本發(fā)明涉及弓形蟲弱毒蟲株技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株gra17基因缺失的弓形蟲弱毒蟲突變株及其制備方法。

背景技術(shù)：

弓形蟲?。╰oxoplasmosis）是由弓形蟲引起的一種人獸共患寄生蟲病。全球約有三分之一的人口受其感染，弓形蟲可以感染幾乎所有的溫血?jiǎng)游铩魅拘詮?qiáng)、流行范圍大、宿主譜廣，目前尚無疫苗可用，因而防治該病的難度極大，對(duì)防治技術(shù)的要求很高。鑒于藥物治療弓形蟲病能力有限且毒副作用大的特點(diǎn)，研制其疫苗已逐漸成為防控弓形蟲病勢(shì)在必行的重大任務(wù)。目前，抗弓形蟲疫苗的類型主要包括全蟲（滅）活疫苗、蟲體特異組分疫苗、亞單位疫苗、病毒等活載體疫苗和蛋白及核酸疫苗等，然而大多數(shù)疫苗均不是很理想，為了增強(qiáng)免疫效果，提高免疫保護(hù)率，減毒活疫苗的疫苗研制將成為一個(gè)重要的研究課題。致密顆粒（densegranules,dg）是弓形蟲的感染宿主的不可或缺的重要組成部分，致密顆粒所分泌的蛋白叫做致密顆粒蛋白（gras），致密顆粒蛋白以可溶的蛋白復(fù)合物的形式存在于致密顆粒內(nèi)，有研究表示它是是構(gòu)成弓形蟲速殖子納蟲空泡膜和緩殖子囊壁的主要成分。在納蟲泡的形成過程中發(fā)揮重要的修飾調(diào)理作用，并與泡內(nèi)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有關(guān)，是蟲體能夠在細(xì)胞內(nèi)生存與復(fù)制的關(guān)鍵角色。免疫細(xì)胞化學(xué)研究揭示其在弓形蟲速殖子、緩殖子包囊及腸內(nèi)期蟲體表膜上都有分布，后續(xù)多個(gè)研宄證實(shí)其在弓形蟲急慢性感染中均具有較強(qiáng)的免疫原性，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生明顯、長效的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，抵抗弓形蟲感染。隨著不斷發(fā)現(xiàn)的致密顆粒蛋白，對(duì)其的研究也不斷深入。發(fā)現(xiàn)gra蛋白家族中有些蛋白是很好的毒力因子，參與了弓形蟲的入侵和復(fù)制，gra17就是一個(gè)重要的毒力因子，因此構(gòu)建gra17家族基因缺失的弓形蟲蟲株將有望篩選到具有潛在應(yīng)用價(jià)值的減毒活疫苗蟲株。目前國際上僅有的能上市的弓形蟲減毒活疫苗是s48，但是它僅限于對(duì)山羊和綿羊的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了一株gra17基因缺失的弓形蟲弱毒蟲突變株及其制備方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：一株gra17基因缺失的弓形蟲弱毒蟲突變株，所述的gra17基因缺失的弓形蟲弱毒蟲突變株為lz△gra17(toxoplasmagondillz△gra17)，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2016年11月14日，保藏地址為：武漢武漢大學(xué)，郵編430072，保藏編號(hào)為cctccno：v201656。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供了上述一株gra17基因缺失的弓形蟲弱毒蟲突變株的制備方法，包括以下步驟：

a）psag1::cas9-u6::sggra17質(zhì)粒構(gòu)建：

1）利用網(wǎng)頁軟件設(shè)計(jì)gra17的sgrna為gactgtccctgaggacccat；

2）利用q5定點(diǎn)突變?cè)噭┖泻蛿U(kuò)增引物將gra17的sgrna替換psag1::cas9-u6::sguprt載體中的sguprt構(gòu)建成psag1::cas9-u6::sggra17，擴(kuò)增引物為grna-fw:gactgtccctgaggacccatgttttagagctagaaatagc和grna-rv:aacttgacatccccatttac；

3）pcr條件為:以psag1::cas9-u6::sguprt為模板，利用引物grna-fw和grna-rv進(jìn)行psag1::cas9-u6::sggra17載體的pcr擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，55℃復(fù)性1min；72℃延伸5min；25個(gè)循環(huán)；

4）kld反應(yīng)：反應(yīng)體系為pcr產(chǎn)物1μl，2xkldreactionbuffer5μl，10xkldenzymemix1μl，ddh2o3μl；在室溫25度下反應(yīng)5分鐘；

5）轉(zhuǎn)化：將上述kld反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α中，挑取若干單菌落，提取質(zhì)粒，測(cè)序鑒定。測(cè)序正確的標(biāo)記為psag1::cas9-u6::sggra17；

b）質(zhì)粒大提：

1）挑取含psag1::cas9-u6::sggra17質(zhì)粒的陽性菌液于含1000u/mlamp+的lb固體選擇培養(yǎng)基上劃線，37℃培養(yǎng)過夜，挑取板上的一個(gè)單菌落置于4mllb液體選擇培養(yǎng)基中，搖床37℃，180～220rpm培養(yǎng)12～16h，將上述培養(yǎng)菌液以1：100的比例接種到裝有100mllb培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，搖床37℃，180～220rpm培養(yǎng)過夜；

2）將細(xì)菌培養(yǎng)物置于冰中或4℃冰箱數(shù)分鐘，4℃，9500rpm離心5min，收集細(xì)菌培養(yǎng)物沉淀，棄上清，倒置離心管使上清盡量流出，10ml預(yù)冷的solutioni重懸菌體，旋渦振蕩，使細(xì)菌在solutioni中完全分散；

3）加入20ml新配制的solutionii，輕搖并上下顛倒混勻3～5次，再加入15ml預(yù)冷的solutioniii，立即輕搖混勻，以免產(chǎn)生局部沉淀，冰上或-20℃冰箱放置10min，加solutionii和solutioniii的時(shí)間間隔控制在5min以內(nèi)，以免過分裂解；4℃或室溫，11000rpm離心10min，利用5層紗布將上清過濾，轉(zhuǎn)移到兩個(gè)新50ml離心管中；

4）上清與0.6倍體積異丙醇混勻，室溫放置10min；室溫下，11000rpm離心10min，棄上清，將空管倒置于濾紙上3-5分鐘，除去殘余，加入3mlddh2o充分溶解，再加入3ml預(yù)冷的5mlicl溶液，充分混勻，兩只離心管合并為一管，冰中或-20℃冰箱放置10min；4℃或室溫，11000rpm離心10min，將上清分別轉(zhuǎn)移到一新50ml離心管中，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，充分混勻，室溫放置10min；4℃或室溫，11000rpm離心10min，棄上清，倒置控干管內(nèi)液體，倒置10～15min即可。此時(shí)管壁會(huì)出現(xiàn)白色沉淀物即質(zhì)粒；

5）加入3mlddh2o或ph8.0的te溶液溶解沉淀，并加入30μl10mg/mlrnasea，37℃水浴1h除去rna，加入2倍體積無水乙醇和1/10體積的3mnaac溶液，充分混勻，冰中或-20℃冰箱放置20min；4℃，11000rpm離心10min，將上清吸出，并將離心管倒置于濾紙上控干，加入100μlddh2o或ph8.0的te溶液，充分洗脫質(zhì)粒沉淀，利用分光光度計(jì)測(cè)量所得質(zhì)粒的濃度并記錄，分裝封口后于-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

c）dhfr-ts*抗性marker的擴(kuò)增：

1）利用引物dhfr-fv：aagcttcgccaggctgtaaa和dhfr-rv：ggaattcatcctgcaagtgcatag擴(kuò)增dhfr-ts*抗性基因，反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，55℃復(fù)性30sec；72℃延伸3min30sec；30個(gè)循環(huán)；

2）使用omega普通瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒回收目的片段，利用分光光度計(jì)測(cè)量所得pcr產(chǎn)物的濃度并記錄，分裝封口后于-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

d）弓形蟲電擊轉(zhuǎn)染及獲取陽性單克隆：

1）將i型蟲株rh接種于75thff細(xì)胞中，當(dāng)蟲子裂解細(xì)胞75%時(shí)，用細(xì)胞刮子將蟲體刮起，過22g的針頭3-5次釋放細(xì)胞內(nèi)的蟲子；

2）利用3.0μm的濾器過濾上述蟲子去除細(xì)胞碎片，然后400g×10min離心取沉淀，利用hbssbuffer重懸，再400g×10min離心取沉淀；然后用cytomixbuffer重懸蟲子使其濃度達(dá)到4×10⁷個(gè)/ml，cytomixbuffer配比為：120mmkcl，0.15mmcacl2，10mmk2hpo4/kh2po4，25mmhepes，2mmedta，5mmmgcl2，ph7.6；

3）轉(zhuǎn)染體系包括：rh蟲子cytomix混合液250μl，dhfr-ts*抗性基因片段1.5μg，psag1::cas9-u6::sggra17載體7.5μg，0.2m、100×的atp3μl，0.5m、100×的谷胱甘肽3μl，cytomix共300μl；將轉(zhuǎn)染體系轉(zhuǎn)移到4mm電擊杯利用btxecm-830電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)程序?yàn)椋弘妷?700v,電擊時(shí)間176μs，電擊兩次，中間間隔100ms，然后將電轉(zhuǎn)的蟲子轉(zhuǎn)移到25thff細(xì)胞中；

4）在37℃，5%co2溫箱培養(yǎng)48h后，加入3μm的乙胺嘧啶，大約經(jīng)過7-10天發(fā)現(xiàn)耐藥性蟲子。

5）利用有限稀釋法進(jìn)行耐藥蟲株的篩選，將耐藥性的蟲子按照5-10個(gè)每孔接種于96孔板，在37℃，5%co2溫箱培養(yǎng)7-10天，在顯微鏡觀察蟲斑，選取每孔僅有1個(gè)蟲斑的接種到24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)；

6）重復(fù)步驟5）的有限稀釋法，對(duì)蟲株進(jìn)行單克隆化，得到純度為100%的遺傳背景相同的蟲株若干株；

7）將上述純化的蟲株接種到24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)的蟲子吸取一部分到1.5ml的離心管中，提取該蟲株的基因組；

8）pcr鑒定陽性蟲株，將缺失株及野生蟲株的基因組同時(shí)采用用下列引物：ko-gra17-f:tctacaagcacgcagaaagga和r:cgaaccggaagttaccacgac進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，55℃復(fù)性30sec；72℃延伸1min；30個(gè)循環(huán)，通過電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測(cè)野生株和突變株；

9）將對(duì)應(yīng)的陽性克隆從24孔中接種到25thff中擴(kuò)大培養(yǎng)，并凍存到液氮中長期保存。

缺失的gra17基因核苷酸序列如序列表中seqno.1和圖3所示。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供的一株gra17基因缺失的弓形蟲弱毒蟲突變株及其制備方法，是建立在分子生物學(xué)基礎(chǔ)上，基于crispr/cas9基因敲除技術(shù)，構(gòu)建的基因缺失蟲株，蟲株具有毒性減弱，并喪失了對(duì)小鼠的致死性的生物學(xué)特性，是具有巨大應(yīng)用價(jià)值的蟲株，可作為減毒活疫苗的候選蟲株。

附圖說明

圖1顯示為缺失株的構(gòu)建流程。

圖2顯示為突變株的pcr鑒定結(jié)果。

圖3顯示為缺失的gra17基因核苷酸序列。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

一株gra17基因缺失的弓形蟲弱毒蟲突變株，所述的gra17基因缺失的弓形蟲弱毒蟲突變株為lz△gra17，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctccno：v201656。

上述一株gra17基因缺失的弓形蟲弱毒蟲突變株的制備方法，如圖1所示，包括以下步驟：

一、psag1::cas9-u6::sggra17質(zhì)粒構(gòu)建：

1、利用網(wǎng)頁軟件設(shè)計(jì)gra17的sgrna為gactgtccctgaggacccat。

2、利用q5定點(diǎn)突變?cè)噭┖?neb)和擴(kuò)增引物（grna-fw:gactgtccctgaggacccatgttttagagctagaaatagc和grna-rv:aacttgacatccccatttac）將gra17的sgrna替換psag1::cas9-u6::sguprt載體中sguprt構(gòu)建成psag1::cas9-u6::sggra17。

3、pcr條件為:以psag1::cas9-u6::sguprt為模板，利用引物grna-fw和grna-rv進(jìn)行psag1::cas9-u6::sggra17載體的pcr擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，55℃復(fù)性1min；72℃延伸5min；25個(gè)循環(huán)。

4、kld反應(yīng)。反應(yīng)體系為pcr產(chǎn)物1μl，2xkldreactionbuffer5μl，10xkldenzymemix1μl，ddh2o3μl；在室溫25度下反應(yīng)5分鐘。

5、轉(zhuǎn)化。將上述2.2中的反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α中，挑取若干單菌落，提取質(zhì)粒，測(cè)序鑒定。測(cè)序正確的標(biāo)記為psag1::cas9-u6::sggra17。

二、質(zhì)粒大提：

1、挑取含psag1::cas9-u6::sggra17質(zhì)粒的陽性菌液于lb（含1000u/mlamp+，下同）固體選擇培養(yǎng)基上劃線，37℃培養(yǎng)過夜。挑取板上的一個(gè)單菌落置于4mllb液體選擇培養(yǎng)基中，搖床37℃，180～220rpm培養(yǎng)12～16h。將上述培養(yǎng)菌液以1：100的比例接種到裝有100mllb培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，搖床37℃，180～220rpm培養(yǎng)過夜。

2、將細(xì)菌培養(yǎng)物置于冰中或4℃冰箱數(shù)分鐘，4℃，9500rpm離心5min，收集細(xì)菌培養(yǎng)物沉淀，棄上清，倒置離心管使上清盡量流出。10ml預(yù)冷的solutioni重懸菌體，旋渦振蕩，使細(xì)菌在solutioni中完全分散。

3、加入20ml新配制的solutionii，輕搖并上下顛倒混勻3～5次。再加入15ml預(yù)冷的solutioniii，立即輕搖混勻，以免產(chǎn)生局部沉淀。冰上或-20℃冰箱放置10min。加solutionii和solutioniii的時(shí)間間隔控制在5min以內(nèi)，以免過分裂解。4℃或室溫，11000rpm離心10min，利用5層紗布將上清過濾，轉(zhuǎn)移到兩個(gè)新50ml離心管中。

4、上清與0.6倍體積異丙醇（15ml）混勻，室溫放置10min。室溫下，11000rpm離心10min，棄上清，將空管倒置于濾紙上數(shù)分鐘數(shù)分鐘，除去殘余。加入3mlddh2o充分溶解（很重要），再加入3ml預(yù)冷的5mlicl溶液，充分混勻（不可吹打）。兩只離心管合并為一管，冰中或-20℃冰箱放置10min。4℃或室溫，11000rpm離心10min，將上清分別轉(zhuǎn)移到一新50ml離心管中，加入等體積（12ml）預(yù)冷的異丙醇，充分混勻，室溫放置10min。4℃或室溫，11000rpm離心10min，小心棄上清，倒置控干管內(nèi)液體，一般倒置10～15min即可。此時(shí)管壁會(huì)出現(xiàn)白色沉淀物即質(zhì)粒。

5、加入3mlddh2o或te溶液（ph8.0）溶解沉淀，并加入30μl10mg/mlrnasea，37℃水浴1h除去rna。加入2倍體積（8ml）無水乙醇和1/10體積（300μl）3mnaac溶液，充分混勻，冰中或-20℃冰箱放置20min。4℃，11000rpm離心10min，小心將上清吸出（勿倒），并將離心管倒置于濾紙上控干（非常重要）。加入100μlddh2o或te溶液（ph8.0），充分洗脫質(zhì)粒沉淀。利用分光光度計(jì)測(cè)量所得質(zhì)粒的濃度并記錄，分裝封口后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

三、dhfr-ts*抗性marker的擴(kuò)增：

1、利用引物dhfr-fv：aagcttcgccaggctgtaaa和dhfr-rv：ggaattcatcctgcaagtgcatag擴(kuò)增dhfr-ts*抗性基因。反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，55℃復(fù)性30sec；72℃延伸3min30sec；30個(gè)循環(huán)。

2、按照omega普通瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒的使用說明回收目的片段。利用分光光度計(jì)測(cè)量所得pcr產(chǎn)物的濃度并記錄，分裝封口后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

四、弓形蟲電擊轉(zhuǎn)染及獲取陽性單克?。?/p>

1、將型蟲株rh接種于75thff細(xì)胞中，當(dāng)蟲子裂解細(xì)胞75%時(shí)，用細(xì)胞刮子將蟲體刮起，過22g的針頭3-5次釋放細(xì)胞內(nèi)的蟲子。

2、利用3.0μm的濾器過濾上述蟲子去除細(xì)胞碎片，然后400g×10min離心取沉淀，然后利用hbssbuffer重懸，再400g×10min離心取沉淀。然后用cytomixbuffer（120mmkcl,0.15mmcacl2,10mmk2hpo4/kh2po4,25mmhepes,2mmedta,5mmmgcl2,ph7.6）重懸蟲子使其濃度達(dá)到4×10⁷個(gè)/ml。

3、轉(zhuǎn)染體系如表1所示，將轉(zhuǎn)染體系轉(zhuǎn)移到4mm電擊杯利用btxecm-830電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)程序如下（電壓1700v,電擊時(shí)間176μs電擊兩次，中間間隔100ms），然后將電轉(zhuǎn)的蟲子轉(zhuǎn)移到25thff細(xì)胞中。

表1

4、在37℃,5%co2溫箱培養(yǎng)48h后，加入3μm的乙胺嘧啶，大約經(jīng)過7-10天發(fā)現(xiàn)耐藥性蟲子。

5、利用有限稀釋法進(jìn)行耐藥蟲株的篩選，將耐藥性的蟲子按照5-10個(gè)每孔接種于96孔板，在37℃,5%co2溫箱培養(yǎng)7-10天，在顯微鏡觀察蟲斑，選取每孔僅有1個(gè)蟲斑的接種到24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)。

6、重復(fù)第5步驟的有限稀釋法，對(duì)蟲株進(jìn)行單克隆化，得到純度為100%的遺傳背景相同的蟲株若干株。

7、將上述純化的蟲株接種到24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)的蟲子吸取一部分到1.5ml的離心管中，提取該蟲株的基因組，根據(jù)弓形蟲rh株dna提取的具體方法，具體步驟參照promega公司試劑盒wizard?svgenomicdnapurificationsystem使用說明進(jìn)行。

8、pcr鑒定陽性蟲株。將缺失株及野生蟲株的基因組同時(shí)采用用下列引物：ko-gra17-f:tctacaagcacgcagaaagga和r:cgaaccggaagttaccacgac進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，55℃復(fù)性30sec；72℃延伸1min；30個(gè)循環(huán)。通過電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測(cè)突變株是否構(gòu)建成功，如圖1所示：野生株能夠擴(kuò)增出條帶，缺失株沒有條帶。

9、將對(duì)應(yīng)的陽性克隆從24孔中接種到25thff中擴(kuò)大培養(yǎng)，并凍存到液氮中長期保存。

五、毒力檢測(cè)。

因?yàn)楸救笔е晔且詉型強(qiáng)毒株rh株為母體進(jìn)行改造的，該蟲株不形成包囊，所以沒有進(jìn)行包囊的檢測(cè)，重點(diǎn)放在其毒力的減弱的研究。

對(duì)缺失蟲株lz△gra17進(jìn)行毒力檢測(cè)，分別采用野生蟲株、缺失蟲株；采用10、10³、10⁴這三種不同的劑量對(duì)babl/c小鼠進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，每組20只小鼠，觀察小鼠的發(fā)病及死亡情況。結(jié)果表明在10、10³、10⁴這三個(gè)劑量下缺失株均不能造成小鼠的死亡。而野生株在10、10³、10⁴這三個(gè)劑量下均造成小鼠死亡，即使再最小劑量下，20只小鼠也在7-8天全部死亡。足以說明缺失gra17可以造成i型蟲株毒力大大減弱。因此該缺失株可以成為一株針對(duì)i型弓形蟲的減毒活疫苗的候選蟲株。

最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所

<120>一株gra17基因缺失的弓形蟲弱毒蟲突變株及其制備方法

<210>1

<211>1325

<212>dna

<213>缺失的gra17基因核苷酸序列

<400>1

atgaaatcgggcagttgccctttcacgttttcgcccactctttctcaccctcttgaaata60

gcctggcgagctcgtccacttcagtggccggaaatcgaacgccagcccgaaccagctgct120

ccctgtggcgcgttgtatcccgcatctcgcgttctgtccttttcacccacgatgcgagcg180

attcgttccgttgtcggccttcccgttatgggggctgcagttttcttgggacttctcagc240

ggagaactgcccaactcctccgtgttgcccgtccccgaggtggcgagcacccccttcctc300

ctcagcgtcgccgctgacggcgatggcggcaaaaactatgcggaagtcgccaaggtggaa360

gcgttgacaaatatgatcagcactcccattgagctcttcgtgaaggacgtctggcaacag420

ctgttccataaatctggcaagcccgtgtgggaaaacatgttgttcaaggtaagtgcttga480

ccgagactcggtaggagtgaccgagtgcgtggcgcgacgctgaaaaacagtttaggtgat540

acgcatctgggatgcagcagagaagaaaccgttgggaagctgtcgtcggggagcagacac600

tgtacaggttcaaggaaacgcaactcatgtagtcgtatcgtgttgcggcatacgggcgca660

cagccaacattgcgtgtaaatctcaaaggacgcgtcttcagacgcaggggttctcatgcc720

ttttatgaacctctgcttacattttgcttacatttctgcaggcgtttgataccaatccag780

ggacgaaccattcgtttgttccggggagtgttccgttttcgcgcgcgtgcgtggtatttt840

cgtcgttgtatcatcctgggttttgtttctgcgcgtcgccttttctgcagtttggcagta900

tgatccgacaccgcgccgcacacaaggccactctcgtgatcatgtgggaactgaggcact960

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序列表

<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所

<120>一株gra17基因缺失的弓形蟲弱毒蟲突變株及其制備方法

<210>1

<211>1325

<212>dna

<213>缺失的gra17基因核苷酸序列

<400>1

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