煙草原生質(zhì)體的高效分離、轉(zhuǎn)化和再生體系的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種煙草原生質(zhì)體的高效分離、轉(zhuǎn)化和再 生體系。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙草（Nicotiana tabacum L.)是我國重要經(jīng)濟(jì)作物。2014年煙草行業(yè)工商稅利 達(dá)到10517. 6億元，占全部稅利的10%以上。近年來大眾對(duì)煙葉品質(zhì)及安全性的需求日益 提高，因而加快品種選育是滿足這一需求的重要途徑之一。同時(shí)，煙草是植物轉(zhuǎn)基因的優(yōu)良 受體和細(xì)胞遺傳學(xué)的模式植物，常被用來開展外源基因的表達(dá)和功能驗(yàn)證。另外，在生物工 程領(lǐng)域常被用作植物生物反應(yīng)器，有效表達(dá)一些有實(shí)用價(jià)值的蛋白。
[0003] 植物原生質(zhì)體是指脫去全部細(xì)胞壁的，由質(zhì)膜包被的具有生命活力的裸露細(xì)胞。 它具有細(xì)胞生命特征和全能型，是細(xì)胞無性系變異和突變體篩選的重要來源；是細(xì)胞融合 工作的基礎(chǔ)；是細(xì)胞功能學(xué)研宄的重要手段；是植物遺傳工程的理想受體和遺傳改良的理 想材料。1971年Nagata和Takebe首次獲得了煙草葉肉原生質(zhì)體離體培養(yǎng)再生植株。隨后 Firoozabady和我國學(xué)者徐杏陽、黃文川也利用栽培煙草的葉肉細(xì)胞獲得了再生植株。但原 生質(zhì)體分離和轉(zhuǎn)化仍存在步驟繁雜、操作不規(guī)范、污染率高、轉(zhuǎn)化效率低且不穩(wěn)定等需要改 進(jìn)的地方。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中煙草的原生質(zhì)體的分離和轉(zhuǎn)化存在步驟繁雜、操作不規(guī)范、污染 率高、轉(zhuǎn)化效率低的缺陷，本發(fā)明提供一種煙草原生質(zhì)體的分離、轉(zhuǎn)化和再生體系。本發(fā) 明的第一個(gè)目的是提供一種煙草原生質(zhì)體分離、轉(zhuǎn)化和再生過程中所需的試劑組合，包括 1/2MS培養(yǎng)基、A培養(yǎng)基、B培養(yǎng)基、C培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基、MS再生培養(yǎng)基、W5洗液、轉(zhuǎn)化液、 含有聚乙二醇的溶液、酶解液、W5洗液和C:B培養(yǎng)基；
[0005] 所述1/2MS培養(yǎng)基、A培養(yǎng)基、B培養(yǎng)基、C培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基和MS再生培養(yǎng)基的 物質(zhì)組成包括如下試劑：
[0006]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于煙草原生質(zhì)體的高效分離、轉(zhuǎn)化和再生過程中的試劑組合，其特征在于，包 括1/2MS培養(yǎng)基、A培養(yǎng)基、B培養(yǎng)基、C培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基、MS再生培養(yǎng)基、W5洗液、轉(zhuǎn)化 液、含有聚己二醇的溶液、酶解液、W5洗液和C:B培養(yǎng)基； 所述1/2MS培養(yǎng)基、A培養(yǎng)基、B培養(yǎng)基、C培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基和MS再生培養(yǎng)基的物質(zhì) 組成包括如下試劑：
其中所述MS微量lOOX的物質(zhì)組成如下;_
所述鐵鹽1000X的物質(zhì)組成如下；
所述W5洗液的組成包括氯化鋼8. 9g/L、氯化巧18. 4g/L、氯化鐘0. 37g/l，葡萄糖 0. 9g/L; 所述轉(zhuǎn)化液的組成包括甘露醇91g/l，氯化儀14. 25g/l，己橫酸Ig/L; 所述含有聚己二醇溶液的組成包括聚己二醇400g/l，甘露醇72. 9g/L，硝酸巧16. 4g/L。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑組合，其特征在于，所述酶解液的組成包括在所述C培養(yǎng) 基中添加終濃度為120g/L的纖維素酶R10和60g/L的離析酶R10。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑組合，其特征在于，所述EvansBlue染液的組成包 括在所述W5培養(yǎng)基中添加2. 5g/L的EvansBlue粉末。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的試劑組合，其特征在于，所述C:B培養(yǎng)基的組成包括在所 述C培養(yǎng)基和B培養(yǎng)基按1 ;1組成的混合液中添加6g/L的海斑瓊脂糖的。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的試劑組合，其特征在于，所述W5洗液的抑為5. 8~6. 0 ; 所述轉(zhuǎn)化液的抑為5. 6 ;所述含有聚己二醇的溶液的抑為8. 0,所述酶解液的抑為5. 6。
6. -種利用權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的試劑組合對(duì)煙草原生質(zhì)體進(jìn)行分離、轉(zhuǎn)化和再 生的方法。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，包括如下步驟： 1) 無菌苗的培養(yǎng) 將表面消毒后的煙草種子播種于1/2MS培養(yǎng)基中，待苗生長(zhǎng)至五葉期時(shí)，轉(zhuǎn)移至MS培 養(yǎng)基中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)6周，得長(zhǎng)出幼嫩葉片的煙草無菌苗； 2) 原生質(zhì)體的分離和純化 取所述煙草無菌苗的幼嫩葉片，切成小塊浸于所述酶解液中，將酶解體系密封、避光， 在24°C~26°C溫度下靜置9~1化； 對(duì)酶解后的混合物過濾，收集濾液，用所述C培養(yǎng)基對(duì)濾渣進(jìn)行再次溶解、過濾，收集 濾液，重復(fù)此項(xiàng)操作直至不再有原生質(zhì)體析出，將所得濾液混合，得混合濾液； 在所述混合濾液中加入庶糖溶液，離屯、，吸取原生質(zhì)體層； 在所述原生質(zhì)體層中加入所述W5洗液，混合均勻后離屯、，離屯、后的沉淀物即為原生質(zhì) 體； 3) 原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化 將質(zhì)粒DNA消毒后溶解于超純無菌水中，形成質(zhì)粒DNA體系，將所述原生質(zhì)體溶解于所 述轉(zhuǎn)化液中，形成原生質(zhì)體懸浮液1，將二者混合，并在混合后的體系中加入所述含有聚己 二醇的溶液，室溫下靜置10~20min; 在所述混合后的體系中加入所述W5溶液，混勻后離屯、，沉淀物即為轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì) 體； 4)原生質(zhì)體的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化系的篩選及再生 將所述轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體溶于所述C培養(yǎng)基，制成原生質(zhì)體懸浮液2,與所述C:B培養(yǎng) 基混合，然后對(duì)原生質(zhì)體細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)至出現(xiàn)多次細(xì)胞分裂； 將所述細(xì)胞分裂后的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)入添加了抗生素的所述A培養(yǎng)基中，出現(xiàn)愈傷組織 5~6周后，轉(zhuǎn)移到所述MS再生培養(yǎng)基上，所述愈傷組織生長(zhǎng)至8~10mm時(shí)，再次將其轉(zhuǎn) 移到所述MS再生培養(yǎng)基上，長(zhǎng)出叢生芽，至所述叢生芽生長(zhǎng)1~2周后，將其切下再次置于 MS再生培養(yǎng)基上，待幼芽長(zhǎng)至3~4cm時(shí)，其轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)生根，移栽進(jìn)行壯苗 培養(yǎng)，得到煙草植株。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟4)中原生質(zhì)體細(xì)胞在所述C:B 培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件為在22~25°C黑暗條件下培養(yǎng)22~26h，再移至暗光下培養(yǎng)5d~ 7山優(yōu)選為24°C黑暗條件下培養(yǎng)2化，再移至暗光下培養(yǎng)6d。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于，在所述添加了抗生素的A培養(yǎng)基中的 培養(yǎng)條件為22~26°C暗光條件下，60~1(K)巧m搖動(dòng)培養(yǎng)，優(yōu)選為24°C暗光條件下80巧m 搖動(dòng)培養(yǎng)； 所述愈傷組織或芽在所述MS再生培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件為22~26 °C暗光培養(yǎng)，優(yōu)選為 24 °C暗光培養(yǎng)； 所述幼芽在所述MS培養(yǎng)基上的培養(yǎng)條件為22~26°C暗光培養(yǎng)，優(yōu)選為24°C暗光培 養(yǎng)。
10. 權(quán)利要求5~9任一項(xiàng)所述的方法在本生煙和栽培煙草中的紅花大金元、K326、云 87、CB-1原生質(zhì)體分離、轉(zhuǎn)化和再生方面的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于煙草原生質(zhì)體的高效分離、轉(zhuǎn)化和再生體系，所述再生體系包括專用于煙草原生質(zhì)體的分離、轉(zhuǎn)化和再生的試劑組合和方法，其中試劑組合包括1/2MS培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基、酶解液、C培養(yǎng)基、W5洗液、Evans Blue染液、轉(zhuǎn)化液、聚乙二醇溶液、C:B培養(yǎng)基、A培養(yǎng)基、MS再生培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)化方法包括無菌苗的培養(yǎng)，原生質(zhì)體的分離和純化，原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化和原生質(zhì)體的培養(yǎng)及再生等步驟，本發(fā)明所述的方法具有步驟簡(jiǎn)單、操作規(guī)范、污染率低、轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】C12N5-04, A01H4-00, C12N15-82
【公開號(hào)】CN104789518
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510159339
【發(fā)明人】高崑, 張康
【申請(qǐng)人】北京吉諾沃生物科技有限公司
【公開日】2015年7月22日
【申請(qǐng)日】2015年4月3日