本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及表達(dá)tcpC基因的尿路致病大腸埃希菌的檢測(cè)技術(shù)。

技術(shù)背景

泌尿道感染是臨床最常見(jiàn)的感染性疾病之一，據(jù)估計(jì)，在西歐國(guó)家每年有超過(guò)1000萬(wàn)的人患尿路感染，在美國(guó)，尿路感染患者每年的醫(yī)療費(fèi)用大約為16億到25億美元。女性發(fā)病率明顯高于男性，每個(gè)女性一生中平均會(huì)患有癥狀性泌尿系感染1～3次。男性則在50歲以后由于前列腺增生高發(fā)此病。尿路感染主要由細(xì)菌自尿道上行所致，易復(fù)發(fā)。許多病人對(duì)此類疾病相關(guān)知識(shí)欠缺，重視不夠，疾病得不到規(guī)范徹底的治療，感染反復(fù)持久發(fā)作，易引起急性腎盂腎炎、腎膿腫、泌尿系結(jié)石、腎功能損傷，甚至腎功能衰竭等。有研究表明，死于尿毒癥的患者中，大約有1/3是由慢性腎盂腎炎引起的。統(tǒng)計(jì)資料表明導(dǎo)致泌尿道感染的病原菌85%以上為大腸埃希菌（Escherichia coli）。這類大腸桿菌可特異性地粘附、定植于人泌尿道粘膜上皮細(xì)胞，進(jìn)而引起尿道上行性感染，被稱為尿路致病性大腸埃希菌（Uropathogenic E. coli i, UPEC）。大多數(shù)尿路致病大腸埃希菌菌株能分泌一種含有Toll/interleukin-1 receptor（TIR）結(jié)構(gòu)域的蛋白（TIR domain-containing proteins，TcpC），TcpC能抑制巨噬細(xì)胞的吞噬和殺菌功能，是尿路致病大腸埃希菌重要的毒力因子，在腎盂腎炎的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。

如前所述，如何快速準(zhǔn)確的測(cè)定尿路致病大腸埃希菌成為泌尿道感染診斷和治療的關(guān)鍵。目前，臨床上有一些方法已經(jīng)被運(yùn)用于尿路致病大腸埃希菌檢測(cè)中，例如細(xì)菌的分離鑒定、全自動(dòng)微生物定量分析儀（TEMPO）檢測(cè)、PCR、PCR-ELISA等，這些不同的方法都有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)和使用范圍，但目前還沒(méi)有一個(gè)國(guó)際公認(rèn)的快速檢測(cè)尿路致病大腸埃希菌的標(biāo)準(zhǔn)方法。為此，建議一種快速、高效、精確的尿路致病大腸埃希菌檢測(cè)方法成為臨床亟待解決的問(wèn)題。而本發(fā)明建立的檢測(cè)tcpC的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法，為臨床快速檢測(cè)表達(dá)tcpC的尿路致病大腸埃希菌打下基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種用于tcpC實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的特異引物和TaqMan探針，本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供采用上述的特異引物和TaqMan探針的PCR反應(yīng)體系和PCR方法，本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種用于tcpC實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的目標(biāo)產(chǎn)物基因。本發(fā)明的方法可以快速、高效、特異、敏感的表達(dá)tcpC的尿路致病大腸埃希菌。

為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：

一種用于tcpC實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的特異引物和TaqMan探針，

特異引物：上游引物F：5’-CCACTGGTAGACGAGTTA-3’，下游引物R：5’-GCCTAAATCAATATTTCTCCTTAA-3’；

TaqMan探針：5’-（FAM）TTCAAGTGTCTGTTCATCATACCAA（Eclipse）-3’。

為了實(shí)現(xiàn)上述的第二個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：

一種用于tcpC實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的PCR反應(yīng)體系，25μL反應(yīng)體系包括：

PrimeScript 1 step Enzyme Mix反轉(zhuǎn)錄酶 1.0μL

2× 1 step buffer緩沖液 12.5μL

上述的上游引物F 0.5μL

上述的下游引物R 0.5μL

上述TaqMan探針 0.5μL

模板/樣品 2.0μL；

上述的上游引物F、下游引物R濃度分別為250nM，

鎂離子濃度5.5mM，

反應(yīng)體系單價(jià)離子濃度100mM。

一種用于tcpC實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的PCR方法，該方法將上述的反應(yīng)體系加無(wú)菌去離子水至反應(yīng)總體積25μL，小心放入7500儀器，記錄好被檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照，設(shè)置反應(yīng)程序，循環(huán)參數(shù)為：94.0℃預(yù)變性5min，1個(gè)循環(huán)；94.0℃變性30s，56℃退火30s， 40個(gè)循環(huán)。

為了實(shí)現(xiàn)上述的第三個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：

一種用于tcpC實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的目標(biāo)產(chǎn)物基因，該目標(biāo)產(chǎn)物基因的核苷酸序列表如SEQ ID NO:1所示。

本發(fā)明根據(jù)GenBank提供的tcpCDNA序列設(shè)計(jì)的特異引物和TaqMan探針，在特定的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系中，繪制出大腸埃希菌DNA濃度與Ct之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將檢驗(yàn)樣品進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得檢驗(yàn)樣品的DNA濃度。

本發(fā)明tcpC實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法，能成功檢測(cè)大腸埃希菌UPEC CFT073，其線性范圍為5*10²~5*10^-2ng/μL，可以同時(shí)檢測(cè)96 個(gè)樣品，檢測(cè)時(shí)間約1~2h，并可以對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量。檢測(cè)結(jié)果直觀，能將表達(dá)tcpC的大腸埃希菌與其它腸道細(xì)菌進(jìn)行區(qū)分，有較高的靈敏度、特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性，為臨床早期快速診斷表達(dá)tcpC的尿路致病大腸埃希菌所致腎盂腎炎等尿路感染及敗血癥等并發(fā)癥打下了基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1 是本發(fā)明的大腸埃希菌UPEC CFT073 real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖2 是本發(fā)明的大腸埃希菌UPEC CFT073 real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增曲線。

圖3 是本發(fā)明的大腸埃希菌UPEC CFT073 real-time PCR特異性擴(kuò)增曲線。

圖4 是本發(fā)明的大腸埃希菌UPEC CFT073 real-time PCR靈敏度試驗(yàn)擴(kuò)增曲線。

圖5 是本發(fā)明的大腸埃希菌UPEC CFT073 real-time PCR批內(nèi)可重復(fù)性試驗(yàn)擴(kuò)增曲線。

圖6 是本發(fā)明的大腸埃希菌UPEC CFT073 real-time PCR批間可重復(fù)性試驗(yàn)擴(kuò)增曲線。

圖7 是本發(fā)明的大腸埃希菌UPEC CFT073 real-time PCR回收率試驗(yàn)擴(kuò)增曲線。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明。

1.引物、探針的設(shè)計(jì)與合成

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR探針設(shè)計(jì)軟件Beacon Designer 7.8及Primer Express 3.0設(shè)計(jì)特異引物及探針。

上游引物F：5’-CCACTGGTAGACGAGTTA-3’，長(zhǎng)度：18bp，position 562，Tm值：61.7。

下游引物R：5’-GCCTAAATCAATATTTCTCCTTAA-3’，長(zhǎng)度：24bp，position 660，Tm值：61.1。

熒光探針P：5’-（FAM）TTCAAGTGTCTGTTCATCATACCAA（Eclipse）-3’，長(zhǎng)度：25bp，position 624，Tm值：66.9 。

產(chǎn)物Product：

CCACTGGTAGACGAGTTAAATAGACTTGGTGTAATTATTTGGTATGATGAACAGACACTTGAAGTCGGCGATAGCTTAAGGAGAAATATTGATTTAGGC，長(zhǎng)度：99bp。

該探針為TaqMan探針，5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為Eclipse，擴(kuò)增目的片段的長(zhǎng)度為99bp。引物和探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。使用前用滅菌超純水配成濃度為100mM，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系

反應(yīng)條件：

引物濃度 250nM

鎂離子濃度5.5mM

反應(yīng)體系單價(jià)離子濃度100mM

熒光定量PCR 25μL反應(yīng)體系包括：

PrimeScript 1 step Enzyme Mix反轉(zhuǎn)錄酶 1.0μL

2× 1 step buffer緩沖液 12.5μL

Upstream Primer上游引物F-1 0.5μL

Downstream Primer下游引物R-1 0.5μL

Template探針P-1 0.5μL

模板/樣品 2.0μL

加無(wú)菌去離子水至反應(yīng)總體積25μL。小心放入7500儀器，記錄好被檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照，設(shè)置反應(yīng)程序。

循環(huán)參數(shù)為：94.0℃預(yù)變性5min，1個(gè)循環(huán)；94.0℃變性30s，56℃退火30s， 40個(gè)循環(huán)。熒光信號(hào)的收集及數(shù)據(jù)的采集定在56℃，根據(jù)熒光曲線和Ct值判斷結(jié)果。

3.模板DNA制備

樣品直接熱裂解法：取菌液l00μL隔水煮沸20min，取出立即置于冰上，以12000rad/min的速度離心5min，取出所得上清液，加入500μL無(wú)水乙醇混勻，12000rad/min離心10min，棄去上清液，入烘干箱烘干，再加入100μL無(wú)菌去離子水，所得液體即為所需DNA樣品。

4.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

復(fù)蘇UPEC CFT073菌株，37±1℃培養(yǎng)48h，取適量菌種置于LB液體培養(yǎng)基中在37±1℃搖床上培養(yǎng)8h。將該UPEC CFT073培養(yǎng)物充分混勻，提取細(xì)菌基因組DNA，并測(cè)定其濃度。將原液進(jìn)行10倍梯度稀釋，將濃度在5*10²~5*10^-2ng/μL 5個(gè)梯度用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，熒光定量PCR擴(kuò)增時(shí)每個(gè)梯度模板重復(fù)2次，最后選擇陰性對(duì)照以滅菌超純水代替。

熒光定量PCR擴(kuò)增的同時(shí)PCR儀自動(dòng)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為提取DNA濃度值，縱坐標(biāo)為循環(huán)閾值Ct值，斜率為-3.017，截距為14.189。從標(biāo)準(zhǔn)曲線得出DNA濃度值x與循環(huán)閾值Ct之間的線性關(guān)系曲線表達(dá)式為Ct=-3.017x + 14.189，根據(jù)該表達(dá)式測(cè)算出所測(cè)樣中DNA濃度值與Ct的相關(guān)性。由標(biāo)準(zhǔn)曲線得知，所建立的熒光定量PCR的相關(guān)系數(shù)為R²=0.995，表明建立的熒光定量PCR方法誤差極小，符合大腸埃希菌基因tcpC檢測(cè)要求。

5.特異性試驗(yàn)

復(fù)蘇表皮葡萄球菌（ATCC8799）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、痢疾桿菌（CMCC51252）、變形桿菌（ATCC6380）、空腸彎曲菌（ATCC33291）、糞鏈球菌（ATCC29212）、大腸埃希菌（UPEC CFT073、DH5α、BL21）、白假絲酵母菌（ATCC76615）等菌株，將菌株培養(yǎng)物提取基因組DNA，作為熒光定量PCR模板，檢測(cè)該方法的特異性。除大腸埃希菌UPEC CFT073能特異性出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，呈現(xiàn)陽(yáng)性；而其他細(xì)菌均無(wú)反應(yīng)，表明此方法的特異性很好。

6.靈敏性試驗(yàn)

復(fù)蘇UPEC CFT073菌株，37±1℃培養(yǎng)48h，取適量菌種置于LB液體培養(yǎng)基中在37±1℃搖床上培養(yǎng)8h。將該UPEC CFT073培養(yǎng)物充分混勻，提取細(xì)菌基因組DNA，并測(cè)定其濃度。將已知濃度的DNA樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋，選擇濃度在5*l0⁰~5*l0^-6 ng/μL 7個(gè)梯度的模板DNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，確定其靈敏度。在熒光定量PCR方法中，模板的起始濃度越低，Ct值越大，當(dāng)Ct值大于38時(shí)，定量結(jié)果被認(rèn)為是不確切的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示，PCR法檢測(cè)細(xì)菌DNA提取物時(shí)，其最低可檢測(cè)到5*l0^-4 ng/μL。

表1大腸埃希菌UPEC CFT073探針熒光定量PCR靈敏性檢測(cè)

7.重復(fù)性試驗(yàn)

批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)：復(fù)蘇UPEC CFT073菌株，37±1℃培養(yǎng)48h，取適量菌種置于LB液體培養(yǎng)基中在37±1℃搖床上培養(yǎng)8h。將該UPEC CFT073培養(yǎng)物充分混勻，提取細(xì)菌基因組DNA，并測(cè)定其濃度。將已知濃度的DNA樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋，選擇濃度在5*l0¹~5*l0^-4 ng/μL6個(gè)梯度的模板DNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，每一個(gè)濃度的DNA重復(fù)2次，以觀察Ct值之間的誤差。結(jié)果顯示熒光定量PCR檢測(cè)這5種不同濃度DNA提取物的循環(huán)數(shù)差值(△Ct)均小于0.8，標(biāo)準(zhǔn)差在0.131~0.788之間，變異系數(shù)在0.63%~2.92%之間，說(shuō)明重復(fù)性好。

表2大腸埃希菌UPEC CFT073探針熒光定量PCR批內(nèi)可重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果

批間重復(fù)性試驗(yàn)：復(fù)蘇兩批UPEC CFT073菌株，分別37±1℃培養(yǎng)48h，取適量菌種置于LB液體培養(yǎng)基中在37±1℃搖床上培養(yǎng)8h。將該UPEC CFT073培養(yǎng)物充分混勻，提取細(xì)菌基因組DNA，并測(cè)定其濃度。將已知濃度的DNA樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋，選擇濃度在5*l0¹~5*l0^-4 ng/mL6個(gè)梯度的模板DNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，每一個(gè)濃度的DNA重復(fù)2次，觀察兩批UPEC CFT073菌株Ct值之間的誤差。計(jì)算公式見(jiàn)公式7.1。結(jié)果顯示第一批大腸埃希菌UPEC CFT073（藍(lán)色擴(kuò)增曲線）曲線R²為0.998，第二批大腸埃希菌UPEC CFT073（紫色擴(kuò)增曲線）曲線R²為0.995，變異系數(shù)為1.7%，可見(jiàn)該方法的重復(fù)性好。

表3大腸埃希菌UPEC CFT073探針熒光定量PCR批間可重復(fù)檢測(cè)結(jié)果

循環(huán)數(shù)差值△Ct=Ct1-Ct2

變異系數(shù)CV%=標(biāo)準(zhǔn)偏差/算術(shù)平均值

標(biāo)準(zhǔn)偏差 StD公式

（公式7.1）

8.模擬樣品UPEC CFT073 DNA回收效率試驗(yàn)

為了評(píng)價(jià)該實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的靈敏度與準(zhǔn)確性，我們采用了在尿樣中添加己知濃度的DNA樣品的方法來(lái)檢驗(yàn)其準(zhǔn)確性。取5份90μL陰性尿樣于1.5mlEP管中，分別添加10μL大腸埃希菌UPEC CFT073樣品，經(jīng)菌液直接熱裂解法提取DNA后，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)；同時(shí)以核酸測(cè)定儀測(cè)定該大腸埃希菌樣品DNA濃度?；厥章视?jì)算公式為回收率%=尿樣中實(shí)際濃度/DNA直接測(cè)定濃度*100%。結(jié)果顯示大腸埃希菌UPEC CFT073回收率為82.7%~105.7%之間，平均值為93.34%。

表4大腸埃希菌UPEC CFT073探針熒光定量PCR回收率試驗(yàn)結(jié)果

<110>浙江大學(xué)城市學(xué)院

<120>一種tcpC實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法及用途

<160>8

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

CCACTGGTAG ACGAGTTA 18

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

GCCTAAATCA ATATTTCTCC TTAA 24

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

TTCAAGTGTC TGTTCATCAT ACCAA 25

<210>4

<211>99

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

CCACTGGTAG ACGAGTTAAA TAGACTTGGT GTAATTATTT GGTATGATGA ACAGACACTT 60

GAAGTCGGCG ATAGCTTAAG GAGAAATATT GATTTAGGC 99