本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種融合蛋白、制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：卵巢癌、子宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌是三種惡性腫瘤嚴(yán)重威脅女性生命健康，五年存活率不足50％，子宮頸癌發(fā)病率居女性生殖系統(tǒng)腫瘤之首，我國(guó)新發(fā)病例每年高達(dá)15萬(wàn)之多，而且有明顯的年輕化趨勢(shì)，國(guó)家已經(jīng)廣泛開展“兩癌篩查”，但是仍然未能改善腫瘤患者的預(yù)后，女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤是我國(guó)中長(zhǎng)期科技發(fā)展綱要計(jì)劃攻關(guān)的惡性腫瘤之一。女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的傳統(tǒng)治療為手術(shù)、放療、化療，但是僅僅有一定療效，對(duì)于晚期或復(fù)發(fā)患者均不能奏效，目前急需尋找新的治療方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：鑒于現(xiàn)有技術(shù)所存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種融合蛋白、制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下：一種融合蛋白，所述蛋白包括CLIC1蛋白、連接肽和Hsp27蛋白，CLIC1蛋白通過(guò)連接肽與Hsp27蛋白連接。采用上述方案的有益效果是:發(fā)明人通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)，免疫組化，RT-PCR，westernblot等研究方法，發(fā)現(xiàn)CLIC1(細(xì)胞內(nèi)氯離子通道蛋白1，氯離子通道蛋白是一組調(diào)節(jié)基本細(xì)胞功能的蛋白，包括細(xì)胞膜電位穩(wěn)定、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、維持胞內(nèi)pH，調(diào)節(jié)細(xì)胞容積)在卵巢癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，CLIC1被發(fā)現(xiàn)和細(xì)胞周期相關(guān)，在細(xì)胞G2/M期表達(dá)于細(xì)胞膜上,應(yīng)用CLIC1特異性拮抗劑阻斷該離子通道后，細(xì)胞的有絲分裂受到影響，細(xì)胞周期停滯于G2/M期，推測(cè)CLIC1在卵巢細(xì)胞周期中參與了調(diào)節(jié)這一過(guò)程，發(fā)明人進(jìn)一步通過(guò)建立CLIC1基因敲降和過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系，在體外試驗(yàn)中證實(shí)CLIC1在SKOV3和A2780卵巢癌細(xì)胞系中呈現(xiàn)高表達(dá)，抑制CLIC1的表達(dá)可以減少卵巢癌細(xì)胞系的增殖及浸潤(rùn)，提示CLIC1可能是參與卵巢癌發(fā)生及淋巴道轉(zhuǎn)移的重要基因之一，在此前國(guó)內(nèi)外均尚未見相關(guān)報(bào)道。進(jìn)一步，發(fā)明人將CLIC1基因和人HSP27基因(熱休克蛋白27，屬于低分子量熱休克蛋白家族的成員，HSP27是一個(gè)涉及到藥物抗性、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡、腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移等功能的重要蛋白，HSP27介導(dǎo)的這些功能可能與其對(duì)其它蛋白質(zhì)的影響有關(guān))通過(guò)一段柔性連接肽進(jìn)行人工融合，合成一種CLIC1-HSP27的融合基因，采用基因聯(lián)合優(yōu)化技術(shù)在原核表達(dá)系統(tǒng)中成功實(shí)現(xiàn)了該融合基因的高表達(dá)，通過(guò)質(zhì)譜鑒定和親和層析純化獲得了純度大于90％的CLIC1-HSP27融合蛋白，該融合蛋白標(biāo)準(zhǔn)品成功解決現(xiàn)有腫瘤細(xì)胞裂解物成分復(fù)雜，無(wú)法保證所誘發(fā)抗腫瘤免疫的強(qiáng)度和特異性的缺點(diǎn)，并且成分單一，結(jié)構(gòu)明確，降低成本，方便于工業(yè)化生產(chǎn)，為以后的生物學(xué)研究打下基礎(chǔ)，非常具有應(yīng)用前景。進(jìn)一步，所述融合蛋白包括SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。采用上述方案的有益效果是：有現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，摸索出基因聯(lián)合優(yōu)化技術(shù)，從密碼子優(yōu)化，mRNA結(jié)構(gòu)優(yōu)化，基因表達(dá)優(yōu)化三方面聯(lián)合入手，通過(guò)對(duì)稀有密碼子、mRNA結(jié)構(gòu)、表達(dá)菌株的篩選、純化的溫度、誘導(dǎo)度、培養(yǎng)基OD值探索，提高外源基因的表達(dá)效率、可溶性和穩(wěn)定性，提升表達(dá)產(chǎn)量和準(zhǔn)確性，后期質(zhì)譜測(cè)序與原始預(yù)測(cè)序列在存在誤差的情況下符合率接近100％，傳統(tǒng)技術(shù)一般為60％-80％左右。進(jìn)一步，所述連接肽為柔性連接肽。采用上述方案的有益效果是：采用柔性的連接肽有利于：增加產(chǎn)物的穩(wěn)定性，選甘氨酸作為融合蛋白linker是因?yàn)楦拾彼崾撬邪被嶂凶钚∏覜](méi)有手性碳，所以柔性最好，放在融合蛋白之間不會(huì)影響兩邊蛋白的構(gòu)象和功能發(fā)揮，采用的linker不能太大，否則一是對(duì)結(jié)構(gòu)有影響，二是增加了融合蛋白的抗原性。進(jìn)一步，所述融合蛋白還包括基因聯(lián)合優(yōu)化技術(shù)。采用上述方案的有益效果是：一方面確保目標(biāo)產(chǎn)物序列的準(zhǔn)確性；另一方面提高融合基因表達(dá)產(chǎn)物的可溶性和穩(wěn)定性，提高目標(biāo)蛋白產(chǎn)量。基因聯(lián)合優(yōu)化技術(shù)，本例從密碼子優(yōu)化，mRNA結(jié)構(gòu)優(yōu)化，基因表達(dá)優(yōu)化三方面聯(lián)合入手，提升外源基因的表達(dá)效率和穩(wěn)定性。以下是該優(yōu)化過(guò)程所涉及的關(guān)鍵步驟：1.密碼子優(yōu)化是基因表達(dá)優(yōu)化技術(shù)的關(guān)鍵步驟之一，主要涉及mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、稀有密碼子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)等關(guān)鍵因素，基因能否順利表達(dá)與稀有密碼子含量、mRNA結(jié)構(gòu)是否阻礙翻譯有很大關(guān)系。許多motif在基因表達(dá)過(guò)程中承擔(dān)著重要的角色，通過(guò)仔細(xì)研究轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程，不斷閱讀基礎(chǔ)資料和研究進(jìn)展，將如下功能性motif納入到基因聯(lián)合優(yōu)化技術(shù)中：TATA框：是構(gòu)成真核生物的啟動(dòng)子元件之一，位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-30bp處，它可以保證轉(zhuǎn)錄的正確定位。SD序列:作為原核表達(dá)的核糖體綁定位點(diǎn)，是翻譯必不可少的信號(hào)。Kozak序列：真核生物中符合Kozak規(guī)則的基因，其轉(zhuǎn)錄及翻譯效率較好。Chi序列：在原核生物中能夠增加自然重組的幾率，可能會(huì)影響人工重組蛋白的表達(dá)。隱蔽剪切位點(diǎn)：真核生物中存在大量的隱蔽剪切位點(diǎn)，一旦被激活，會(huì)造成mRNA的剪接偏離原始預(yù)期。重復(fù)序列和GC含量：重復(fù)序列過(guò)多，會(huì)增加基因合成的難度。反向互補(bǔ)序列也對(duì)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)有重要影響。相對(duì)于AT配對(duì)需要2個(gè)氫鍵，GC配對(duì)是3個(gè)氫鍵，GC含量直接影響著PCR退火溫度。在啟動(dòng)子等保守區(qū)域GC含量相對(duì)較高。GC含量也影響著mRNA熱力學(xué)穩(wěn)定性及mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu).本例對(duì)融合基因進(jìn)行了改造,選用大腸桿菌偏愛的密碼子,增加了GC含量,去除原序列下影響mRNA穩(wěn)定的元件。2.mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)優(yōu)化：mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)是影響翻譯過(guò)程的重要因素，復(fù)雜穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)阻礙翻譯過(guò)程的順利進(jìn)行，特別是核糖體綁定位點(diǎn)(RBS)附近的二級(jí)結(jié)構(gòu)。mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，需要考慮堿基配對(duì)、自由能等多種因素，本例通過(guò)識(shí)別發(fā)卡結(jié)構(gòu)區(qū)并進(jìn)行有效規(guī)避。密碼子偏好性：不同物種的種屬之間，對(duì)同義密碼子的使用頻率是不同的。在外源基因的同義密碼子使用頻率與表達(dá)宿主相匹配的情況下，外源基因的表達(dá)水平會(huì)顯著提高。限制性酶切位點(diǎn):限制性酶切位點(diǎn)需要根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行排除，以免與需要用到的酶切位點(diǎn)產(chǎn)生沖突，影響重組基因的操作。3.表達(dá)條件優(yōu)化:基因表達(dá)優(yōu)化的目的在于通過(guò)重組基因技術(shù)表達(dá)出盡可能接近天然構(gòu)象的重組蛋白質(zhì)。重組蛋白表達(dá)的關(guān)鍵要素包括基因、載體、表達(dá)宿主、表達(dá)培養(yǎng)條件。這些要素之間是相互影響的，所以為了更好地達(dá)到優(yōu)化的目的，需要將目標(biāo)放到其所在上下文中進(jìn)行優(yōu)化。表達(dá)條件的優(yōu)化對(duì)目標(biāo)蛋白的表達(dá)量及表達(dá)質(zhì)量同樣也起到至關(guān)重要的作用，包括以下幾點(diǎn)：親和標(biāo)簽的選擇:親和標(biāo)簽已經(jīng)成為重組蛋白表達(dá)及純化的一個(gè)重要且有效的工具。它們不僅有利于融合蛋白的檢測(cè)與純化，而且可能對(duì)目標(biāo)蛋白的理化性質(zhì)產(chǎn)生有利的影響，可以提高重組蛋白的表達(dá)水平，增強(qiáng)重組蛋白的可溶性，促進(jìn)重組蛋白的正確折疊。像GST、MBP、Ub、Sumo可以明顯提高重組蛋白的表達(dá)水平。在融合親和標(biāo)簽進(jìn)行原核表達(dá)的過(guò)程中，某些高度可溶的蛋白標(biāo)簽具有提高融合蛋白可溶性的能力，如GST、MBP、Sumo、NusA等，本例研究和使用最清楚的增強(qiáng)融合蛋白可溶性的標(biāo)簽有Mbp和NusA，促進(jìn)蛋白正確折疊的標(biāo)簽有MBP、NusA和Trx。親和標(biāo)簽還可能抑制融合蛋白的水解、保護(hù)融合蛋白的抗原性。大腸桿菌中表達(dá)條件的優(yōu)化：為了提高大腸桿菌的重組蛋白表達(dá)水平，抑制包涵體的生成可以選用特定表達(dá)菌株、與分子伴侶共表達(dá)、降低目標(biāo)蛋白表達(dá)溫度、調(diào)整誘導(dǎo)溫度等手段優(yōu)化蛋白表達(dá)。本發(fā)明采用0.5mMIPTG(異丙基硫代半乳糖苷)，15℃誘導(dǎo)16h達(dá)到最佳誘導(dǎo)條件。本發(fā)明提供一種編碼上述融合蛋白的核苷酸序列。本發(fā)明提供一種包括上述核苷酸序列的載體、重組細(xì)胞或重組菌。本發(fā)明提供一種融合蛋白的制備方法，包括以下步驟：構(gòu)建包括SEQIDNO.2核苷酸序列的表達(dá)系統(tǒng)，利用該表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)融合蛋白。所述的表達(dá)系統(tǒng)既可以是原核表達(dá)系統(tǒng)，也可以是真核表達(dá)系統(tǒng)。例如：大腸桿菌體系、昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系等等。進(jìn)一步，還包括將表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行親和層析純化，獲得純化后的融合蛋白。采用上述方案的有益效果是：進(jìn)一步提高融合蛋白的純度。一種上述的融合蛋白在腫瘤防治藥物制備中的應(yīng)用。尤其可以用于人卵巢癌防治藥物的制備。一種疫苗，包括上述的融合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體。所述的藥學(xué)上可接受的載體，例如：可以為聚乳酸-羥基乙酸微球等等。采用上述方案的有益效果是：使所生產(chǎn)的腫瘤疫苗具有低成本，結(jié)構(gòu)單一準(zhǔn)確，特異性好、抗原高效等優(yōu)點(diǎn)。附圖說(shuō)明圖1為融合蛋白在BL21(DE3)中的表達(dá)結(jié)果，箭頭指目標(biāo)蛋白，LaneM為SDS-PAGE蛋白marker；Lane0為對(duì)照，對(duì)照為未加誘導(dǎo)劑；Lane1為15℃誘導(dǎo)過(guò)夜的結(jié)果；Lane2為28℃誘導(dǎo)過(guò)夜的結(jié)果；Lane3為37℃誘導(dǎo)過(guò)夜的結(jié)果。圖2為通過(guò)SDA-PAGE分析融合蛋白上清純化的結(jié)果；LaneM為SDS-PAGE蛋白marker；Lane1為全菌破菌離心后上清；Lane2為上清同Ni-IDA孵育后流出液；Lane3-4為50nm濃度的咪唑的洗脫組分，Lane5-7為100nm濃度咪唑的洗脫組分，Lane8-13為300nm濃度咪唑的洗脫組分。圖3為分別利用SDS-PAGE和WesternBlot對(duì)融合蛋白質(zhì)檢結(jié)果，Lane1為BSA(1.0ug)；Lane2為融合蛋白(1.0ug)；LaneM1為SDS-PAGE蛋白marker；LaneM2為WesternBlotmarker。圖4為融合蛋白質(zhì)譜鑒定的結(jié)果。圖5為pET30aCLIC1-HSP27的質(zhì)粒圖譜。圖6為實(shí)施例3的檢測(cè)結(jié)果。圖7為CLIC1-HSP27激活的T細(xì)胞對(duì)SKOV3(24、48h)細(xì)胞系遷移能力的影響的結(jié)果。具體實(shí)施方式以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下面通過(guò)一些具體的實(shí)施例來(lái)進(jìn)行進(jìn)行介紹。各實(shí)施中采用的實(shí)驗(yàn)材料及儀器介紹如下：質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA回收試劑盒(天根生化公司)，T4DNA連接酶、TaqDNA聚合酶(寶生物公司)，酵母提取物、蛋白胨(OXOID)，電泳相關(guān)試劑(Tris，Acr，Bis，AP,TEMED等)(Sigma)，0.22um濾器及透析袋(Millipore)，IPTG及抗生素(Amersco)，Ni-IDA樹脂，Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天公司)，DNA合成儀(MerMade-192),PCR儀(ABI)，電泳儀(Bio-Rad),超聲細(xì)胞破碎儀(寧波新芝生物)，高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀),四維旋轉(zhuǎn)混合儀(海門其林貝爾)ABI4800MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀。實(shí)施例1構(gòu)建并表達(dá)純化融合蛋白1、對(duì)CLIC1和HSP27進(jìn)行密碼子優(yōu)化和基因合成。設(shè)計(jì)目標(biāo)核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，該核苷酸序列可以編碼SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。2.委托南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院采用全基因合成的方法獲得SEQIDNO.2所示的基因片段，命名為CLIC1-HSP27基因。3、利用限制性內(nèi)切酶NdeI和HindIII分別酶切CLIC1-HSP27基因和表達(dá)載體pET30a，將CLIC1-HSP27基因插入到表達(dá)載體pET30a中，獲得重組質(zhì)粒，命名為pET30aCLIC1-HSP27，pET30aCLIC1-HSP27的質(zhì)粒圖譜如圖5所示。質(zhì)粒構(gòu)建中，基因和載體的比例及一些相關(guān)條件如下(20ul反應(yīng)體系)：COMPONENT20μlREACTION10XT4DNALigaseBuffer2ulVectorDNA50ngInsertDNA50ngNuclease-freewaterTo20ulT4DNALigase1ul具體操作為：步驟a.用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。步驟b.16℃孵育連接過(guò)夜。4、將重組質(zhì)粒pET30aCLIC1-HSP27轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，然后將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞均勻涂布到LB平板上(含有50ug/mL的硫酸卡那霉素)，之后倒置于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜。從轉(zhuǎn)化的平板中挑選單克隆，接種到4mL的LB培養(yǎng)基中(含50ug/mL的硫酸卡那霉素)，待培養(yǎng)至OD600為0.5-0.8，向試管培養(yǎng)液中加入終濃度0.5mM異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，之后分別置于15℃、28℃、37℃誘導(dǎo)表達(dá)。取誘導(dǎo)后的培養(yǎng)液12000rpm離心5min，去除上清液，加入PBS液重懸沉淀，最后加入SDS-PAGE上樣緩沖液于100℃下加熱樣品10min，然后離心取上清電泳。電泳前10min時(shí)，100V穩(wěn)壓電泳，待溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后200V穩(wěn)壓電泳至溴酚藍(lán)帶遷移至離凝膠底部1cm,取出凝膠用考馬斯亮蘭染色液染色,隨后轉(zhuǎn)入脫色液中,脫色至背景清晰。結(jié)果見圖1。5、CLIC1-HSP27蛋白放大培養(yǎng),培養(yǎng)3L的表達(dá)菌，生長(zhǎng)至OD600＝0.8時(shí)，加終濃度0.5mMIPTG，15℃誘導(dǎo)16h后收集菌體。上清中親和層析純化CLIC1-HSP27蛋白(整個(gè)純化過(guò)程在低溫下操作)全菌采用50mMTris(pH8.0),150mMNaCl含1％TritonX-100,1ug/mLPepstatinA,1ug/mLLeupeptin超聲裂解，同時(shí)以50mMTris(pH8.0),150mMNaCl緩沖液平衡Ni-IDA親和層析柱，之后用不同濃度(Lane3-4為50nm濃度的咪唑的洗脫組分，Lane5-7為100nm濃度咪唑的洗脫組分，Lane8-13為300nm濃度咪唑的洗脫組分)咪唑的平衡緩沖液洗脫目標(biāo)蛋白，并收集每個(gè)洗脫組分進(jìn)行SDS-PAGE分析檢測(cè)。分析結(jié)果見圖2。6經(jīng)Ni-IDA親和層析純化，目標(biāo)蛋白CLIC1-HSP27主要存在于洗脫組分Lane8-1中，收集上述目標(biāo)蛋白將其透析到1XPBS,10％Glycerol,pH7.4中,透析結(jié)束后用0.22um膜過(guò)濾，并分裝凍于-80℃。7、CLIC1-HSP27蛋白質(zhì)檢見圖3。利用SDS-PAGE對(duì)融合蛋白質(zhì)檢的方法為：SDS-PAGE純度評(píng)估來(lái)源于R250染色的SDS-PAGE膠。利用WesternBlot對(duì)融合蛋白質(zhì)檢，方法為：用His單抗和His標(biāo)簽結(jié)合，二抗偶聯(lián)HPR再和His單抗結(jié)合最后顯影檢測(cè)目標(biāo)蛋白。根據(jù)圖3的結(jié)果可以說(shuō)明融合基因成功表達(dá)，分子量在預(yù)測(cè)范圍之內(nèi)。8、融合蛋白質(zhì)譜鑒定的結(jié)果見圖4。質(zhì)譜鑒定的條件為：使用儀器：ABI4800MALDI-TOF/TOF，采用碰撞誘導(dǎo)裂解(CID)二級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)，鑒定覆蓋的肽段、對(duì)蛋白含量和置信度的綜合打分。根據(jù)圖4的結(jié)果可以看出，目標(biāo)蛋白原始序列覆蓋率95.17％，由于本身存在肽段電離的誤差，結(jié)果說(shuō)明表達(dá)產(chǎn)物的序列準(zhǔn)確可靠。實(shí)施例2通過(guò)白細(xì)胞分離標(biāo)準(zhǔn)程序獲得周邊血單核細(xì)胞，體外與該重組蛋白CLIC1-HSP27共培養(yǎng)，獲得被該重組蛋白CLIC1-HSP27活化的抗原提呈細(xì)胞(APCs)及殺傷淋巴細(xì)胞，抗原呈遞細(xì)胞則將PAP蛋白消化為多肽而呈現(xiàn)于其表面，可被免疫系統(tǒng)T細(xì)胞識(shí)別，識(shí)別該抗原后的T細(xì)胞能找到并殺滅體內(nèi)表達(dá)CLIC1抗原的癌細(xì)胞。實(shí)施例3Elisa法檢測(cè)CLIC1-HSP27負(fù)載樹突細(xì)胞激活的T淋巴細(xì)胞上清中的TGF-β含量(TGF-β是T細(xì)胞活化時(shí)分泌的一種細(xì)胞因子)，檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，血樣A、血樣B和血樣C分別來(lái)自不同人的外周血。從圖6中可以看出，CLIC1-HSP27和對(duì)照組(空白對(duì)照組)相比，，CLIC1-HSP27刺激組的TGF-β的含量顯著上升(pg/ml)。實(shí)施例4CLIC1-HSP27激活的T細(xì)胞對(duì)SKOV3細(xì)胞的遷移能力的影響劃痕試驗(yàn)檢測(cè)試驗(yàn)組(空白T細(xì)胞)和對(duì)照組(50μg/mlCLIC1-HSP27激活T細(xì)胞)24和48小時(shí)對(duì)SKOV3細(xì)胞的遷移能力的影響。如圖7所示，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組24和48小時(shí)細(xì)胞遷移的數(shù)量和距離均下降。本例使用獨(dú)創(chuàng)的基因聯(lián)合優(yōu)化技術(shù)，從密碼子優(yōu)化，mRNA結(jié)構(gòu)優(yōu)化，基因表達(dá)優(yōu)化三方面聯(lián)合入手，通過(guò)對(duì)稀有密碼子，mRNA結(jié)構(gòu)，表達(dá)菌株的篩選，純化的溫度、誘導(dǎo)度、培養(yǎng)基OD值探索，提高外源基因的表達(dá)效率、可溶性和穩(wěn)定性，提升表達(dá)產(chǎn)量和準(zhǔn)確性。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。<110>張震宇<120>一種融合蛋白、制備方法及其應(yīng)用<160>2<210>1<211>414<212>PRT<213>人工合成<220><221>CLIC1-HSP27蛋白<400>1MHHHHHHTERRVPFSLLRGPSWDPFRDWYPHSRLFDQAFGLPRLPEEWSQ111213141WLGGSSWPGYVRPLPPAAIESPAVAAPAYSRALSRQLSSGVSEIRHTADR5161718191WRVSLDVNHFAPDELTVKTKDGVVEITGKHEERQDEHGYISRCFTRKYTL101111121131141PPGVDPTQVSSSLSPEGTLTVEAPMPKLATQSNEITIPVTFESRAQLGGP151161171181191EAAKSDETAAKGGGSGGGSDTKRRTETVQKLCPGGQLPFLLYGTEVHTDT201211221231241NKIEEFLEAVLCPPRYPKLAALNPESNTAGLDIFAKFSAYIKNSNPALND251261271281291NLEKGLLKALKVLDNYLTSPLPEEVDETSAEDEGVSQRKFLDGNELTLAD301311321331341CNLLPKLHIVQVVCKKYRGFTIPEAFRGVHRYLSNAYAREEFASTCPDDE351361371381391EIELAYEQVAKALK401411<210>2<211>1031<212>DNA<213>人工合成<220><223>CLIC1-HSP27基因<400>2atgcaccaccatcatcatcacaccgagcggagagtgcccttcagcctgctgaggggccct60tcttgggaccccttcagagattggtacccccacagcaggctgttcgatcaggcctttggc120ctgcctagactgccagaagagtggagtcagtggctgggaggaagcagttggccaggatac180gtcagacctctgcctccagcagccattgaatctccagccgtggcagctccagcctatagc240agagccctgagcagacagctgtctagcggcgtgtccgagatcagacacaccgcagatcgc300tggagagtgtctctggacgtgaaccacttcgccccagacgagctgacagtgaagaccaag360gacggcgtggtggagatcaccggaaagcacgaggagaggcaggacgaacacggatacatc420agccgctgcttcacccggaagtacaccctgcctccaggagtggatcctacccaggtgtcc480tctagcctgagcccagaaggaaccctgaccgtggaagcccctatgcctaagctggccacc540cagagcaacgagatcaccatcccagtgaccttcgagagcagagctcagctgggaggacca600gaagcagccaaaagcgacgagacagccgctaaaggaggaggaagcggaggaggcagcgat660accaagagaaggaccgagaccgtgcagaaactctgtccaggcggtcagctccctttcctg720ctgtacggaaccgaggtgcacaccgacaccaacaagatcgaggagttcctggaggccgtg780ctgtgtcctcctaggtatcctaagctggccgccctgaacccagagtctaacacagccggc840ctggacatcttcgccaagttcagcgcctacatcaagaacagcaaccccgccctgaacgac900aacctggagaagggcctgctgaaagccctgaaggtgctggacaactacctgaccagccct960ctgccagaggaagtggacgaaaccagcgccgaagacgaaggagtgtctcagcggaagttc1020ctggacggaaa1031當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3