何引物、任何引物對、任何核酸探針和/或任何配體(優(yōu)選抗體)。本發(fā)明的診斷試劑盒可進一步包含進行雜交、擴增或者抗原-抗體免疫反應(yīng)的試劑和/或方案。本發(fā)明的診斷方法可以在體外、離體或者在體內(nèi)進行，優(yōu)選體外或離體進行。所述方法使用對象樣品，評價BCSC-1基因表達的任何改變。所述樣品可以是得自對象的任何生物學樣品，含有核酸或多肽。這種樣品的例子包括體液、組織、細胞樣品、器官、活檢組織等。最優(yōu)選的樣品是活檢組織，例如皮膚癌細胞、組織或樣品。所述樣品可以根據(jù)常規(guī)技術(shù)收集，并直接用于診斷或貯存?？梢栽谶M行所述方法之前對所述樣品進行處理，以保證或改善核酸或多肽的檢測可利用性。所述處理包括例如裂解(例如經(jīng)機械、物理、化學等方法)、離心等。同樣，核酸和/或多肽也可以通過常規(guī)技術(shù)預(yù)先純化或富集，和/或降低復(fù)雜性。核酸和多肽也可以經(jīng)酶或其它化學或物理處理方法處理，以產(chǎn)生其片段。鑒于本發(fā)明方法的高度靈敏性，因此極少量的樣品即足以進行測定。如本文所述，所述樣品優(yōu)選與試劑如探針、引物或配體接觸，以評價BCSC-1基因或RNA或多肽的存在和減灘對)量?？梢栽谌魏魏线m的裝置中進行接觸，所述裝置如平板、試管、孔、玻璃等。在特定的實施方案中，所述接觸是在用所述試劑如核酸陣列或特異性配體陣列包被的基質(zhì)上進行的。所述基質(zhì)可以是固體或半固體基質(zhì)，如任何支持物包括玻璃、塑料、尼龍、紙、金屬、聚合物等。所述基質(zhì)可以是任何形式和大小的，如載玻片、膜、珠、柱、凝膠等。所述接觸可以在適于所述試劑與樣品的核酸或多肽之間形成復(fù)合物的任何條件下進行。發(fā)現(xiàn)樣品中改變的BCSC-1表達表示黑素瘤或皮膚癌進展的存在、類型、或階段。確定改變的BCSC-1表達的存在也可以設(shè)計合適的治療干預(yù)方法，其是更有效和個性化的。同樣，這種在臨床前期水平的確定使得可以應(yīng)用預(yù)防方案。藥物篩選本發(fā)明還提供了篩選引物候選物或引導物的新目標和方法。所述方法包括結(jié)合測定和/或功能測定，可以在體外、在細胞系統(tǒng)中、在動物中等進行。在這點上，本發(fā)明的目的在于選擇對于黑素瘤或皮膚癌具有生物學活性化合物的方法，所述方法包括選擇模擬或剌激BCSC-1表達或活性的化合物的步驟。本發(fā)明的另一目的是選擇對于黑素瘤或皮膚癌具有生物學活性的方法，所述方法包括將測試化合物與包含報道構(gòu)建體的重組宿主細胞接觸，并選擇剌激所述報道基因表達的測試化合物，所述報道構(gòu)建體包含在BCSC-1基因啟動子控制下的報道基因。本發(fā)明的一個特定目的在于選擇對于黑素瘤或皮膚癌具有活性的化合物的方法，所述方法包括在體外將測試化合物與BCSC-1基因或多肽接觸，并確定所述測試化合物分別結(jié)合所述BCSC-1基因或多肽的能力。與所述基因或多肽的結(jié)合提供了所述化合物調(diào)節(jié)所述靶位活性的能力，并因此影響導致黑素瘤或皮膚癌的途徑。優(yōu)選地，所述BCSC-1多肽是長同種型。結(jié)合的確定可以通過各種技術(shù)進行，例如通過標記所述測試化合物、通過與標記的參考配體競爭等技術(shù)。本發(fā)明的另一目的在于選擇對于黑素瘤或皮膚癌具有活性的化合物的方法，所述方法包括在體外將測試化合物與BCSC-1多肽接觸，并確定所述測試化合物調(diào)節(jié)所述多肽活性的能力。優(yōu)選地，BCSC-1多肽是長同種型。本發(fā)明的另一目的在于選擇生物學活性化合物的方法，所述方法包括在體外將測試化合物與BCSC-1基因接觸，并確定所述測試化合物調(diào)節(jié)所述基因的長同種型的表達的能力。在本發(fā)明篩選方法的一個特定實施方案中，所述調(diào)節(jié)是激活。上述篩選測定可以在任何合適的裝置中進行，如平板、試管、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶等。典型地，所述測定是在多孔平板中進行。一些測試化合物可以被平行測定。另外，所述測試化合物可以是各種來源、性質(zhì)和組成。其可以是分離的或者與其它物質(zhì)混合的任何有機物或無機物，如脂質(zhì)、肽、多肽、核酸、小分子等。所述化合物可以例如是產(chǎn)物的組合文庫的全部或一部分。藥物組合物，治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的另一目的是藥物組合物，其包含(i)多肽的長同種型，或者編碼其的核酸，或者載體或重組宿主細胞，如下文所述，及(ii)藥物可接受的載體或運載體。本發(fā)明還涉及治療對象的黑素瘤或皮膚癌的方法，所述方法包括給予所述對象上述的組合物。本發(fā)明還涉及治療對象黑素瘤或皮膚癌的方法，所述方法包括基于所述對象有效量的BCSC-1多肽的長同種型。本發(fā)明還涉及BCSC-1蛋白或者編碼BCSC-1蛋白的核酸在生產(chǎn)治療黑素瘤或皮膚癌的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，BCSC-1蛋白是長同種型。本發(fā)明還涉及長BCSC-1蛋白質(zhì)同種型在生產(chǎn)治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及BCSC-1激動劑在生產(chǎn)治療黑素瘤或皮膚癌的藥物組合物中的應(yīng)用。本發(fā)明進一步包括刺激BCSC-1基因表達的化合物在生產(chǎn)治療黑素瘤或皮膚癌的藥物組合物中的應(yīng)用。在本發(fā)明中，術(shù)語"治療"包括抑制腫瘤進展、抑制腫瘤增殖、縮小腫瘤大小、抑制腫瘤細胞的致腫瘤性、延緩疾病進展。所述皮膚癌可選自基底細胞癌、鱗狀細胞癌、Merkel細胞癌、原發(fā)性皮膚淋巴瘤，以及皮膚或相關(guān)表面組織的任何其它細胞增殖性疾病。如在實驗部分中所示出，為皮膚癌細胞提供BCSC-1長同種型能抑制腫瘤增殖。為對象提供這種功能可以通過基因或蛋白質(zhì)治療而實現(xiàn)，或者通過給予調(diào)節(jié)或模擬BCSC-1多肽活性的化合物(例如在上述篩選測定中鑒別的激動劑)而實現(xiàn)。特別地，可以使用例如病毒載體或質(zhì)粒將BCSC-1基因?qū)胄枰涞膶ο蠹毎小？梢允褂酶鞣N各樣的基于病毒的載體，如腺病毒、AAV、皰疹病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，包括慢病毒。例如，美國專利6,069,134和6,143,2卯描述了人腺病毒在轉(zhuǎn)移和表達腫瘤抑制基因進入癌細胞中的應(yīng)用。所述基因也可以作為裸DNA導入。提供所述基因以整合進受體宿主細胞的基因組中，或者保留在染色體外。整合可以隨機或者在指定位點發(fā)生，如通過同源重組技術(shù)進行。其它技術(shù)包括基因槍、脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染、陽離子脂質(zhì)介導的轉(zhuǎn)染等。基因治療可以通過直接基因注射或者通過給予離體制備的經(jīng)遺傳修飾的表達功能性BCSC-1蛋白多肽的細胞而實現(xiàn)。蛋白質(zhì)治療也可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的技術(shù)實現(xiàn)。在BCSC-1是分泌的蛋白質(zhì)時，這種蛋白質(zhì)治療特別適用。為了進行基因治療，BCSC-1基因的典型劑量包含104-109個BCSC-1表達載體。為了進行蛋白質(zhì)治療，BCSC-1蛋白的典型劑量包含每劑lng-100mg。通常地，給予治療有效量以實現(xiàn)降低或抑制患病細胞中細胞增殖。應(yīng)了解所述劑量可以由技術(shù)人員基于病理學、治療方案、患者等因素加以調(diào)整。BCSC-1蛋白和BCSC-1表達載體可以多種方式給予，包括但非限于口服、全身性給予、局部給予和腸道外給予(例如皮下、腹膜內(nèi)、血管內(nèi)注射等)。在一個實施方案中，所述化合物直接用于腫瘤部位或鄰近(或者遠離腫瘤的部位)，例如在外科手術(shù)進行時給予或者通過其它方式直接到達腫瘤部位(例如通過導管給予)。載體和重組細胞本發(fā)明另一方面在于用于診斷、治療或篩選的新產(chǎn)品。更特別地，本發(fā)明的另一目的在于包含編碼BCSC-1多肽、優(yōu)選其長同種型的核酸的載體。所述載體可以是克隆載體，或者更優(yōu)選是表達載體，即包含在感受態(tài)宿主細胞中引起B(yǎng)CSC-1多肽從所述載體中表達的調(diào)節(jié)序列的載體。這些載體可用于在體外、離體或在體內(nèi)表達BCSC-1多肽，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因或"敲除"非人動物、擴增所述核酸、表達反義RNA等。本發(fā)明的載體典型包含與調(diào)節(jié)序列例如啟動子、polyA等可操縱地連接的本發(fā)明的BCSC-1編碼序列。術(shù)語"可操縱地連接"是指編碼序列與調(diào)節(jié)序列功能性連接，由此所述調(diào)節(jié)序列引起所述編碼序列表達(例如轉(zhuǎn)錄)。所述載體可進一步包含一或幾個復(fù)制起點和/或可選擇的標記。啟動子區(qū)域可以與編碼序列同源或異源，并且可以在任何適當宿主細胞中提供遍在的、組成型、調(diào)節(jié)的和/或組織特異性表達，包括在體內(nèi)應(yīng)用。啟動子的例子包括細菌啟動子(T7、pTAC、Trp啟動子等)、病毒啟動子(LTR、TK、CMV-IE等)、哺乳動物基因啟動子(白蛋白、PGK等)等。所述載體可以是質(zhì)粒、病毒、粘粒、噬菌體、BAC、YAC等。質(zhì)粒載體可以從可商購的載體如pBluescript、pUC、pBR等中制備。病毒載體可以根據(jù)本領(lǐng)域己知的重組DNA技術(shù)從桿狀病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如慢病毒)、腺病毒、AAV等中產(chǎn)生。重組病毒優(yōu)選是復(fù)制缺陷的，更優(yōu)選選自El-和/或E4-缺陷的腺病毒、Gag-、pol-和/或env-缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒及Rep-和/或Cap-缺陷的AAV。這種重組病毒可以通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)產(chǎn)生，例如通過轉(zhuǎn)染包裝細胞或者通過用輔助質(zhì)粒或病毒瞬時轉(zhuǎn)染而產(chǎn)生。病毒包裝細胞的典型例子包括PA317細胞、PsiCRIP細胞、GPenv+細胞、293細胞。產(chǎn)生這種復(fù)制缺陷的重組病毒的詳細方案可以例如見于W095/14785、W096/22378、US5,882，877、US6,013，516、US4,861，719、US5，278,056和W094/19478所述。本發(fā)明的另一目的在于包含上述重組BCSC-1基因或載體的重組宿主細胞。合適的宿主細胞包括但非限于原核細胞(如細菌)和真核細胞(如酵母細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞等)。特定的例子包括大腸桿菌、克魯維酵母或糖酵母、哺乳動物細胞系(例如Vero細胞、CHO細胞、3T3細胞、COS細胞等)，以及原代或建立的哺乳動物細胞培養(yǎng)物(例如從成纖維細胞、胚胎細胞、上皮細胞、神經(jīng)細胞、脂肪細胞等中產(chǎn)生)。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生表達本發(fā)明的BCSC-1多肽的重組宿主細胞的方法，所述方法包括(i)體外或離體將上述重組核酸或載體導入感受態(tài)宿主細胞中，(ii)體外或離體地培養(yǎng)獲得的重組宿主細胞，及(iii)任選地選擇表達BCSC-1多肽的細胞。這種重組宿主細胞可用于產(chǎn)生BCSC-1多肽，以及篩選活性分子，如下文所述。這種細胞也可用作模型系統(tǒng)以研究皮膚癌。這些細胞可以維持在任何合適的培養(yǎng)裝置(平板、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、試管、袋子等)中的合適培養(yǎng)基中，如DMEM、RPMI、HAM等。本發(fā)明的其它方面和優(yōu)勢將在如下實驗部分中揭示，應(yīng)了解如下實施例只是例證了本發(fā)明，而無限制本發(fā)明范圍之意。實驗部分A-材料和方法1.RNA提取和cDNA合成從70名不同階段黑素瘤患者的冷凍皮膚組織及從正常痣組織中分離總RNA。將1pg總RNA用于合成cDNA，使用隨機六聚體和SupercriptII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)根據(jù)廠商指導進行合成。2.實時半定量RT-PCR使用不同的引物組合針對BCSC-1的不同外顯子擴增cDNA。當可能時，設(shè)計擴增子超過外顯子邊界，通過BLAST排列人基因組序列，以保證其特異于測試的基因。使用的引物序列示于表1。每種設(shè)計的效率用系列稀釋的cDNA檢測。寡核苷酸PCR反應(yīng)(IOul體積)含有稀釋的cDNA、2XSYBRGreenMasterMix(AppliedBiosystems)、300nM正向和反向引物。在SDS7900HT裝置(AppliedBiosystems)上利用如下參數(shù)進行PCR:50。C2分鐘，95。C10分鐘，及40次95。C15秒和6(TC1分鐘循環(huán)。每個反應(yīng)均在384孔平板上一式六份進行。RawCt值用SDS2.2(AppliedBiosystems)獲得。使用四個不同的管家基因以用于用GenNorm軟件進行標準化。相關(guān)表達以在腫瘤中的表達與在正常組織(良性痣)中的平均表達的比率計算。如下是BCSC-1研究中使用的寡核苷酸。引物核苷酸序列SEQIDNO:外顯子1-lbS5，-AAATTATGACTGCAGCTGTTTTCACT-3,1外顯子1-lbAS5'-GTAGAACAGGCTGGGCTTCCT-3'2外顯子6-7S5，-CTGATTTACTACAATGAGGTGCATACC-3，3外顯子6-7AS5'-CATCAAATGACCTGGCTTCATG-3'4外顯子9-10S5，-AGAAACACAGGTAGGAAGAAAATGTGA-3'外顯子9-10AS5，-TCATGTAGCACTAGAGTCTGTGTGTCA-3'6外顯子13—14S5,-AGCCTGATGTCAACCTCACCAT-3，外顯子3一14AS5'-CATGTCCTTGGTCTGGAGCAA-3，8外顯子15一16S5'-AGCACAGTCCAGGCTTTGGA-3'9外顯子15一16AS5，-CAGGAACCATTTGCATTTTGG-3'10外顯子17一18S5，-AATGGGAGCTTCTGGAAAGGA-3'U外顯子17一18AS5'-GCA丁GGTGGAGCCTGCAT-3'123.編碼BCSC-1的慢病毒載體的構(gòu)建和產(chǎn)生將用HA-蛋白質(zhì)序列標記的BCSC-1的同種型F的完整編碼序列插入兩個不同的慢病毒載體尸GK/ms7Veo和尸『/AGF尸質(zhì)粒中(得自D,Trono,EPFL,Epalinges,Switzerland,并根據(jù)(Naldinietal"1996;Salmonetal"2000)進行修飾)。將293T和HeLa細胞系在補加了10%FCS的Dulbecco，s修飾的Eagle's培養(yǎng)基中培養(yǎng)。重組慢病毒根據(jù)標準方案通過瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞而產(chǎn)生。簡而言之，將亞鋪滿(subconfluent)的293T細胞通過磷酸鈣沉淀方法用20jig質(zhì)粒載體(PGKBCSCIresNeo/PWIRBCSCGFP)、15的pCMV-ddtaR8.91和5的pMD2G-VSVG共轉(zhuǎn)染。16小時后更換培養(yǎng)基，24小時后收獲重組慢病毒載體。所有測試FACS、Western印跡和細胞轉(zhuǎn)導方法均與先前所述相似(Arrighietal.，2004)。B-實施例實施例1:鑒別BCSC-1表達在皮膚癌中改變23基因譜技術(shù)DATAS(選擇性剪接的轉(zhuǎn)錄體的差異分析)(Schwdghofferetal.，2000)可以分離在兩種條件下差異表達的選擇性剪接的序列文庫，該文庫隨后可用于建立陣列或分離耙基因。DATAS通過從2個不同群體(良性痣與轉(zhuǎn)移性黑素瘤)中提取總RNA，隨后通過信使RNA分離(使用DynabeadsoligodT-Dynal)而實現(xiàn)。使用生物素?；墓押塑账醖T對mRNA進行逆轉(zhuǎn)錄，以產(chǎn)生第一鏈cDNA。一個群體的mRNA與另一群體的cDNA之間的交叉雜交產(chǎn)生異源雙鏈體，使用鏈霉親和素包被的珠將其分離。使用RNAseH處理以釋放與異源雙鏈體中的cDNA不雜交的mRNA的環(huán)。這些mRNA環(huán)編碼選擇性剪接的序列，用5個簡并引物對其進行RT-PCR，隨后在AT克隆載體(TOPO，Invitrogen)中克隆PCR產(chǎn)物。使用T7引物通過PCR擴增所有克隆中的cDNA插入體。最終的結(jié)果是選擇性剪接的mRNA序列文庫對于指定條件是唯一的。在測序后，對DATAS克隆進行生物信息學分析，以鑒別其源基因。這樣可以高精確性地分析某些類型的剪接事件(如外顯子遺漏、內(nèi)含子保留、新外顯子的存在、選擇性剪接位點的使用)。對得自一群具有良性痣的健康對象和一群患有轉(zhuǎn)移性黑素瘤的患者的組織進行DATAS譜分析。使用來自良性痣組的11名對象和來自轉(zhuǎn)移性黑素瘤組的10名患者的組織建立DATAS文庫。從每群可獲得80pg總RNA，從中提取1.6嗎mRNA:800ng用于cDNA分析，800ng保留為mRNA。使用Agilent生物分析儀確定所有RNA組織樣品的性質(zhì)和數(shù)量。僅將具有良好性質(zhì)的總RNA樣品用于DATAS分析。從對組織RNA進行的DATAS分析中獲得了共755個克隆。大約25%的克隆得自條件mRNA轉(zhuǎn)移性黑素瘤/cDNA良性痣，而剩余的75%的克隆得自條件mRNA良性痣/cDNA轉(zhuǎn)移性黑素瘤。插入體的平均大小為300-500bp。在測序后，對各個克隆如上所述進行加工并分析。通過對755個克隆進行測序，217個片段是非冗余的，且含有未知的基因序列。從DATAS分析中獲得的217個克隆中，選擇大約具有潛在感興趣性質(zhì)的IO個克隆，對從黑素細胞皮損的活檢組織中提取的RNA進行實時半定量RT-PCR。通過這種二次篩選，鑒別了BCSC-1是潛在的感興趣的候選物。實施例2:BCSC-1表達在黑素瘤患者中被下調(diào)使用從共70名患者的活檢組織(包括良性痣的活檢組織(陰性對照)和不同階段的色素性皮損的活檢組織)中提取的RNA，通過實時半定量RT-PCR確定BCSC-1的基因表達。結(jié)果表明與良性痣樣品中BCSC的平均表達水平相比，所有轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者均具有顯著較低的表達水平(圖2)。在一些轉(zhuǎn)移性活檢組織中，BCSC的表達達到與良性痣中平均表達水平相比低20倍。非典型性痣活檢組織示出比良性痣更高水平的BCSC表達，原發(fā)黑素瘤和淋巴結(jié)的活檢組織均示出與良性痣相似的BCSC表達水平。實施例3:BCSC-1的長同種型在黑素瘤中被選擇性下調(diào)對于BCSC-1基因已經(jīng)描述了7個不同的同種型(見圖3A)。我們使用不同的引物組合進行了更具特異性的BCSC-1表達分析，以確定哪個同種型是被下調(diào)的。結(jié)果表明較長的同種型c和f(其編碼相同的蛋白質(zhì))在黑素瘤患者中被選擇性下調(diào)(圖3B)。實施例4:BCSC-1表達在黑素瘤患者和黑素瘤細胞系中被下調(diào)為了證實先前的結(jié)果，在來自皮損的較大一批活檢組織中進行新的實時PCR實驗。與先前的結(jié)果一致，與健康供體的平均表達水平相比，所有具有轉(zhuǎn)移性皮損的患者的BCSC-1表達水平均較低(圖4A)。此外，檢測了黑素細胞的一些細胞系的BCSC-1表達情況(圖4B)。結(jié)果表明與健康供體相比所有黑素細胞系均具有顯著較低的表達水平。在一些細胞系如SK-Mel23(Ll)中，BCSC-1的表達不可檢測，僅兩個被檢測的原代黑素瘤細胞系示出BCSC-1表達與良性痣相似。實施例5:BCSC-1的異位表達降低黑素瘤細胞增殖使用PGK萬CSC/,wiVeo或BGSCGF戶載體轉(zhuǎn)導SK-Mel23和Hela細胞，誘導BCSC-1表達。此外，用相應(yīng)的空載體轉(zhuǎn)導的細胞用作陰性對照。結(jié)果表明黑素瘤細胞系SK-Mel23中BCSC-1的異位表達顯著降低了細胞增殖(圖5)。BCSC-1的表達通過Western印跡和實時PCR(圖6)使用抗-HA抗體加以證實。BCSC-1的異位表達的作用在其它非黑素細胞系如Hela中未觀測到。實施例6:BCSC-1的異位表達阻斷黑素瘤細胞增殖用慢病毒載體轉(zhuǎn)導黑素瘤細胞系，以誘導BCSC-1基因的長同種型(IsoF)的異位表達。示于圖7的結(jié)果表明與用陰性對照及用空載體或BCSC-1的短同種型(IsoA)轉(zhuǎn)導的細胞相比，轉(zhuǎn)導的轉(zhuǎn)移性黑素瘤細胞Mewo和SK23(圖7A)及原代黑素瘤細胞Me257(圖7B)阻斷或顯著降低增殖。這個作用在用空載體或BCSC-1的短同種型轉(zhuǎn)導的細胞中未觀測到。實施例7:BCSC-1阻斷在細胞周期的G2-M期的黑素瘤細胞我們研究了BCSC-1的抗增殖性作用是否是由于干擾了轉(zhuǎn)導細胞的細胞周期所致。使用BrdU和7-AAD染色，我們可以確定細胞周期的G0/G1(R3)、S(R4)、G2-M(R5)時期中的細胞百分比及凋亡細胞(R6)。FACS譜在圖8A中示出，百分比值在圖8B中示出。結(jié)果表明用BCSC-1的長同種型(isoF)轉(zhuǎn)導的細胞在G2-M期存在阻斷。這個作用在未轉(zhuǎn)導的細胞及用空載體或BCSC-1的短同種型(isoA)轉(zhuǎn)導的細胞中未觀測到，其中細胞主要分布于細胞周期的G0/G1和S期。實施例8:編碼BCSC-1的Hela細胞被停滯在細胞周期的G2和M期用DAPI和微管蛋白抗體進行免疫熒光染色，以確定在G2-M期的哪個步驟產(chǎn)生BCSC-1異位表達誘導的細胞周期阻斷。在未轉(zhuǎn)導的細胞或者用空載體或BCSC-1的短同種型轉(zhuǎn)導的細胞中，我們觀測到存在高百分比的具有染色質(zhì)濃縮或者處在有絲分裂的不同時期的細胞(圖9A)。然而，當用BCSC-1的長同種型轉(zhuǎn)導細胞時，未觀測到處在有絲分裂中的細胞(圖9B)?？梢酝茢郆CSC-1的異位表達誘導了在細胞周期G2與M期之間的阻斷，避免了細胞有絲分裂。實施例9:BCSC-1降低轉(zhuǎn)移性黑素瘤的小鼠模型中肺轉(zhuǎn)移的數(shù)目為了研究BCSC-1在體內(nèi)的作用，經(jīng)靜脈內(nèi)注射用空載體或者用長同種型BCSC-1載體轉(zhuǎn)導的B16黑素瘤細胞(大約500ng病毒顆粒/104-107個細胞)。15天后，這些細胞產(chǎn)生肺轉(zhuǎn)移，可以對轉(zhuǎn)移瘤進行計數(shù)(圖IOA)。注射空載體轉(zhuǎn)導的B16的小鼠(n-10)或者長BCSC-1載體的小鼠(『6)的肺轉(zhuǎn)移數(shù)目示于圖IOB。觀測到注射BCSC-1轉(zhuǎn)導的細胞的小鼠與注射空載體轉(zhuǎn)導的細胞的小鼠相比肺轉(zhuǎn)移數(shù)目降低。BCSC-1的蛋白質(zhì)序列(SEOIDNO:13)說明書第25/28頁PAIFAFBCSC-1的cDNA序列(雨014622)一SEQIDNO:14GGTTCTTTCCGGAAATTATGACTGCAGCTGTTTTCACTCCGCTGTGACT50CAGAGCGCTCCGGGCTGCAGGAGAGGAAy:AATCTTGCATCACCATGGTG100CACTTCTGTGGCCTACTCACCCTCCACCGGGAGCCAGTGCCGCTGAAGAG150TATCTCTGTGAGCGTGAACATTTACGAGTTTGTGGCTGGTGTGTCTGCAA200CTTTGAACTACGAGAATGAGGAGAAAGTTCCTTTGGAGGCCTTCTTTGTG250TTCCCCATGGATGAAGACTCTGCTGTTTACAGCTTTGAGGCCTTGGTGGA300TGGGAAGAAAATTGTAGCAGAATTACAAGACAAGATGAASGCCCGCACCA350ACTATGAGAAAGCCATCTCCCAGGGCCACCAGGCCTTCTTATTGGAGGGG權(quán)GACAGCAGCTCCAGGGATGTCTTCTCTTGCAATGTGGGTAACCTCCAACC450TGGGTCGAAGGCGGCAGTCACCCTGAAGTATGTGCAGGAGCTGCCTCTGG500AAGCAGATGGGGCTCTGCGCTTTGTGCTCCCAGCTGTCCTGAATCCTAGA550TACCAGTTCTCTGGGTCGTCTAAGGACAGTTATAGTCCCTGTGGAGGACCTGCCCTACACTAGATTCCCAGCATGGCATTGAGAAGGTCCCCTACCGAGTACCTAGGAGAGGACAAGACTTGCTGGACACAAGTTTGATCGGGACGTGGAAGGTGCATACCCCCAGCGTGGTTTTGGAGACCA(SGTCATTTGATGGGAGATCCATCTGCATATCCCAGAAGATCAACCATCAAATACCTGTGGACCGCTCGGGAAGTATGCAGAGCCCCACAGCTGCGAATACAGGCAGCCAAC5GAAACATTTACCTATAGGCTGTTATTTCAACATCTAAGGCATGCTTTCCGGAGAGTGTGAAGTACAGCTCTGGGGAGAGTGAAGCTTATGCAGGCCCTTGGCACCACTCCAGAACATTTACAGGGGCCCTACAGGTTTTTGTCTTTACAGATGGAGGTAATTAAAGAAGTTAGGATCAACAGACAGTGGTATTGGAGAAGGCACCTCCACCAGCCTCATCAGGGGGCACCTCAGAATTTATCACAGAAG;GCTCTCAGGACTCTGAAACGCTCTCTGCTCTCTGAGCTGGCATTTGCCTCCTGGTCTCAGAACAGACTGTCATCTTTAGGGGTCAGACTGACCGGGAGGATGCCAGCAGCAGAGACAATATACACTCCAGGGCAAGACTTTTGAGGAAACCCAAGCCTGATGTCAK:CTCACCATTCTTGCTCCAGACCAAGGACATGGGCCTCAGGAAAAGATGCATTGAACCTTAGCCTTGAGTCCAGCTTTCATTGCTATCAATAAGGAGCTCACTGGCTCATAGGGACGTCCCAAGGCCAATTATTGAAGATAAAATGCCAATCAGGTTTTCGTGCCTTAATGTGAAGACTCC600ACTCAGCATGGTCGCCACCA650AATCCAACTGCCCCTTGAGT700TCTGCTCAGC5TTTCCCTGGC750ACTCCTGATTTACTACAATG800TGGGGATGCCTAACATGAAG850ATGGTGAGTTTCTATCCAAA900TGGAGAGTTTATCTTTCTCA950TGAGTAGCCAGGATACATCT1000CTGATTTTGCTGCTGAAGAG1050TGGATTTGGCTCTTCCTATG1100CTCAGCAAACAATGGAGGAG1150GACCTAGGGGGCACTGAAAT1200ACCCTCCATCCCAGGCCACC1250AAGTTACAGACACGTTTAGT1300AAACACAGGTGTTTCTCATT1350AATAAAAGGTATTGCCCGGG1400GCAAAGACAGGATGCAGTCC1450CAGCCTGTGGTAGAGGATGT1500GTCTGCTAAAATGCTTTCCC1550GATTAATCAGCTATGCCCAG1600ACAGGAGAAGTATGCCTCAA1650TAAGGTGACATTTCCTCTAC1700ACCGCCTTGCTGCCAAGTCC1750GAGACTCCAGCAAGTGATAA1800TGGTGTCATAAGCTCCTTCA1850ACAAGCCGGTTCAGGGGCCT1900CTGTTGGGTGCTTCTGCCCC1950AAAGGCCTTACACTCTGACC200029GTCCTCCTTCTGCATCTCAGCCCAGAGGGGAACTTATGTGTTATAAGGCC2050AAGACATTCCAGATGGACGATTACAGTCTCTGTGGGTTGATAAGTCACAA2100GGACCAGCACAGTCCAGGCTTTGGAGAGAATCACCTTGTGCAGCTGATTT2150ACCACCAAAATGCAAATGGTTCCTGGGATCTGAATGAAGATCTAGCCAAG2200ATCCTAGGTATGAGTTTGGAAGAAATAATGGCTGCACAGCCTGCCGAGCT2250TGTGGATTCCTCAGGCTGGGCCACCATCCTGGCCGTGATCTGGCTGCACA2300GCAATGGTAAGGACTTGAAGTGTGAATGGGAGCTTCTGGAAAGGAAGGCC2350GTGGCCTGGATGCGTGCCCATGCAGGCTCCACCATGCCTTCGGTTGTGAA2400AGCTGCTATTACTTTCCTGAAGTCATCTGTGGATCCTGCTATCTTTGCCT2450TTTGAAGATACCATCCAGAAAAAGAAGTGCCTTTAATTTGCTACTGTCAT2500TTCCTCTAGTATCACTTTTGCTGTGATGATGTGTTCTTGTGTATTATAAC2550TCTTTATTTTTTGCCATAAAAGTAAAGGATGCTTACTCCACTTCGCTTCT2600CTGCTCCAGGTTCACTTTGGATATGATCTTTCTTTTCCCAACATATGCCC2650TCAGAAAAGTGACAGTGGTCCCAGAACCTATTCCCTTTCTTGAGGGAGTT2700CAAAACATTCATAGGCAGTAATGTTCCTCCCAGGGTTTCCAGGGAAACAA2750CATGAAAAACAGGTGACATGAACTACAGACTAAAGATTGCAGCATTTATG2800TTAGAGAATGCTTGAATTAGAGAATTTTCTGCATTATCTTTGTCTGTTCA2850CT丁TCTATCTTATATACTTATCAGGGCCATACTGGTAAGCTTGCGTAGGA2900GGAGTTAGAGGGAAGTTGAAAGCCAACATCTGGATCAATGTAATGTCAAG2950ATCACAAAGACAGAGACTGCAGGGGTCCACTGTGAGAGGTGACACTGTTG3000GGGACCTTCCTGATTCATTCTTCTTGGGCTTTGCTAGCCTGTACAACCT7V3050CATGTCTTTTCTTCCACTGCCTGAAAGACTTGGGTTGAACTATAACTGTT3100GGAGAGAGA'rGTTCCTCTTTAATCATGAAACACCTTAAGAAGTCTATAAT3150GCAATCCTTAGTCCTACCCTGAACCTATGTGTCCTCTAAGTCAGGCCCTG3200ATCTAGTGCAGTAAAGGGAAGGGTGGGCTTAATGGGAGCTTTGCCTGGGA3250CCTGAACCTGGAGCACTTACCGCATTAGGAAGAAAGGAGCTCCCCGTAAT3300CGTTCCTGACCCTTGTGTCTCATATACCCTATCCTGGTGGAAATGACCCT3350ATTTGATMGCTGTCCCTTAAAATAACTTGTATCAATATTAAAATGACTA3400TTTCTACCCTTTGATGAGaaaaaaaaaaaaaaaaaaa參考文獻Arrighi，J.F.,Pion，M.,Wiznerowicz，M.,Geijtenbeek，T.B.，Garcia,E.，Abraham,S.,Leuba，F(xiàn).,Dutoit,V.,Ducrey-Rundquist,O.，VanKooyk,Y.，WaZ.(2004).Lentivirus-MediatedRNAInterferenceofDC-SIGNExpressionInhibitsHumanImmunodeficiencyVirusTransmissionfromDendriticCellstoTCells.JVirol7S,10848-10855.Naldini,L.,Blomer,U.，Gallay,P.，Ory，D.，Mulligan,R.,Gage,F.H.,Verma，I.M.，andTrono,D.(1996).Invivogenedeliveryandstabletransductionofnondividingcellsbyalentiviralvector.Science272，263-267.Salmon,P.，Kindler，V.,Ducrey,O.,Chapuis,B.,Zubler,R.H.，andTrono，D.(2000).High-leveltransgeneexpressioninhumanhematopoieticprogenitorsanddifferentiatedbloodlineagesaftertransductionwithimprovedlentiviralvectors.Blood96,3392-3398.Schweighoffer,F.,Ait-Ikhlef,A.，Resink，A.L.，Brinkm叫B.，Melle-Milovanovic，D.，Laurent-Puig,P.，Kearsey，J.，andBracco，L.(2000).Qualitativegeneprofiling:anoveltoolingenomicsandinpharmacogenomicsthatdeciphersmessengerRNAisoformsdiversity.Pharmacogenomics/,187-197.權(quán)利要求1.一種檢測對象中黑素瘤或皮膚癌的存在、階段或類型的方法，所述方法包括在體外或離體檢測對象樣品中改變的BCSC-1基因表達的存在，這種改變的基因表達的存在是所述對象中黑素瘤或皮膚癌的存在、階段或類型的指示。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述樣品中BCSC-1基因表達的降低是所述對象中黑素瘤或皮膚癌的存在、階段或類型的指示。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述樣品中BCSC-1基因的長同種型的表達降低是所述對象中黑素瘤或皮膚癌的存在、階段或類型的指示。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述長同種型包含外顯子13、14、15、16、17或18。5.—種評價對象中黑素瘤或皮膚癌的治療功效的方法，所述方法包括對比在所述治療之前和之后樣品中的BCSC-1基因表達，表達水平增加是對于治療的陽性應(yīng)答的指示。6.權(quán)利要求1-5任一項的方法，其中BCSC-1基因表達通過測序、選擇性雜交、選擇性擴增和/或特異性配體結(jié)合而檢測。7.權(quán)利要求1-6任一項的方法，其中所述癌癥選自基底細胞癌、鱗狀細胞癌、Merckd癌和黑素瘤。8.—種核酸引物，其允許擴增BCSC-1的長同種型。9.一種核酸探針，其特異性雜交BCSC-1的長同種型。10.—種抗體，其特異性結(jié)合BCSC-1蛋白的長同種型。11.一種試劑盒，其分別包含權(quán)利要求8-10之一的引物、探針或抗體。12.BCSC-1蛋白或者編碼BCSC-1蛋白的核酸在生產(chǎn)治療黑素瘤或皮膚癌的藥物中的應(yīng)用。13.BCSC-1激動劑在生產(chǎn)治療黑素瘤或皮膚癌的藥物組合物中的應(yīng)用。14.刺激BCSC-1基因表達的化合物在生產(chǎn)治療黑素瘤或皮膚癌的藥物組合物中的應(yīng)用。15.—種選擇對于黑素瘤或皮膚癌具有生物學活性的化合物的方法，所述方法包括選擇模擬或刺激BCSC-1表達或活性的化合物的步驟。16.—種選擇對于黑素瘤或皮膚癌具有生物學活性的化合物的方法，所述方法包含將測試化合物與包含報道構(gòu)建體的重組宿主細胞接觸，所述報道構(gòu)建體包含在BCSC-1基因啟動子控制下的報道基因，并選擇刺激報道基因表達的測試化合物。17.—種檢測對象中癌癥的存在、階段或類型的方法，所述方法包括在體外或離體檢測對象樣品中BCSC-1基因或蛋白的長同種型的(相對)量，所述量是所述對象中癌癥的存在、階段或類型的指不o18.—種檢測對象中癌癥的存在、階段或類型的方法，所述方法包括在體外或離體檢測衍生自該對象的流體樣品中BCSC-1蛋白的(相對)量，所述量是所述對象中癌癥的存在、階段或類型的指示。全文摘要本發(fā)明涉及檢測和治療黑素瘤及皮膚癌的方法和組合物。更特別地，本發(fā)明揭示了在黑素瘤和皮膚癌細胞中BCSC-1表達被改變，使得可以設(shè)計這種病變的有效檢測方法和試劑盒。本發(fā)明還示出恢復(fù)或增加黑素瘤和皮膚癌細胞中的BCSC-1表達會抑制致腫瘤性，并代表治療黑素瘤和皮膚癌的一種新的且有效的方法。本發(fā)明可用于檢測黑素瘤和皮膚癌的存在、階段或類型，以及任何患所述疾病的傾向。本發(fā)明可用于任何哺乳動物對象，特別是人對象。文檔編號C12Q1/68GK101548020SQ200780013681公開日2009年9月30日申請日期2007年3月15日優(yōu)先權(quán)日2006年3月16日發(fā)明者L·布拉科,R·科雷亞羅沙,V·皮蓋申請人:?？松蒯t(yī)療有限公司;日內(nèi)瓦醫(yī)科大學;日內(nèi)瓦大學