本發(fā)明屬于生物工程
技術領域：
，尤其涉及一種雜交瘤細胞株，以及一種抗腎上腺皮質激素釋放激素(crh)的單克隆抗體，及其試劑盒。
背景技術：
：據(jù)世界衛(wèi)生組織1996年報告，全世界居住在海拔2500m以上人口總數(shù)為1.4億，而且每年約有4000萬人來到高山和高原地區(qū)，急性高原病是進入高山、高原地區(qū)的一大類常見病和多發(fā)病，人體急進暴露于低氧環(huán)境后產生的各種病理性反應。如果預防或治療不當，急性高原病還會進一步發(fā)展為高原腦水腫、肺水腫，對高原工作、旅游及救援人員的健康帶來很大的威脅。因此，如何實現(xiàn)進駐高原人群的預防性診斷，及早診斷出易患病人群，對高原病的防治具有重要意義。大腦是高原缺氧應激最敏感器官，在低氧環(huán)境下，為保證大腦氧供給，下丘腦-垂體-腎上腺軸(hpaaxis)發(fā)揮了關鍵調節(jié)作用，其中，腎上腺皮質激素釋放激素(crh)觸發(fā)了hpa軸的開啟。crh是由41個氨基酸組成的多肽，在哺乳動物腦組織內主要由下丘腦室旁核小細胞部的神經元合成并分泌。通過正中隆起，crh被分泌到垂體，刺激垂體分泌促腎上腺皮質激素(acth)，進而促進身上腺皮質激素的分泌。crh在應激條件反應中起重要調節(jié)作用。現(xiàn)有研究表明，基礎血漿crh>50pg/ml或者唾液crh>21pg/ml的人群中，到達高原后，超過80％個體發(fā)生ams，高水平的crh和急性高原病(acutemountainsickness，ams)的發(fā)生具有直接關聯(lián)?；Acrh水平檢測在預測急性高原病的發(fā)生中具有重要意義，通過預測，可以指導ams易患病人群提前做好必要的防治措施，從而將ams的危害降至最低。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的問題是針對crh抗體及相關技術的不足，提供一種雜交瘤細胞株。為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案是：一種雜交瘤細胞株，于2016年5月31日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國武漢武漢大學，分類命名為雜交瘤細胞，保藏編號為cctccno.c2015215。本發(fā)明同時提供一種抗腎上腺皮質激素釋放激素(crh)的單克隆抗體c-d17，其特征在于：由權利要求1所述雜交瘤細胞株產生。所述單克隆抗體c-d17能識別crh的n端表位，crh的c端表位序列為seqidno:1中所示序列。所述單克隆抗體c-d17為igg1型，輕鏈為κ型；本發(fā)明所述單克隆抗體c-d17的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：s01：將crhc與klh偶聯(lián)，形成klh-crhc偶聯(lián)肽，作為免疫原；s02：以klh-crhc偶聯(lián)肽與免疫佐劑混合，免疫balb/c小鼠后，取小鼠脾細胞；s03：將小鼠脾細胞與sp2/0小鼠骨髓瘤細胞融合，獲得所述雜交瘤細胞，體內誘生或體外培養(yǎng)，經純化，即得。本發(fā)明還提供所述的抗crh的單克隆抗體c-d17的應用，其特征在于：應用于制備檢測crh方面的檢測工具或在制備檢測與crh有關疾病的試劑方面的應用。進一步，所述與人crh有關疾病為急性高原病。本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測crh的雙抗體夾心elisa試劑盒，包括所述的單克隆抗體c-d17；還包括單克隆抗體n-d19；所述單克隆抗體n-d19是保藏編號為cctccno.c2015215的雜交瘤細胞株產生，能識別crh的n端表位，crh的n端表位序列為seqidno:2中所示序列。進一步，所述試劑盒包括預包被單克隆抗體n-d19的酶標板和hrp標記的單克隆抗體c-d17；或預包被單克隆抗體c-d17的酶標板和hrp標記的單克隆抗體n-d19。優(yōu)選的，所述試劑盒包括預包被單克隆抗體c-d17的酶標板和hrp標記的單克隆抗體n-d19。進一步，所述預包被單克隆抗體c-d17或n-d19的包被方法為：將單克隆抗體c-d17或n-d19用包被液稀釋至10ug/ml，按100ul/孔加入到酶標板中，4℃包被過夜，洗滌液洗滌，再加入封閉液，封閉2h，洗滌液洗滌。優(yōu)選的，所述包被液為0.05mmol/l的碳酸鹽緩沖液(ph9.6)；所述封閉液為pbs和質量分數(shù)為1％的bsa。進一步，所述hrp標記單克隆抗體c-d17或n-d19的方法為：首先稱取10mghrp干粉，于5ml雙蒸水中充分溶解，加入新鮮配制的0.2mol/lnaio4溶液0.5ml，避光于4℃水平搖床上輕輕搖動30min，加入已經透析至碳酸鹽緩沖液的單克隆抗體c-d17或n-d19抗體10mg，混勻后，將溶液裝入截留分子量為50kda的已預先處理好的透析袋中，將其對0.05mol/l的ph9.6的碳酸鹽緩沖液4℃透析，每6h更換一次透析液，透析四次；透析結束后，取出透析袋中液體，向其中加入濃度為5mg/ml的nabh4100μl，4℃靜置4h；加入等體積的飽和硫酸銨溶液，4℃放置過夜；5000rpm離心10min，用1ml0.05mmol/l的pbs(ph7.4)重懸后，對0.05mmol/l的pbs(ph7.4)緩沖液4℃透析，每6h更換一次透析液，透析四次；取出透析后的溶液，向其中加入標記液中加入等體積的甘油，即得純化好的hrp標記得單克隆抗體c-d17或n-d19。進一步，所述試劑盒還包括crh標準品；標準品或樣品稀釋液：ph為7.4的pbs緩沖液；酶標抗體稀釋液：pbs和質量分數(shù)為1％bsa；洗滌液：0.02mol/lpbs和質量分數(shù)為0.05％吐溫20；顯色液：tmb顯色液；終止液：2mol/lh2so4。本發(fā)明所述試劑盒的使用方法，包括如下步驟：向預包被的酶標板中加入待測樣品、hrp標記的單克隆抗體c-d17或n-d19，顯色液顯色，終止液終止，檢測od450。優(yōu)選的，所述hrp標記的單克隆抗體c-d17或n-d19的保存的濃度為1mg/ml，工作時稀釋體積倍數(shù)為1:10000。本發(fā)明具有的優(yōu)點和積極效果是：本發(fā)明提供了一種雜交瘤細胞株，于2016年5月31日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，分類命名為雜交瘤細胞，保藏編號為cctccno.c2015215。基于所屬雜交瘤細胞可產生具有優(yōu)異特異性的抗crh單克隆抗體c-d17。本發(fā)明提供的抗crh單克隆抗體c-d17，可以識別crh的c端表位；具有良好的特異性與較高的效價，其效價可達1：4×106。本發(fā)明的檢測crh的雙抗體夾心elisa試劑盒，具有很好的特異性及較高的靈敏度：通過雙抗夾心elisa對crh抗原檢測，檢測限可以達到15.6pg/ml，與現(xiàn)有技術產品比較，靈敏度有明顯提高。另外，本試劑盒穩(wěn)定性很好，在4℃條件下可以保存兩年。同時，本檢測試劑盒所用材料耗費少，檢測樣本的用量在微升水平，檢測成本較低，適用于易感人群的普篩，適合大規(guī)模推廣。經驗證，采用本發(fā)明提供的試劑盒對10例急性高原病患者血清樣本進行鑒定，其檢測結果與預期完全一致，準確性可達100％。附圖說明圖1為c-d17經proteing親和純化后電泳圖(m：marker；1：還原電泳；2：非還原電泳)圖2為klh-crhc偶聯(lián)肽免疫小鼠血清效價檢測(m：marker；1：還原電泳；2：非還原電泳)圖3為c-d17特異性檢測圖4為n-d19經proteing親和純化電泳圖圖5為klh-crhn偶聯(lián)肽免疫小鼠血清效價圖圖6為n-d19特異性檢測圖7為crh檢測標準曲線具體實施方式除非另外說明，本文中所用的術語均具有本領域技術人員常規(guī)理解的含義，本發(fā)明采用的儀器皆為常規(guī)市售品，皆可于市場購得。為了便于理解本發(fā)明，將本文中使用的一些術語進行了下述定義。在說明書和權利要求書中使用的，單數(shù)型“一個”和“這個”包括復數(shù)參考，除非上下文另有清楚的表述。例如，術語“(一個)細胞”包括復數(shù)的細胞，包括其混合物。所有的數(shù)字標識，例如ph、溫度、時間、濃度，包括范圍，都是近似值。要了解，雖然不總是明確的敘述所有的數(shù)字標識之前都加上術語“約”。同時也要了解，雖然不總是明確的敘述，本文中描述的試劑僅僅是示例，其等價物是本領域已知的。實施例1本發(fā)明所述單克隆抗體c-d17的制備與純化。1、制備免疫原1.1制備crhc合成肽：合成crh的c端表位，序列為seqidno:2中所示序列，純度大于99％。1.2klh-crhc偶聯(lián)肽的獲得：稱取3mg間-馬來酰亞胺苯甲酸-n-羥基琥珀酰亞胺酯(mbs)溶解在200μl二甲基甲酰胺(dmf)，取1.5mgklh溶解在0.5ml0.05mol/l的磷酸鹽緩沖液(ph7.0)，向其中添加配置好的mbs溶液70μl，室溫攪拌30min；klh/mbs混合溶液過pd-10脫鹽柱，0.05mol/l磷酸鹽緩沖液(ph6.0)洗脫，收集得到3.5ml純化的klh/mbs；添加0.5ml去離子水、5mgcrhc合成肽溶于100μldmf，迅速加入1ml純化的klh/mbs，快速震蕩并立即用2nnaoh調節(jié)ph至7.0-7.2，將該混合溶液4℃放置過夜；最后添加3ml0.1mol/lnh4hco3，冷凍干燥得到klh-crhc偶聯(lián)肽，即為用于制備抗體的免疫原。2、動物免疫及抗血清效價監(jiān)測實驗動物：6周齡雌性balb/c小鼠購自北京維通利華實驗動物公司，免疫佐劑quickantibody購自北京康碧泉生物技術有限公司，小鼠骨髓瘤細胞sp2/0由本單位保存。2.1小鼠免疫：取50μgklh-crhc偶聯(lián)肽(in250μlpbs)，與等體積的免疫佐劑吹打混勻后，100μl每只小鼠，腿部肌肉多點注射；每隔10天免疫一次。2.2效價檢測：分別在免疫前、每次免疫后第7天取血，監(jiān)測抗血清效價。步驟包括：(1)包被：用0.05mol/l碳酸鹽緩沖液(ph9.0)將klh-crhc偶聯(lián)肽(或klh)稀釋至10μg/ml，加入到聚苯乙烯微96孔板中，每孔100μl，4℃包被過夜，棄去孔內液體，用洗滌緩沖液pbst(0.02mol/lpbs內含0.05％tween-20)洗3次，每次3分鐘；(2)封閉：每孔加入300μlbsa封閉液，37℃封閉2h，棄去液體，并用洗滌緩沖液pbst(0.02mol/lpbs內含0.05％tween-20)洗3次，每次3分鐘；(3)將待測效價的血清樣本用bsa封閉液倍比稀釋后，以100μl每孔加入到上述酶標板中，每個稀釋倍數(shù)做三個復孔，37℃孵育1h，棄去液體并用洗滌緩沖液pbst(0.02mol/lpbs內含0.05％tween-20)洗3次，每次3分鐘；(4)用酶標抗體稀釋液(pbs+1％bsa)將羊抗鼠igg/hrp5000倍稀釋后，以100μl每孔加入到上述酶標板中，37℃孵育0.5h，棄去液體并用洗滌緩沖液pbst(0.02mol/lpbs內含0.05％tween-20)洗3次，每次3分鐘；(5)每孔加入100μltmb底物顯色液，室溫避光顯色10min后，每孔加入50μl終止液(2mol/lh2so4)終止反應，測450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作為陰性對照，以測定值/對照值≥2.1為陽性來判斷免疫血清效價；每個采血時間點，各組小鼠均進行內眼眶采血，通過上述elisa實驗檢測小鼠血清效價，四次免疫后，將效價最高,且效價>105免疫小鼠安排細胞融合實驗。3、細胞融合、細胞株建株及抗體制備3.1實驗準備：融合前一天，處死正常小鼠一只，去小鼠腹腔液體制備小鼠飼養(yǎng)細胞；融合當天，取效價達到(或超過)105的小鼠，處死后，無菌條件下取出小鼠脾臟，碾碎并經無菌200目篩網(wǎng)過濾，置于無菌生理鹽水中吹打洗滌后進行細胞計數(shù)；骨髓瘤細胞sp2/0細胞用rpmi-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，同脾細胞步驟洗滌并計數(shù)；3.2細胞融合：將準備好的sp2/0與脾細胞按1:10比例充分混合，1min內加入預先放置在37℃水浴保溫的融合劑(無菌peg-4000，50％)1ml，37℃靜置1min后，于2min內沿管壁緩慢加入5mlrpmi-1640不完全培養(yǎng)液(37℃預溫)，同時輕輕轉動離心管；然后加入預熱的rpmi-1640液至20ml終止融合，800rpm離心10min，用hat培養(yǎng)液重懸沉淀細胞并將細胞分種于96孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，每天觀察并記錄細胞生長狀態(tài)。融合后第3天用hat培養(yǎng)液半量換液，第7天、第10天用ht培養(yǎng)液半量換液，之后改用完全培養(yǎng)液(rpmi-1640內含15％胎牛血清)換液培養(yǎng)。3.3陽性雜交瘤細胞株建株：參照《體外培養(yǎng)的原理與技術》，融合后第10-14天選擇培養(yǎng)板中有細胞團的培養(yǎng)上清進行elisa檢測，同時包被klh作為陰性對照。取陽性的細胞孔內的細胞，擴大培養(yǎng)至48孔后，再次檢測效價，選擇繼續(xù)為陽性的細胞用有限稀釋亞克隆法進行培養(yǎng)，選擇四次亞克隆后仍為陽性的細胞，將該細胞株保存至中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為cctccno.c2015215；并用其擴大培養(yǎng)后凍存細胞并制備腹水。3.4制備腹水：取8周齡的雌性balb/c小鼠，腹腔注射0.5ml液體石蠟，一周后，收集擴大培養(yǎng)的雜交瘤細胞，每只小鼠注射2×105個細胞，第6天起小鼠陸續(xù)開始產生腹水，收集小鼠腹水10,000rpm離心15min，腹水用等體積磷酸鹽緩沖液(ph7.4)稀釋并經0.45μm微孔濾膜過濾，于4℃?zhèn)溆没蛘?20℃保存。3.5單克隆抗體的純化：proteing親和填料購自美國法瑪西亞公司，用2ml填料純化10ml上述保存的腹水，洗脫的抗體經sephadexg-25脫鹽處理后，以sds-page測定單克隆抗體的純度，c-d17抗體純度均達到90％以上。c-d17經proteing親和純化后電泳圖見圖1。4、單克隆抗體c-d17的特性鑒定4.1濃度測定：采用pierce公司bsa蛋白定量試劑盒測定純化得到的抗體濃度，c-d17為1.72mg/ml。4.2亞類鑒定：采用北京五康新興科技有限公司的抗體亞類快速鑒定試紙鑒定從腹水純化的c-d17單克隆抗體，c-d17抗體為igg1型，輕鏈為κ型。4.3效價評估：采用elisa方法測:單克隆抗體的效價。首先分別用包被緩沖液將klh-crhc偶聯(lián)肽與klh稀釋至10μg/ml，以100μl/孔包被酶標板，37℃包被2h后，用bsa封閉液封閉后，向各孔加入倍比稀釋的n-d19抗體，37℃孵育1h，洗板，加入1:5000稀釋的羊抗鼠igg/hrp，繼續(xù)孵育30min，充分洗板，加入tmb顯色試劑避光顯色10min，用2mol/lh2so4終止顯色反應，讀取450nm的吸光值。結果見圖2。圖2結果表明，c-d179抗體的效價可達到1：4×106。4.4特異性及交叉反應性鑒定：采用間接elisa方法檢測c-d17抗體的特異性及與klh、klh偶聯(lián)肽、crh、促黃體生成素(lh)等的交叉反應性，未免疫小鼠血清純化的抗體作為對照(con)，elisa結果見圖3。結果表明，c-d17對除klh-crhc與crh外的其他蛋白均沒有結合，而且c-d17對klh-crhc的結合能力與對crh的結合能力沒有明顯差異。實施例2本發(fā)明所述單克隆抗體n-d19的制備與純化。1、制備免疫原1.1制備crhn合成肽：合成crh的n端表位，序列為seqidno:1中所示序列，純度大于99％。1.2klh-crhn偶聯(lián)肽的獲得：稱取3mg間-馬來酰亞胺苯甲酸-n-羥基琥珀酰亞胺酯(mbs)溶解在200μl二甲基甲酰胺(dmf)，取1.5mgklh溶解在0.5ml0.05mol/l的磷酸鹽緩沖液(ph7.0)，向其中添加配置好的mbs溶液70μl，室溫攪拌30min；klh/mbs混合溶液過pd-10脫鹽柱，0.05mol/l磷酸鹽緩沖液(ph6.0)洗脫，收集得到3.5ml純化的klh/mbs；添加0.5ml去離子水、5mgcrhn合成肽溶于100μldmf，迅速加入1ml純化的klh/mbs，快速震蕩并立即用2nnaoh調節(jié)ph至7.0-7.2，將該混合溶液4℃放置過夜；最后添加3ml0.1mol/lnh4hco3，冷凍干燥得到klh-crhn偶聯(lián)肽，即為用于制備抗體的免疫原。2、動物免疫及抗血清效價監(jiān)測實驗動物：6周齡雌性balb/c小鼠購自北京維通利華實驗動物公司，免疫佐劑quickantibody購自北京康碧泉生物技術有限公司，小鼠骨髓瘤細胞sp2/0由本單位保存。2.1小鼠免疫：取50μgklh-crhn偶聯(lián)肽(in250μlpbs)，與等體積的免疫佐劑吹打混勻后，100μl每只小鼠，腿部肌肉多點注射；每隔10天免疫一次。2.2效價檢測：分別在免疫前、每次免疫后第7天取血，監(jiān)測抗血清效價。步驟包括：(1)包被：用0.05mol/l碳酸鹽緩沖液(ph9.0)將klh-crhn偶聯(lián)肽(或klh)稀釋至10μg/ml，加入到聚苯乙烯微96孔板中，每孔100μl，4℃包被過夜，棄去孔內液體，用洗滌緩沖液pbst(0.02mol/lpbs內含0.05％tween-20)洗3次，每次3分鐘；(2)封閉：每孔加入300μlbsa封閉液，37℃封閉2h，棄去液體，并用洗滌緩沖液pbst(0.02mol/lpbs內含0.05％tween-20)洗3次，每次3分鐘；(3)將待測效價的血清樣本用bsa封閉液倍比稀釋后，以100μl每孔加入到上述酶標板中，每個稀釋倍數(shù)做三個復孔，37℃孵育1h，棄去液體并用洗滌緩沖液pbst(0.02mol/lpbs內含0.05％tween-20)洗3次，每次3分鐘；(4)用酶標抗體稀釋液(pbs+1％bsa)將羊抗鼠igg/hrp5000倍稀釋后，以100μl每孔加入到上述酶標板中，37℃孵育0.5h，棄去液體并用洗滌緩沖液pbst(0.02mol/lpbs內含0.05％tween-20)洗3次，每次3分鐘；(5)每孔加入100μltmb底物顯色液，室溫避光顯色10min后，每孔加入50μl終止液(2mol/lh2so4)終止反應，測450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作為陰性對照，以測定值/對照值≥2.1為陽性來判斷免疫血清效價；每個采血時間點，各組小鼠均進行內眼眶采血，通過上述elisa實驗檢測小鼠血清效價，四次免疫后，將效價最高,且效價>105免疫小鼠安排細胞融合實驗。3、細胞融合、細胞株建株及抗體制備3.1實驗準備：融合前一天，處死正常小鼠一只，去小鼠腹腔液體制備小鼠飼養(yǎng)細胞；融合當天，取效價達到(或超過)105的小鼠，處死后，無菌條件下取出小鼠脾臟，碾碎并經無菌200目篩網(wǎng)過濾，置于無菌生理鹽水中吹打洗滌后進行細胞計數(shù)；骨髓瘤細胞sp2/0細胞用rpmi-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，同脾細胞步驟洗滌并計數(shù)；3.2細胞融合：將準備好的sp2/0與脾細胞按1:10比例充分混合，1min內加入預先放置在37℃水浴保溫的融合劑(無菌peg-4000，50％)1ml，37℃靜置1min后，于2min內沿管壁緩慢加入5mlrpmi-1640不完全培養(yǎng)液(37℃預溫)，同時輕輕轉動離心管；然后加入預熱的rpmi-1640液至20ml終止融合，800rpm離心10min，用hat培養(yǎng)液重懸沉淀細胞并將細胞分種于96孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，每天觀察并記錄細胞生長狀態(tài)。融合后第3天用hat培養(yǎng)液半量換液，第7天、第10天用ht培養(yǎng)液半量換液，之后改用完全培養(yǎng)液(rpmi-1640內含15％胎牛血清)換液培養(yǎng)。3.3陽性雜交瘤細胞株建株：參照《體外培養(yǎng)的原理與技術》，融合后第10-14天選擇培養(yǎng)板中有細胞團的培養(yǎng)上清進行elisa檢測，同時包被klh作為陰性對照。取陽性的細胞孔內的細胞，擴大培養(yǎng)至48孔后，再次檢測效價，選擇繼續(xù)為陽性的細胞用有限稀釋亞克隆法進行培養(yǎng)，選擇四次亞克隆后仍為陽性的細胞，將該細胞株保存至中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為cctccno.c2015216；并用其擴大培養(yǎng)后凍存細胞并制備腹水。3.4制備腹水：取8周齡的雌性balb/c小鼠，腹腔注射0.5ml液體石蠟，一周后，收集擴大培養(yǎng)的雜交瘤細胞，每只小鼠注射2×105個細胞，第6天起小鼠陸續(xù)開始產生腹水，收集小鼠腹水10,000rpm離心15min，腹水用等體積磷酸鹽緩沖液(ph7.4)稀釋并經0.45μm微孔濾膜過濾，于4℃?zhèn)溆没蛘?20℃保存。3.5單克隆抗體的純化：proteing親和填料購自美國法瑪西亞公司，用2ml填料純化10ml上述保存的腹水，洗脫的抗體經sephadexg-25脫鹽處理后，以sds-page測定單克隆抗體的純度，n-d19抗體純度均達到90％以上。n-d19經proteing親和純化電泳圖見圖4。4、單克隆抗體n-d19的特性鑒定4.1濃度測定：采用pierce公司bsa蛋白定量試劑盒測定純化得到的抗體濃度，n-d19為2.33mg/ml。4.2亞類鑒定：采用北京五康新興科技有限公司的抗體亞類快速鑒定試紙鑒定從腹水純化的n-d19單克隆抗體，n-d19抗體為igg2a型，輕鏈為κ型。4.3效價評估：采用elisa方法測:單克隆抗體的效價。首先分別用包被緩沖液將klh-crhn偶聯(lián)肽與klh稀釋至10μg/ml，以100μl/孔包被酶標板，37℃包被2h后，用bsa封閉液封閉后，向各孔加入倍比稀釋的n-d19抗體，37℃孵育1h，洗板，加入1:5000稀釋的羊抗鼠igg/hrp，繼續(xù)孵育30min，充分洗板，加入tmb顯色試劑避光顯色10min，用2mol/lh2so4終止顯色反應，讀取450nm的吸光值。結果見圖5。圖5結果表明，n-d19抗體的效價可達到1：4×106。4.4特異性及交叉反應性鑒定：采用間接elisa方法檢測n-d19抗體的特異性及與klh、klh偶聯(lián)肽、crh、促黃體生成素(lh)等的交叉反應性，elisa結果見圖6。結果表明，n-d19對除klh-crhn與crh外的其他蛋白均沒有結合，而且n-d19對klh-crhn的結合能力與對crh的結合能力沒有明顯差異。實施例3本發(fā)明檢測crh的雙抗體夾心elisa試劑盒的組成和最佳工作濃度檢測1、制備hrp標記的抗人crh單克隆抗體c-d17或n-d19hrp標記單克隆抗體c-d17或n-d19的方法為：首先稱取10mghrp干粉，于5ml雙蒸水中充分溶解，加入新鮮配制的0.2mol/lnaio4溶液0.5ml，避光于4℃水平搖床上輕輕搖動30min，加入已經透析至碳酸鹽緩沖液的單克隆抗體c-d17或n-d19抗體10mg，混勻后，將溶液裝入截留分子量為50kda的已預先處理好的透析袋中，將其對0.05mol/l的ph9.6的碳酸鹽緩沖液4℃透析，每6h更換一次透析液，透析四次；透析結束后，取出透析袋中液體，向其中加入濃度為5mg/ml的nabh4100μl，4℃靜置4h；加入等體積的飽和硫酸銨溶液，4℃放置過夜；5000rpm離心10min，用1ml0.05mmol/l的pbs(ph7.4)重懸后，對0.05mmol/l的pbs(ph7.4)緩沖液4℃透析，每6h更換一次透析液，透析四次；取出透析后的溶液，向其中加入標記液中加入等體積的甘油，即得純化好的hrp標記得單克隆抗體c-d17或n-d19。2、酶標抗體的標記驗證采用elisa方法檢測n-d19/hrp和c-d17/hrp的標記效果。將稀釋后的c-d17(或n-d19)(1μg/ml)包被在酶標板上(4℃過夜)，用封閉液37℃封閉2h，依次加入倍比稀釋的crh抗原、n-d19/hrp(c-d17/hrp)，繼續(xù)孵育1h，充分洗板后，經tmb顯色并終止液終止顯色反應后，讀取od450(見表1)。c-d17抗體包被，n-d19作為檢測抗體為最佳組合，為減少本底的影響，檢測抗體濃度為：1:10000。表1crh雙抗夾心elisa檢測(od450)3、試劑盒檢測限及檢測范圍檢測靈敏度15.6pg/ml，最佳檢測范圍15.6～1000pg/ml。4、試劑盒組成及檢測方法試劑盒主要包括：c-d19預包被的酶標板、pbst洗滌緩沖液、n-d19/hrp檢測抗體、酶標抗體稀釋液、tmb顯色液、終止液。本發(fā)明所述試劑盒的使用方法，包括如下步驟：(1)兩倍稀釋離心收集的血清，加入預包被的酶標板，37℃放置2h；(2)pbst洗滌3次；(3)用酶標抗體稀釋液(pbs+1％bsa)將hrp標記抗體n-d1910000倍稀釋后，以100μl每孔加入到上述酶標板中，37℃孵育1h，棄去液體并用洗滌緩沖液pbst洗3次，每次3分鐘；(4)每孔加入100μltmb底物顯色液，室溫避光顯色10min后，每孔加入50μl終止液(2mol/lh2so4)終止反應，測450nm吸收值。實施例4本發(fā)明檢測crh的雙抗體夾心elisa試劑盒的檢測人血清樣品1、血清樣品收集收集10例急性高原病患者血清樣本，另外收集10例正常。2、繪制標準曲線以od450為縱坐標，以倍比稀釋的crh濃度(pg/ml)為橫坐標，繪制標準曲線，并建立回歸方程。繪得標準曲線如圖7所示，其回歸方程為：y＝0.001x+0.427，其中r2＝0.993符合線性關系的判斷標準。3、依照實施例3的檢測方法對血清樣品進行檢測根據(jù)標準曲線，讀取各血清樣品中crh含量，結果如表2所示：高原病人crh含量(pg/ml)健康人crh含量(pg/ml)187.2155.9291.5256.3399.4347.8481.8453.5580.7555.5696.9661.3792.6749.8884.7854.3982.3963.41078.71052.7平均值87.58平均值55.05標準差7.17標準差4.72結果表明：健康人血清中crh含量平均含量為55.05pg/ml，高原病人清中crh含量平均含量為87.58pg/ml，患者血清中crh含量高于健康人血清中crh含量。采用spss13.0軟件分析，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.01)?？梢姡翰捎帽景l(fā)明提供的試劑盒，根據(jù)測得的crh在血清中含量可以準確的判定患者是否有高原病。而本實施例作為典型舉例的10例高原病患者的血清中crh蛋白的含量皆高于10個健康人的血清中crh含量。表明本發(fā)明提供的方法具有良好的準確性，能夠與預期結果完全一致，準確率可達100％。以上對本發(fā)明的實施例進行了詳細說明，但所述內容僅為本發(fā)明的較佳實施例，不能被認為用于限定本發(fā)明的實施范圍。凡依本發(fā)明范圍所作的均等變化與改進等，均應仍歸屬于本專利涵蓋范圍之內。當前第1頁12