本發(fā)明涉及可以用作定量和/或半定量突變檢測方法，具體地，數(shù)字PCR或下一代測序方法的對照和/或參考的組合物。本發(fā)明還描述了合成核酸構建體，具體地，存在于所述組合物中的質粒、包含所述組合物的試劑盒、它們的用途以及涉及使用根據(jù)本發(fā)明所述的組合物的方法。此外，本文描述了用于提供根據(jù)本發(fā)明所述的組合物的方法。

背景技術：

核酸序列的使用已成為現(xiàn)代醫(yī)學的多種診斷領域中的必需工具。具體地，基于下一代測序(NGS)的基因測試正迅速在臨床診斷學中獲得認可。該領域的實例為腫瘤學，其中使用核酸測序來鑒定(例如)致癌突變是否存在于基因中或者引起和/或指明癌癥的移位是否存在于基因組中。此外，使用核酸測序來檢測病原微生物(如，例如，細菌或病毒)是否存在于來自人患者的臨床樣品，例如，組織樣品或血液樣品中。在后一種方法中，檢測不存在于人受試者中，而僅存在于微生物中的核酸序列。因此，NGS方法可以導致靶標序列的鑒定和序列確定，其可以表明致癌突變的存在或不存在或者病原體-來源的核酸的存在或不存在。

因此，目前開發(fā)了用于診斷目的的基于NGS技術及其它定量和/或半定量突變檢測方法的診斷試劑盒和/或方法。然而，由于管理性規(guī)定，在許多國家，在實際產品許可進入市場之前，必須顯示這類診斷試劑盒和方法的準確度和有用性(例如，通過達到特定靈敏度閾值)。

在該背景下，通常需要顯示所使用的方法適合檢測稀有突變或稀有核酸，例如，以5％或以下的頻率在臨床樣品中發(fā)生的突變或核酸。另外，為了確保已正確進行診斷方法，由此避免任何假陰性結果，還必須提供具有如通常在臨床樣品中處于類似的低頻率的待檢測的突變或核酸的陽性對照。

然而，對于稀有突變(如在某些類型癌癥中存在的突變)或對于以低百分比存在于樣品中的核酸(例如，來源于病原體的核酸)，很難獲得可以用作測試材料的攜帶處于所需頻率的待檢測的突變和/或核酸的臨床樣品。因此，需要包含處于所需頻率的待檢測的稀有突變和/或核酸的參考組合物和/或對照組合物。

技術實現(xiàn)要素：

因此，本發(fā)明的目標是提供這種參考和/或對照組合物。

在本發(fā)明的背景中，現(xiàn)已意外地發(fā)現(xiàn)組合物以限定的摩爾比包含(i)合成核酸構建體，具體地，包含至少一種插入的野生型核酸序列的質粒或(ii)基因組DNA和(iii)合成核酸構建體，具體地，包含至少一種插入的靶標核酸序列的質粒，所述組合物可以用作用于半定量和/或定量方法(如NGS或數(shù)字PCR)的這種參考和/或對照組合物。

通過使用本發(fā)明所述的組合物，不再需要使用可能難以獲得并且其中所存在的待檢測的突變或核酸的頻率可能不同的臨床樣品。此外，本發(fā)明所述的組合物提供了以下優(yōu)勢：可以提供它們用于任何所需的待檢測突變或核酸或待檢測突變或核酸的組合以及用于任何所需百分比的待檢測突變或核酸。

在以下說明中，提及了存在于根據(jù)本發(fā)明所述的組合物中的質粒(i)和(iii)。然而，應理解當然在本發(fā)明的背景中還可以使用能夠包含野生型靶標序列或其突變體或者任何其它序列(如來源于病原體的序列)中任一種的任何其它合成核酸構建體。

因此，在一個方面，本發(fā)明涉及組合物，其包含：

(i)含有至少一種插入的野生型核酸序列的質粒，或

(ii)野生型基因組DNA序列，

與限定的摩爾比的

(iii)含有至少一個插入的靶標核酸序列的質粒。

一個實施方式涉及所述組合物，其中所述質粒(iii)包含1-50個插入的靶標核酸序列。在另一個實施方式中，質粒(iii)包含1-30個插入的靶標核酸序列。

在其它實施方式中，質粒(iii)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個插入的靶標核酸序列。

在另一個實施方式中，(iii)和(i)或(ii)的限定的摩爾比在1:10-1:30的范圍內，任選地，(iii)和(i)或(ii)的限定的摩爾比為1：15至1:25，例如，1:20、1:18，任選地，1:19。

在另一個實施方式中，所述組合物為用于定量和/或半定量突變檢測方法的陽性對照組合物或參考組合物。

在一個實施方式中，所述定量和/或半定量突變檢測方法為數(shù)字PCR和/或下一代測序(NGS)。

本發(fā)明的另一個方面涉及在定量和/或半定量突變檢測方法中如本文所述的組合物作為對照組合物和/或參考組合物的使用。在一個實施方式中，將所述組合物用作陽性對照組合物。

在另一個方面，將所述組合物用于測試定量和/或半定量突變檢測方法的靈敏度。

在另一個實施方式中，將確認對于平均以10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％或3％存在于樣品中的一個或多個靶標序列的靈敏度。

在其它實施方式中，所述突變檢測方法為數(shù)字PCR和/或下一代測序(NGS)。

在另一個實施方式中，所述定量和/或半定量突變檢測方法用于來源于病原體或致癌基因的序列的存在與否的檢測。

本發(fā)明的其它方面涉及確認半定量和/或定量檢測方法對于一個或多個靶標序列的靈敏度的方法，其包括以下步驟：

(i)提供如本文所述的組合物，

(ii)使用所述組合物實施所述半定量和/或定量檢測方法，和

(iii)評價所述檢測方法的靈敏度。

本發(fā)明的另一個方面涉及制備如本文所述的組合物的方法，其中所述方法包括以下步驟：

(i)將野生型序列引入到質粒中或提供野生型基因組DNA(gDNA)，

(ii)將至少一個靶標序列引入到單獨的質粒中，

(iii)所述質粒和/或gDNA的絕對定量

(iv)以限定的摩爾比制備(i)和(ii)的組合物。

在用于制備如本文所述的組合物的方法的一個實施方式中，通過數(shù)字PCR(dPCR)，任選地通過數(shù)字微滴式PCR(ddPCR)進行所述質?；騡DNA的絕對定量。

本發(fā)明的另一個方面涉及包含如本文所述的組合物的試劑盒。

附圖說明

圖1顯示了制備作為如以下所述的實施例中所使用的NGS測定的測試材料的質粒組合物的列表。

定義

除非上下文中明確規(guī)定，否則如本說明書和權利要求中所使用的，單數(shù)形式的“一個”也包括相應的復數(shù)形式。反之亦然，當使用名詞的復數(shù)形式時，除非上下文明確表明，否則它還表示單數(shù)形式。例如，當提及復數(shù)的突變時，還理解為涉及單個突變。

需要理解術語“包括”不是限制性的。出于本發(fā)明的目的，術語“由…組成”應認為是術語“包括”的優(yōu)選實施方式。如果在下文中將組定義為包括至少某些實施方式，則這還意味著涵蓋了優(yōu)選地僅由這些實施方式組成的組。

此外，說明書和權利要求中的術語第一、第二、第三或(i)、(ii)、(iii)等用于區(qū)別類似的元素并且不必須用于描述順序或依時間次序。應理解在適當?shù)那闆r下，如此使用的術語是可互換的，并且本文所述的本發(fā)明的實施方式能夠以本文所述或所示的順序以外的順序進行。然而，在本發(fā)明的具體實施方式中，依時間次序進行方法步驟(i)、(ii)和(iii)，其任選地包括本文定義的任何中間步驟。

在本發(fā)明的背景中，所表示的任何數(shù)值通常與本領域技術人員將理解的仍確保所討論的特征的技術效果的準確度間隔有關。如本文所使用的，與所示數(shù)值的偏差在±10％的范圍內，并且優(yōu)選地，±5％的范圍內。還通過本文所使用的術語“約”和“大約”相對于數(shù)值表明了上述與所示±10％，并且優(yōu)選地±5％的數(shù)值間隔的偏差。

在本發(fā)明的背景中，術語“核酸”是指處于單鏈或雙鏈形式的天然存在的脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸聚合物。所述核酸可以具體地為雙鏈DNA和單鏈RNA。

如本文所使用的術語“序列”是指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物中堿基的順序出現(xiàn)，其中脫氧核糖核苷酸聚合物中存在的堿基選自A、T、G和C，核糖核苷酸聚合物中存在的堿基選自A、U、G和C。因此，脫氧核糖核苷酸聚合物中堿基序列可以是(例如)GGAAGCAAGCCT，而核糖核苷酸聚合物中堿基序列可以是(例如)GGAAUCGAU。

如本文所使用的“野生型序列”或“野生型核酸序列”涉及通常在群體，例如人中存在的核酸序列。在本發(fā)明的背景中，“野生型序列”表示所述序列不指示對于通過所使用的診斷方法檢測的病癥(例如，特定類型癌癥)或病原生物。這也適用于如本文所使用的“野生型基因組DNA”，其還涉及通常在群體(例如人)中存在的所述DNA序列，或者如在本發(fā)明的背景中所使用的，所述DNA序列不指示通過所使用的診斷方法檢測的病癥或病原生物。

如本文所提及的“靶標序列”或“靶標核酸序列”是這樣的核酸序列，在根據(jù)本發(fā)明所述的方法中檢測所述核酸序列的存在與否并且所述核酸序列指示通過所使用的診斷方法檢測的病癥或病原生物。一個或多個靶標序列的存在可以指示癌癥(例如，致癌基因)，或者微生物(具體地，病原微生物)的存在，或者涉及任何其它疾病(例如，代謝疾病、遺傳病癥、自身免疫病等)的發(fā)展、嚴重性、恢復的核酸序列。

靶標核酸包括(但不限于)DNA，如(但不限于)基因組DNA、線粒體DNA、cDNA等，和RNA，如(但不限于)mRNA、miRNA等。靶標核酸可以來源于任何來源，包括天然存在的來源或合成來源。所述核酸可以是PCR產物、粘粒、質粒、天然存在或合成的文庫成員或種類等。本發(fā)明不意欲限制于該方面。所述核酸可以來自動物或病原體來源，其包括但不限于哺乳動物，如人，和微生物，如細菌、病毒、真菌、寄生蟲和分枝桿菌屬。在一些實施方式中，所述核酸不是病毒核酸。靶標核酸可以得自任何體液或組織，其包括(但不限于)血液、唾液、腦脊髓液(“CSF”)、皮膚、毛發(fā)、尿液、大便和粘液。靶標核酸還可以來源于但不限于環(huán)境樣品(如水樣)、食物樣品、或森林樣品，所述樣品可以是新鮮樣品(例如，直接進行核酸提取的活組織檢查材料)，或已處理使得能夠儲存的樣品，例如，福爾馬林-固定和/或石蠟包埋的樣品(FFPE樣品)。

具體地，所述靶標序列可以是攜帶先前插入到質粒的野生型序列(i)或野生型基因組DNA(ii)的突變的序列，所述序列應通過如本文所述的診斷方法檢測(即靶標突變)。具有靶標突變的這些靶標序列可以指示致病狀況，如癌癥(即所謂的致癌基因)。此外，靶標序列可以是指示病原體的存在，如病原微生物的存在的序列。

如本文所使用的“稀有突變”或“稀有核酸序列”表示以平均小于10％，具體地，平均小于5％存在于得自患者的臨床樣品中的核酸的任何突變或序列?！耙云骄鵻％存在于樣品中的靶標序列”表示相對于存在于樣品中的野生型序列的量以百分比x存在于樣品中的靶標序列。因此，如本文所使用的靶標序列的百分比始終涉及存在于組合物和/或樣品中的野生型序列的量和靶標序列的量的比值。

如本文所使用的，術語“樣品”是指來自任何人或獸醫(yī)受試者的可以測試包含靶標序列的核酸的存在的任何生物樣品。所述樣品可以包括得自任何器官的組織，如(例如)肺組織，和得自任何器官的液體，如(例如)血液、血漿、血清、淋巴液、關節(jié)液、腦脊髓液、羊膜水、羊膜臍血、淚、唾液和鼻咽清洗液。如上所列，樣品還可以來源于身體的特定區(qū)域，例如，呼吸道；來自呼吸道的樣品包括喉拭子、喉清洗液、鼻拭子和來自下呼吸道的樣品。如本文所使用的樣品還包括包含腫瘤組織的實體組織樣品。這些樣品可以包括腫瘤組織和周圍組織或者僅腫瘤組織。

所述樣品可以來源于人或獸醫(yī)受試者。因此，“患者”可以是人或獸醫(yī)受試者。如果提及“臨床樣品”，則這表示該樣品來自于懷疑帶有包含靶標序列的核酸的患者。

術語“致癌基因”分別以其在分子生物學和腫瘤學中的常規(guī)含義在本文中使用。因此，存在(例如)在基因中已知的突變，其使得“正?；蛞吧汀被蚓哂兄掳┬?，即引起癌癥；這方面的實例為使得激酶具有組成型活性從而持續(xù)傳遞特定信號(例如，誘導生長的信號)并起始相應過程的突變。如本文所使用的“致癌基因”還可以涉及也會導致引起癌癥情況的染色體內或染色體間易位。如本文所使用的術語“微生物”以其最廣泛的含義使用。因此，微生物可以是任何類型的細菌、古菌、原生動物(protozoum)、真菌和病毒。明確提及病毒在如本文所使用的“微生物”的定義內。如本文所使用的術語“病原體”或“病原微生物”涉及具有在患者中導致疾病的能力的任何類型的微生物。

如本文所使用的術語“檢測存在”應理解為“檢測存在或不存在”。

如本文所使用的“診斷方法”表示可以用于診斷目的，例如，用于檢測存在于得自患者的樣品中的靶標序列的任何定量或半定量突變檢測方法。具體地，診斷方法表示下一代測序方法和微滴式PCR(dPCR)，任選地，數(shù)字微滴式PCR(ddPCR)。

“定量檢測方法”或“定量突變檢測方法”表示可以用于確定靶標序列的量的任何檢測方法，如下一代測序、qPCR或數(shù)字PCR。如本文所使用的“半定量檢測方法”或“半定量突變檢測方法”涉及允許近似確定靶標序列的量的任何方法，如PCR或RT-PCR。

如本文所使用的“數(shù)字PCR”涉及其中將樣品分配到大量小的子樣品中，并隨后對每個子樣品進行PCR擴增反應的任何PCR方法。PCR擴增之后，考慮泊松分布可以通過對包含PCR最終產物的子樣品(陽性反應)和不包含PCR最終產物的子樣品(陰性反應)計數(shù)來定量核酸。與常規(guī)PCR相反，數(shù)字PCR(dPCR)不依賴于為了確定初始樣品的量所實施的擴增循環(huán)的數(shù)目，因此消除了對定量靶標核酸的不確定指數(shù)數(shù)據(jù)的依賴性并且提供了絕對定量。如本文所使用的“數(shù)字微滴式PCR”涉及數(shù)字PCR方法，其中將初始樣品細分成構成子樣品的一些微滴。

如本文所使用的，術語“下一代測序”或“下一代測序方法”是指與常規(guī)基于桑格和毛細管電泳的方法相比，通量提高(例如，具有每次產生數(shù)十萬相對小的序列讀數(shù)的能力)的任何測序技術。下一代測序技術的一些實例包括(但不限于)通過合成測序、通過連接測序和通過雜交測序。

如本文所使用的，術語“擴增”是指酶介導的程序，其能夠產生數(shù)十億的核酸靶標的拷貝。本領域中已知的酶介導的靶標擴增程序的實例包括PCR。

“提取核酸”是指從任何細胞背景中分離存在于小瓶中的任何核酸，具體地，從完整細胞或組織分離。優(yōu)選地，在所述方法期間還清洗核酸并任選地濃縮。提取后，除去與核酸無關的所有細胞或組織碎片。典型的提取方法可以包括低滲裂解緩沖液、熱和/或去污劑的使用，并且所述提取方法是技術人員已知的。

在本文中以分子生物學中的常規(guī)含義使用術語“測序”。因此，確定了核酸序列中準確的堿基順序出現(xiàn)。

具體實施方式

如以上所討論的，需要可以用作包含在半定量或定量核酸突變檢測方法中檢測的稀有突變或稀有核酸的對照或參考組合物的組合物。

在本發(fā)明的背景中，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)包含含有插入的野生型核酸序列或野生型基因組DNA的質粒與限定的摩爾比的含有至少一種插入的靶標序列的質粒的組合物可以用于這些目的。

因此，本發(fā)明的一個方面涉及組合物，其包含：

(i)含有至少一種插入的野生型核酸序列的質粒，或

(ii)野生型基因組DNA序列，

與限定的摩爾比的

(iii)含有至少一個插入的靶標核酸序列的質粒。

所述插入的靶標核酸序列可以是攜帶野生型序列的突變或指示通過如本文所述診斷方法檢測的病原體存在的序列的任何序列。通過如本文所述的診斷方法檢測的突變可以是指示疾病或病癥，如癌癥的任何突變。

在一個實施方式中，質粒(iii)可以包含指示癌癥的任何靶標序列或靶標序列的組合。例如，所述靶標序列或靶標序列的組合可以指示肺癌、乳腺癌、甲狀腺癌、白血病、黑素瘤、結腸直腸癌、前列腺癌、肝癌、淋巴瘤或卵巢癌。在一個實施方式中，所述靶標序列或靶標序列的組合指示黑素瘤、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、甲狀腺癌和/或白血病。在一個實施方式中，所述靶標序列或靶標序列的組合指示黑素瘤。在一個實施方式中，所述靶標序列或靶標序列的組合指示非小細胞肺癌。在一個實施方式中，所述靶標序列或靶標序列的組合指示結腸直腸癌。在一個實施方式中，所述靶標序列或靶標序列的組合指示甲狀腺癌。在一個實施方式中，所述靶標序列或靶標序列的組合指示白血病。

在一個實施方式中，所述靶標序列或靶標序列的組合指示致癌基因，任選地，人致癌基因。待檢測的人致癌基因可以是基因中的突變，所述基因選自BRAF、NRAS、CDKN2A、MAP2K1、MAP2K2、FGFR3、FGFR4、AKT3、KIT、PIK3CA、GNA11和GNAQ。在一個實施方式中，待檢測的靶標序列或靶標序列的組合是一個或多個突變，其選自如下表1所示的組：

然而，在另一個實施方式中，所述靶標序列或靶標序列的組合還可以指示微生物的存在，具體地，病原微生物的存在。因此，所述靶標序列或靶標序列的組合還可以指示病毒的存在，例如，丙型肝炎病毒(HCV)或人類免疫缺陷性病毒(HIV)。

在另一個實施方式中，指示致癌基因和微生物的存在的所述靶標序列或靶標序列的組合存在于質粒(iii)上。

在本發(fā)明的一個實施方式中，各個質粒(iii)包含超過一個插入的靶標序列，例如，1-50個靶標序列。在另一個實施方式中，質粒(iii)包含1-40個靶標序列。在又另一個實施方式中，質粒(iii)包含1-30個靶標序列。在進一步的實施方式中，質粒(iii)包含1-20個靶標序列。在進一步的實施方式中，質粒(iii)包含1-10個靶標序列。在進一步的實施方式中，質粒(iii)包含1-5個靶標序列。

在本發(fā)明的其它實施方式中，質粒(iii)可以包含圖1中所示的靶標序列的任意組合。在一個實施方式中，質粒(iii)包含圖1中質?；旌衔颪o.1的靶標序列的組合。在一個實施方式中，質粒(iii)包含圖1質?；旌衔颪o.2的靶標序列的組合。在一個實施方式中，質粒(iii)包含圖1質粒混合物No.3的靶標序列的組合。在一個實施方式中，質粒(iii)包含圖1質?；旌衔颪o.4的靶標序列的組合。在一個實施方式中，質粒(iii)包含圖1質?；旌衔颪o.5的靶標序列的組合。在一個實施方式中，質粒(iii)包含圖1質粒混合物No.6的靶標序列的組合。在一個實施方式中，質粒(iii)包含圖1質粒混合物No.7的靶標序列的組合。在一個實施方式中，質粒(iii)包含圖1質?；旌衔颪o.8的靶標序列的組合。在一個實施方式中，質粒(iii)包含圖1質?；旌衔颪o.9的靶標序列的組合。在一個實施方式中，質粒(iii)包含圖1質?；旌衔颪o.10的靶標序列的組合。在一個實施方式中，質粒(iii)包含圖1質?；旌衔颪o.11的靶標序列的組合。在一個實施方式中，質粒(iii)包含圖1質粒混合物No.12的靶標序列的組合。在一個實施方式中，質粒(iii)包含圖1質?；旌衔颪o.13的靶標序列的組合。在一個實施方式中，質粒(iii)包含圖1質粒混合物No.14的靶標序列的組合。在一個實施方式中，質粒(iii)包含圖1質?；旌衔颪o.15的靶標序列的組合。在一個實施方式中，質粒(iii)包含圖1質粒混合物No.16的靶標序列的組合。在一個實施方式中，質粒(iii)包含圖1質?；旌衔颪o.17的靶標序列的組合。在一個實施方式中，質粒(iii)包含圖1質粒混合物No.18的靶標序列的組合。當然，還可能根據(jù)需要合并以上提及的一個或多個混合物。

應理解質粒(i)可以包含對應于質粒(iii)的靶標序列的野生型序列，并因此還包含相同量的作為插入質粒(iii)中的靶標序列的野生型序列。例如，如果質粒(iii)包含5個在BRAF基因中具有突變的靶標序列，則質粒(i)還可以包含BRAF基因的相應5個野生型序列。一般地，質粒(i)和(iii)可以在一個或多個不同的單個質?；蜃踊旌衔?sub-pool)上攜帶所有所需的序列(野生型或突變序列)。例如，包含約30個插入序列的質?；旌衔锟梢栽跇嫵伤鲑|粒混合物的單個質粒上攜帶所有這些?？蛇x地，還考慮質?；旌衔锇^一種類型的攜帶幾個，例如，3、4、5或更多個插入序列的質粒，例如，2、3、4、5或更多種質粒。這些單個質粒構成了可以在一起形成質?；旌衔锏膩喗M。本發(fā)明的優(yōu)勢在于質粒亞組可以用于驗證不同的測定，例如，當可以在不同的測定(例如，癌癥測定1和癌癥測定2)中使用靶標基因時，不需要重新設計整個質粒混合物(i)和(iii)。

如果將超過一個靶標序列或超過一個野生型序列插入質粒(i)或(iii)時，可以以特定距離在質粒中引入野生型或靶標序列。野生型或靶標序列之間的距離可以是本領域技術人員認為適合的任何距離。應理解質粒(iii)上存在的不同的野生型或靶標序列之間的距離可以在每個野生型或靶標序列之間是相同或者可以在不同的野生型或靶標序列之間改變。質粒(iii)上存在的野生型或靶標序列之間的距離可以為至少10bp、至少30bp、至少50bp、至少100bp、至少150bp、至少200bp、至少250bp、至少300bp、至少350bp或至少400bp。

存在于所述組合物中的質粒可以是本領域技術人員出于該目的認為適合的任何質粒。本領域技術人員已知出于該目的適合的質粒，并且所述質?？梢园╬BR322、pBR327、pUC-8、pUC-19、pUC-57、pGEM3Z、M13mpl、M13mp2和M13mp7。

如果本發(fā)明的組合物包含(i)含有至少一種插入的野生型序列的質粒和(iii)包含至少一種插入的靶標序列的質粒，則質粒(i)和(iii)可以基于相同類型的質?；虿煌愋偷馁|粒。在一個實施方式中，質粒(i)和(iii)基于相同類型的質粒。在另一個實施方式中，質粒(i)和(iii)兩者均基于pUC-57。

質粒(i)或gDNA(ii)可以與質粒(iii)以本領域技術人員認為適合的任何摩爾比存在，以實現(xiàn)和/或確認診斷方法所需的靈敏度。所需的靈敏度可以是例如出于上市許可的目的所述診斷方法必須實現(xiàn)的任何靈敏度。如本文所使用的“靈敏度”表示通過所述診斷方法實際正確鑒定為靶標序列的比例，即它涉及診斷方法正確鑒定靶標序列的能力。

(iii)與(i)或(ii)的摩爾比可以是任何摩爾比，其使得能夠實現(xiàn)通常在樣品，具體地，臨床樣品中存在的通過診斷測試應檢測的靶標序列的平均百分比。(iii)與(i)或(ii)的摩爾比可以是靶標序列以約10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％存在于根據(jù)本發(fā)明所述的組合物中的任何摩爾比。在一個實施方式中，(iii)與(i)或(ii)的摩爾比是靶標序列以約5％存在于根據(jù)本發(fā)明所述的組合物中的摩爾比。

因此，(iii)與(i)或(ii)的摩爾比可以在1:10-1:30的范圍內。在一個實施方式中，(iii)與(i)或(ii)的摩爾比選自1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30。在本發(fā)明的一個實施方式中，(iii)與(i)或(ii)的摩爾比為1:19。在本發(fā)明的背景中，已發(fā)現(xiàn)當(iii)與(i)或(ii)的摩爾比為1:19時，所述組合物中靶標核酸的百分比為約5％。

如本文所述的組合物還可以引入到細胞或細胞系中，隨后對所述細胞或細胞系進行福爾馬林-固定和石蠟-包埋。因此，可以提供福爾馬林-固定和石蠟-包埋(FFPE)的參考組合物和/或對照組合物。當將通過所述診斷方法測試的樣品為通常的FFPE樣品時，因為FFPE參考和/或對照組合物可以更好地反映存在于得自人或獸醫(yī)受試者的樣品中的背景，因此這種FFPE組合物可以是特別適合的。因此，本發(fā)明的另一個方面涉及已引入細胞(所述細胞隨后進行福爾馬林-固定和石蠟-包埋)的如本文所述的組合物。

本文所述的組合物可以用作用于任何定量或半定量法的參考或對照組合物。然而，在本發(fā)明的一個方面，在NGS方法或數(shù)字PCR中將如本文所述的組合物用作參考或對照組合物。在具體的實施方式中，其中將本文所述的組合物用作參考或對照組合物的檢測方法是NGS方法。在另一個實施方式中，其中本文所述的組合物用作參考或對照組合物的檢測方法是數(shù)字PCR，任選地，數(shù)字微滴式PCR。

通常使用參考組合物以確認和/或測試診斷方法(例如，定量和/或半定量突變檢測方法)的靈敏度，而使用對照組合物以確保診斷方法(例如，定量和/或半定量法)正確進行。本文所述的組合物可以用于這兩個目的。

在本發(fā)明的背景中，“參考組合物”(或“標準品”)是以預定量包含一個或多個靶標序列(如包含稀有突變的序列或對某些病原體具有特異性的序列)的組合物，其可以用于測試所述診斷方法是否能夠檢測和/或測定所述靶標序列。如在本發(fā)明的背景中使用的“對照組合物”表示用作對照，具體地，陽性對照的任何組合物，以確保所述診斷方法已正確進行。通常，對照組合物以預定的量包含通過所述診斷方法應檢測的一種或多種靶標序列。因此，在本發(fā)明的一個實施方式中，所述對照組合物是陽性對照組合物。其中所述靶標序列存在于參考組合物或對照組合物中的預定的量通常反映了靶標序列存在于待測試是否存在所述靶標序列的樣品中的平均百分比。然而，具體地，相對于參考組合物，預定的量還可以是存在于樣品中的靶標核酸的任何百分比，例如，出于上市許可的目的，所述診斷方法應能檢測所述靶標核酸。以上描述了靶標序列的不同百分比和相應摩爾比。因此，在參考組合物的一個實施方式中，它包含約5％的靶標序列。

在本發(fā)明的另一個方面，如本文所述的組合物可以用于確認診斷方法(例如，定量和/或半定量突變檢測方法)的靈敏度。

具體地，可以使用如本文所述的組合物以確認所述診斷方法對于平均以約10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％存在于來源于人或獸醫(yī)受試者的樣品中的一種或多種靶標序列的靈敏度。在本發(fā)明的一個實施方式中，如本文所述的組合物用于確認診斷方法對于平均以約10％存在于來源于人或獸醫(yī)受試者的樣品中的一種或多種靶標序列的靈敏度。在本發(fā)明的另一個實施方式中，如本文所述的組合物用于確認診斷方法對于平均以約5％存在于來源于人或獸醫(yī)受試者的樣品中的一種或多種靶標序列的靈敏度。

在本發(fā)明的一個實施方式中，如本文所述的組合物可以用于確認數(shù)字PCR和/或下一代測序方法的靈敏度。在一個實施方式中，所述組合物用于確認數(shù)字PCR，具體地，數(shù)字微滴式PCR的靈敏度。在另一個實施方式中，所述組合物用于確認下一代測序方法的靈敏度。

在進一步的實施方式中，將對其確認靈敏度的所述診斷方法是用于檢測靶標序列(如指示如本文所述的致癌基因或病原生物的靶標序列)是否存在的定量和/或半定量突變檢測方法。

本發(fā)明的另一個方面涉及確認診斷方法(如半定量和/或定量突變檢測方法)的靈敏度的方法，其中所述方法包括以下步驟：

(i)提供如本文所述的組合物，

(ii)使用所述組合物實施所述檢測方法，和

(iii)評價所述方法的靈敏度。

所述方法的步驟(i)可以包括用于制備本文所述的組合物的方法的任何步驟。應理解出于其預期使用的目的，可以調整所述組合物。如果(例如)應確認所述診斷方法對于平均以5％存在于樣品中的一種或多種靶標序列的靈敏度，則必須使用以5％包含所述靶標序列的參考組合物。因此，在一個實施方式中，在確認診斷方法靈敏度的方法中使用以1:19的摩爾比包含質粒(iii)和質粒(i)或gDNA(ii)的組合物。

在步驟(ii)中，通過使用如本文所述的組合物作為參考組合物，可以實施應確認靈敏度的檢測方法(例如，半定量和/或定量檢測方法)。例如，在步驟(ii)中，使用如本文所述的組合物作為參考組合物，實施下一代測序方法或數(shù)字PCR。在所述方法的一個實施方式中，在步驟(ii)中，實施下一代測序方法。在所述方法的另一個實施方式中，在步驟(ii)中，實施數(shù)字PCR，具體地，數(shù)字微滴式PCR。

在確認如本文所述的診斷方法的靈敏度的方法的步驟(iii)中，評價了所述診斷方法用于檢測靶標序列的靈敏度。由于已知存在于所使用的參考組合物中的靶標序列的百分比，因此這可以通過將通過所實施的檢測方法實現(xiàn)的結果與存在于參考組合物中的靶標序列已知的百分比相比較來進行。

應理解可以在幾個平行的試驗中進行步驟(i)-(ii)，并隨后在步驟(iii)中，將在試驗中獲得的值的平均百分比與存在于參考組合物中的靶標核酸已知的百分比相比較。

因此，在一個實施方式中，可以在至少2、至少3、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少50或至少100個平行試驗中進行步驟(i)-(ii)，并且隨后將在所述試驗中檢測的靶標核酸的平均百分比與存在于參考組合物中的靶標核酸的已知百分比相比較。在另一個實施方式中，可以在2-100個平行試驗中進行步驟(i)-(ii)，任選地，在10-50個平行試驗中進行，并隨后將在所述試驗中檢測的靶標核酸的平均百分比與存在于參考組合物中的靶標核酸已知的百分比相比較。在另一個實施方式中，在2、3、5、10、15、20、25、30、50或100個平行試驗中進行步驟(i)-(ii)，并隨后將在所述試驗中檢測的靶標核酸的平均百分比與存在于參考組合物中的靶標核酸的已知百分比相比較。。

如果在步驟(iii)中發(fā)現(xiàn)通過待測試的診斷方法確定的靶標序列的百分比對應于存在于參考組合物中的靶標核酸已知的百分比，則確認所述測試對于參考組合物的靈敏度。應理解如在本發(fā)明的背景中使用的，“對應于存在于參考組合物中的靶標核酸已知的百分比”不必須表示通過待測試的診斷方法確定的靶標序列的百分比和存在于參考組合物中的百分比確實必須是完全相同的值。本領域技術人員應理解這些值之間的某些偏差是可以接受的，具體地，如果確定了已實施的平行試驗的平均值。不同的值之間的偏差量可以取決于測試所需的靈敏度。然而，在一個實施方式中，通過待測試診斷方法確定的靶標序列的值和存在于參考組合物中的靶標序列已知的值之間0.1％-10％的偏差，任選地，0.1-5％的偏差可以認為是可接受的。在一個實施方式中，通過待測試診斷方法確定的靶標序列的值和存在于參考組合物中的靶標序列已知的值之間0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％或5％的偏差可以認為是可接受的，以確認所述診斷方法的靈敏度。

在它的另一個方面，本發(fā)明涉及用于制備如本文所述的組合物的方法，其中所述方法包括以下步驟：

(i)將野生型序列引入到質粒中或提供野生型基因組DNA(gDNA)，

(ii)將靶標序列引入到單獨的質粒中，

(iii)質粒和/或gDNA的絕對定量

(iv)以限定的摩爾比制備(i)和(ii)的組合物。

可以通過本領域技術人員已知用于將序列引入到質粒中或用于提供基因組DNA的任何方法實施所述方法的步驟(i)和(ii)。步驟(iii)包括包含至少一種野生型序列的質粒、gDNA和/或攜帶靶標序列的質粒的絕對定量。在一個實施方式中，步驟(iii)包括包含至少一種野生型序列的質粒和攜帶靶標序列的質粒的絕對定量。在另一個實施方式中，步驟(iii)包括gDNA和攜帶靶標序列的質粒的絕對定量。

可以通過使用本領域中已知的任何定量檢測方法，如qPCR、dPCR或NGS進行在步驟(iii)中實施的絕對定量。在本發(fā)明的一個實施方式中，通過dPCR，具體地，通過ddPCR進行絕對定量。

基于步驟(iii)中獲得的結果，可以通過這種方式混合(i)和(ii)的組合物以在本文所述的方法的進一步的步驟(iv)中實現(xiàn)(ii)與(i)所需的摩爾比。在本發(fā)明的一個實施方式中，以這種方式混合(i)和(ii)的組合物從而獲得1:19的摩爾比的包含靶標序列的質粒和包含至少一種野生型序列或gDNA的質粒。

通過上述方法獲得的組合物可以是如本文所述的任何組合物，并因此可以用于如本文所述的任何目的。

在本發(fā)明的進一步的方面，提供了包含如本文所述的組合物的試劑盒。這些試劑盒可以是包含如本文所述的組合物作為參考組合物的試劑盒?？蛇x地，這些試劑盒可以是包含如本文所述的組合物作為陽性對照的試劑盒。

在一個實施方式中，所述試劑盒還包含用于要實施的診斷方法，例如，用于半定量和/或定量突變檢測方法的其它試劑。在一個實施方式中，所述試劑盒進一步包含用于下一代測序方法和/或數(shù)字PCR的其它試劑。其它試劑可以包括化學試劑。此外，根據(jù)本發(fā)明所述的試劑盒還可以包含說明書插頁等。

應理解如本文所定義和使用的所有定義優(yōu)先于詞典定義、通過引用并入的文檔中的定義和/或所定義術語的常規(guī)含義。本文提及的所有專利和專利公開以其全部內容通過引用并入。

應理解盡管已結合本文所述的實施方式描述了本發(fā)明，但是上述描述以及隨后的實施例旨在說明而不是限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍內的其它方面、優(yōu)勢和修飾對于本發(fā)明所屬領域的技術人員將是顯而易見的。

提供以下實施例，從而為本領域的技術人員提供如何制備和使用本發(fā)明的組合物的完整公開和描述。所述實施例旨在作為本發(fā)明的非限制性實施例。盡管已盡力確保變量，如量、溫度等的準確度，但是應考慮實驗誤差和偏差。除非另外說明，否則分數(shù)是重量份數(shù)，溫度以℃為單位，并且壓力為或接近大氣壓。除非另外說明，否則所有組分是商業(yè)獲得的。

實施例

方法：

簡而言之，將野生型基因擴增子序列引入到質粒pUC-57。將突變基因序列(即特定靶標序列)引入到單獨的質粒。將相距特定距離的幾個靶標序列引入到相同的基因擴增子序列和包含靶標序列不同組合的一個質粒，所述質粒可以來源于描述各個質?；旌衔锏膱D1中所示的表。由于包含野生型序列(WT質粒)的質粒和具有靶標序列的質粒(Mut質粒)共有相同主鏈序列，因此設計引物以使用QX200 EvaGreen ddPCR Supermix進行微滴式數(shù)字PCR(dd-PCR)來定量每個質粒的絕對拷貝數(shù)?？梢詫⑾嗤膁dPCR方法應用于定量可商購的正常人基因組DNA(gDNA)，例如，Promega，Cat#g1521的拷貝數(shù)。在測量質粒和/或正常人gDNA的絕對拷貝數(shù)之后，將Mut質粒與WT質?；蛘Ｈ薵DNA混合為任何限定的摩爾比。然后，通過Vela Diagnostics的腫瘤學下一代測序(NGS)測定法測試這些質粒組合物。

總結：

已發(fā)現(xiàn)通過上述方法制備的質粒組合物可以用作定量和半定量突變檢測方法(如數(shù)字PCR或下一代測序(NGS))的陽性對照或參考材料以確認所述技術對于在臨床樣品中難以發(fā)現(xiàn)的任何類型的靶標序列，包括稀有序列可以實現(xiàn)特定靈敏度(例如5％)。

結果：

通過上述方法產生了18個質?；旌衔?。如圖1所示的表中所述，質?；旌衔锖?-30個靶標序列范圍內的不同數(shù)目的特定靶標序列。將總計131個突變引入到這18個質?；旌衔镏?。通過NGS測定對所有18個質粒混合物測試3-5次，并且報告所有靶標序列的頻率。下表2中總結了結果。這些結果顯示當按照以上規(guī)程制備的質粒組合物以1:19的摩爾比含有Mut質粒和WT質粒時，對于質粒中大部分靶標序列，通過NGS測定檢測的靶標序列頻率為平均5％。結果還顯示可以將在一個基因擴增子序列中相隔特定距離的多個突變引入相同質粒并且通過NGS測定檢測的靶標序列的頻率是非常類似的，參見，例如，質粒1，其在一個BRAF基因擴增子序列中攜帶5個突變。另外，結果表明可以將具有野生型和突變型兩者的不同的基因擴增子序列的各種數(shù)目的質?；旌系较嗤幕旌衔镏幸酝瑫r評價對于不同基因突變的靈敏度，例如，如混合物1所示的具有9個不同靶標序列的質粒。

表2.使用以5％的限定的摩爾比混合的質?；旌衔镞M行的NGS測定所測量的靶標序列頻率