本發(fā)明屬于細(xì)胞因子
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法。
背景技術(shù)：
：間充質(zhì)干細(xì)胞來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，屬于多能干細(xì)胞。因其具有多向分化潛能、造血支持和促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點而日益受到人們的關(guān)注。間充質(zhì)干細(xì)胞作用機理尚不完全明確，一般認(rèn)為主要通過以下機制：1、旁分泌作用分泌細(xì)胞營養(yǎng)因子、細(xì)胞生長因子、抗凋亡因子等。2、代替或修復(fù)死亡或受損的細(xì)胞。3、細(xì)胞直接接觸，調(diào)控細(xì)胞的功能。當(dāng)前，越來越多的研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞的旁分泌效應(yīng)在其發(fā)揮治療效果中其主要作用。間充質(zhì)干細(xì)胞通過分泌各類細(xì)胞因子對鄰近細(xì)胞產(chǎn)生作用，從而發(fā)揮其功效。研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子，如VEGF血管內(nèi)皮生長因子、bFGF堿性成纖維細(xì)胞生長因子、NGF神經(jīng)生長因子、HGF肝細(xì)胞生長因子、IGF-1胰島素樣生長因子1、BDNF腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、GDNF膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、IL-6白細(xì)胞介素6、IL-11白細(xì)胞介素11等。間充質(zhì)干細(xì)胞分泌活性因子具有改善炎性環(huán)境、調(diào)節(jié)機體免疫狀態(tài)、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖、促進(jìn)血管再生、促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞遷移和分化、促進(jìn)軸突生長及突觸連接形成及促進(jìn)髓鞘形成的功能等，通過腦白質(zhì)損傷的動物模型證實可以抑制宿主細(xì)胞及移植細(xì)胞凋亡、改善模型鼠的神經(jīng)功能，通過心梗動物模型證實可以促進(jìn)心功能恢復(fù)，通過皮膚損傷實驗證實可以促進(jìn)傷口愈合。目前的間充質(zhì)干細(xì)胞因子的制備方法的報道，如中國專利申請CN105543313A中公開的人源間充質(zhì)干細(xì)胞因子及其制備方法，收集并合并P1-P5代細(xì)胞生長至匯合度75-85％時的上清液，并對上清液進(jìn)行過濾和超濾得到細(xì)胞因子濃縮液即可，該方法未能提供有效的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌過程不夠高效，得到的間充質(zhì)干細(xì)胞因子數(shù)量較少，且該方法需要收集多代細(xì)胞培養(yǎng)基，效率低，工藝不連續(xù)，極易導(dǎo)致樣品受到不必要的污染，且多代收集的方法來制備細(xì)胞因子，產(chǎn)品均一性較難保證，分離純化過程不具規(guī)?；^難適應(yīng)大批量生產(chǎn)。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法，建立完善樣本采集規(guī)范，建立大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分泌細(xì)胞因子的制備工藝，設(shè)計一套高效連續(xù)分離純化工藝，產(chǎn)品經(jīng)真空冷凍干燥可長期保存。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法，包括以下步驟：1、間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)：選取健康間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)體外原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)至4代后，將4代細(xì)胞消化計數(shù)，轉(zhuǎn)至細(xì)胞工廠進(jìn)行擴增培養(yǎng)；2、間充質(zhì)干細(xì)胞因子的誘導(dǎo)分泌：當(dāng)擴增培養(yǎng)的細(xì)胞長至匯合度70～85％時，棄掉原培養(yǎng)基，添加誘導(dǎo)培養(yǎng)基至細(xì)胞工廠，繼續(xù)培養(yǎng)，收集誘導(dǎo)培養(yǎng)基；3、間充質(zhì)干細(xì)胞因子的分離純化：將收集的誘導(dǎo)培養(yǎng)基通過中空纖維濾膜進(jìn)行循環(huán)過濾5-8遍，收集第一粗純液，將第一粗純液泵至切向流超濾膜包，循環(huán)過濾至第一粗純液體積濃縮為原體積的1/30-1/60，然后向濃縮粗純液中加入PBS緩沖液補至原體積得到第二粗純液，繼續(xù)泵至切向流超濾膜包循環(huán)過濾至第二粗純液體積濃縮為原體積的1/40-1/60后，向第二濃縮粗純液中加入生理鹽水補至原體積得到第三粗純液，繼續(xù)超濾至第三粗純液體積濃縮為原體積的1/30-1/50，收集濃縮濾液得間充質(zhì)干細(xì)胞因子濃縮液；其中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基由體積比為30-80:20-60:0.2-1.5的DMEM、PBS緩沖液和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液的混合培養(yǎng)基及誘導(dǎo)劑組成，所述誘導(dǎo)劑包括如下濃度的組分：10-20mmol/L的HEPES、1-2g/100ml的D-葡萄糖和40-70μmol/L的L-維生素C，其中DMEM的濃度為1500-3000mg/L，PBS緩沖液的濃度為0.01-0.03M，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液的濃度為150-300mM。本發(fā)明所提供的間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法，采用單一樣本來源大規(guī)模培養(yǎng)，保真批次產(chǎn)品均一性，間充質(zhì)干細(xì)胞因子的誘導(dǎo)分泌階段采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加誘導(dǎo)劑配制成誘導(dǎo)培養(yǎng)基，刺激細(xì)胞因子的大量分泌，配方合理有效，保持神經(jīng)干細(xì)胞的高活率同時大量分泌細(xì)胞因子，誘導(dǎo)培養(yǎng)基基本不含大分子蛋白成分，便于后期產(chǎn)物分離純化；間充質(zhì)干細(xì)胞因子的分離純化階段包含兩步置換緩沖液步驟，第一步用PBS緩沖液有效防止細(xì)胞因子純化過程失活；第二部采用生理鹽水，避免PBS緩沖液在凍干過程中因本身特性產(chǎn)生的PH急劇變化導(dǎo)致蛋白失活，整個制備過程條件穩(wěn)定合理，適宜大規(guī)模生產(chǎn)。進(jìn)一步地，所述誘導(dǎo)劑還包括5-7mg/ml的硫代甘油和0.8-1.3mmol/L的吡哆醇鹽酸鹽。進(jìn)一步地優(yōu)選，當(dāng)擴增培養(yǎng)的細(xì)胞長至匯合度70～85％時，棄掉原培養(yǎng)基，添加原培養(yǎng)基一半體積的誘導(dǎo)培養(yǎng)基至細(xì)胞工廠，繼續(xù)培養(yǎng)72h；其中，0-24h內(nèi)培養(yǎng)條件為37℃、5％CO2、5％O2，24-48h內(nèi)培養(yǎng)條件為：37℃、5％CO2、20％O2；48-72h內(nèi)培養(yǎng)條件為：37℃、5％CO2、5％O2；于48h后收集半量誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并向細(xì)胞工廠中加入等量誘導(dǎo)培養(yǎng)基；72h后收集全部誘導(dǎo)培養(yǎng)基。誘導(dǎo)階段交替改善培養(yǎng)環(huán)境并放出一部分誘導(dǎo)培養(yǎng)基，補加新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基，從而改善細(xì)胞生長環(huán)境，解除產(chǎn)物抑制，使細(xì)胞進(jìn)一步分泌細(xì)胞因子。進(jìn)一步地，所述制備方法還包括間充質(zhì)干細(xì)胞因子的冷凍干燥步驟，將間充質(zhì)干細(xì)胞因子濃縮液用生理鹽水稀釋得到間充質(zhì)干細(xì)胞因子生理鹽水稀釋液，添加凍干保護(hù)劑混合均勻，過濾除菌后-80℃冷凍，并進(jìn)行真空干燥，得到的間充質(zhì)干細(xì)胞因子凍干粉，-20℃保存。進(jìn)一步地，所述凍干保護(hù)劑包括250-400mmol/L海藻糖、180-220mmol/L山梨醇和0.8-1.3g/L的人血白蛋白；更進(jìn)一步地，所述凍干保護(hù)劑還包括：30-50mmol/L的二氨基乙烷聚丙烯酰胺和12-36mmol/L的黃體酮，將間充質(zhì)干細(xì)胞因子在凍干過程中有效保護(hù)，保證凍干粉的高質(zhì)量。優(yōu)選地，間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)包括如下步驟：1、在無菌條件取得含有間充質(zhì)干細(xì)胞的組織塊裝于培養(yǎng)瓶中，加入間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，保持培養(yǎng)瓶絕對靜止培養(yǎng)5天，其后每3天換液；2、待細(xì)胞長至75-85％愈合時，棄舊培養(yǎng)基，于非細(xì)胞培養(yǎng)面加入生理鹽水洗滌兩次，然后加入0.25％胰酶均勻浸潤細(xì)胞貼壁面，室溫孵育3-5min，待細(xì)胞變圓后加無血清培養(yǎng)基，快速震蕩并吹打細(xì)胞貼壁面，得到細(xì)胞懸液，離心棄上清，沉淀加生理鹽水再次洗滌并離心得細(xì)胞沉淀，所述細(xì)胞沉淀用無血清培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞篩過濾，計數(shù)并以為1-2×104個/ml細(xì)胞濃度鋪瓶，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)；3、取間充質(zhì)干細(xì)胞因子的4代細(xì)胞，消化計數(shù)按1-2×104/ml密度接種到細(xì)胞工廠中，同時按相同密度接種于培養(yǎng)瓶伴隨培養(yǎng)，以37℃、5％CO2、20％O2條件進(jìn)行培養(yǎng)。采用營養(yǎng)充足的培養(yǎng)基，有利的培養(yǎng)條件，快速大量擴增間充質(zhì)干細(xì)胞，采用低氧環(huán)境，模擬間充質(zhì)干細(xì)胞在生物體內(nèi)環(huán)境，刺激大量分泌細(xì)胞因子。優(yōu)選地，所述含有間充質(zhì)干細(xì)胞的組織為人臍帶，采集方法包括如下步驟：1、提前確定臍帶來源孕婦，調(diào)查家族遺傳病史，抽母血進(jìn)行病毒檢測，記錄健康調(diào)查表；2、新生兒出生當(dāng)場采集臍帶，保存于儲運液，保存時間<12h；3、將臍帶消毒、清洗，剪成小塊，縱向撕開，剖離1根靜脈血管和2根動脈血管，去除羊膜，撕取華通膠；4、將華通膠洗滌，充分剪碎至1mm3-3mm3大小，即得含有間充質(zhì)干細(xì)胞組織塊。上述方法建立完善樣本采集規(guī)范，有利于大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)樣品質(zhì)量的穩(wěn)定性。另一方面，本發(fā)明提供一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法所需的制備裝置，包括通過管路依次密閉連接的細(xì)胞工廠、誘導(dǎo)培養(yǎng)基儲罐、中空纖維膜微濾器、粗純液儲罐、切向流超濾膜超濾器和生物安全柜，所述粗純液儲罐還通過管路連接有PBS緩沖液儲罐和生理鹽水儲罐；所述中空纖維膜微濾器與所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基儲罐間還設(shè)有第一循環(huán)管路，所述切向流超濾膜超濾器與所述粗純液儲罐件還設(shè)有第二循環(huán)管路，所述第一循環(huán)管路、第二循環(huán)管路，細(xì)胞工廠與誘導(dǎo)培養(yǎng)基儲罐之間、中空纖維膜微濾器與粗純液儲罐之間、PBS緩沖液儲罐或生理鹽水儲罐與粗純液儲罐之間和切向流超濾膜超濾器與生物安全柜之間的管道上均設(shè)有閥門，所述中空纖維膜微濾器與所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基儲罐之間及切向流超濾膜超濾器與所述粗純液儲罐件之間的管路上還安裝有無菌泵。提供了一套高效連續(xù)封閉的分離純化裝置，整個純化系統(tǒng)密閉連接，連續(xù)化操作，大大提高分離純化效率。優(yōu)選地，所述無菌泵為無菌蠕動泵，所述切向流超濾膜超濾器的截留分子量為5kD。進(jìn)一步地，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基儲罐、粗純液儲罐、PBS緩沖液儲罐和生理鹽水儲罐上均設(shè)有空氣過濾器，有效防止空氣中微生物或細(xì)菌的進(jìn)入。本發(fā)明的有益效果在于:1、提供了系統(tǒng)的樣本采集、細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞因子誘導(dǎo)分泌及細(xì)胞因子分離純化工藝，單一樣本來源大規(guī)模培養(yǎng)，最大可能實現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性、均一性及重現(xiàn)性，適用于工業(yè)生產(chǎn)；2、培養(yǎng)分為兩個階段，第一階段采用營養(yǎng)充足培養(yǎng)基、有利培養(yǎng)條件快速大量擴增細(xì)胞；第二階段采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加誘導(dǎo)劑配置誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并采用低氧環(huán)境，模擬間充質(zhì)干細(xì)胞在生物體內(nèi)環(huán)境，刺激大量分泌細(xì)胞因子；3、純化過程包含兩步置換緩沖液步驟，第一步用PBS緩沖液有效防止細(xì)胞因子純化過程失活；第二部采用生理鹽水，避免PBS緩沖液在凍干過程中因本身特性產(chǎn)生的PH急劇變化導(dǎo)致蛋白失活。4、誘導(dǎo)培養(yǎng)基基本不含大分子蛋白成分，便于后期產(chǎn)物分離純化。誘導(dǎo)階段交替改善培養(yǎng)環(huán)境并放出一部分誘導(dǎo)培養(yǎng)基，補加新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基，從而改善細(xì)胞生長環(huán)境，解除產(chǎn)物抑制，使細(xì)胞進(jìn)一步分泌細(xì)胞因子；5、純化濃縮液采用ELISA法測定4種代表因子濃度，然后調(diào)節(jié)濃縮液細(xì)胞因子濃度，最后添加保護(hù)劑進(jìn)行真空冷凍干燥，真空壓蓋，保證了最終產(chǎn)品批次間的均一性。有利于產(chǎn)品后續(xù)在美容、臨床前研究及醫(yī)療方面的應(yīng)用。6、提供完整系統(tǒng)的一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法所需的制備裝置，該裝置實現(xiàn)了間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備的連續(xù)化操作，大大提高純化效率，并可有效防止空氣中微生物進(jìn)入；無菌泵可選蠕動泵，較易保證無菌操作具體實施方式下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明進(jìn)一步說明；下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍；本發(fā)明中所使用的設(shè)備，如無特殊規(guī)定，均為本領(lǐng)域內(nèi)常用的設(shè)備；本發(fā)明中所使用的方法，如無特殊規(guī)定，均為本領(lǐng)域內(nèi)常用的方法。實施例1一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法，包括以下步驟：1、選取間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)體外原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)至4代后，將4代細(xì)胞消化計數(shù)，轉(zhuǎn)至細(xì)胞工廠進(jìn)行擴增培養(yǎng)；2、當(dāng)擴增培養(yǎng)的細(xì)胞長至匯合度70～85％時，棄掉原培養(yǎng)基，添加誘導(dǎo)培養(yǎng)基至細(xì)胞工廠，繼續(xù)培養(yǎng)，收集誘導(dǎo)培養(yǎng)基；3、將收集的誘導(dǎo)培養(yǎng)基通過中空纖維濾膜進(jìn)行循環(huán)過濾5遍，收集第一粗純液，將第一粗純液泵至切向流超濾膜包，循環(huán)過濾至第一粗純液體積濃縮為原體積的1/50，然后向濃縮粗純液中加入PBS緩沖液補至原體積得到第二粗純液，繼續(xù)泵至切向流超濾膜包循環(huán)過濾至第二粗純液體積濃縮為原體積的1/50后，向第二濃縮粗純液中加入生理鹽水補至原體積得到第三粗純液，繼續(xù)超濾至第三粗純液體積濃縮為原體積的1/40，收集濃縮濾液得間充質(zhì)干細(xì)胞因子濃縮液；其中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基由培養(yǎng)基由體積比為50:49:1的DMEM、PBS緩沖液和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液的混合培養(yǎng)基及誘導(dǎo)劑組成，所述誘導(dǎo)劑包括如下濃度的組分：15mmol/L的HEPES、1.3g/100ml的D-葡萄糖和52μmol/L的L-維生素C，所述原培養(yǎng)基為常規(guī)無血清培養(yǎng)基，其中DMEM濃度為2500mg/L，PBS緩沖液緩沖溶液的濃度為0.02M，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液的濃度為200mM。實施例2一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法，包括以下步驟：1、選取間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)體外原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)至4代后，將4代細(xì)胞消化計數(shù)，轉(zhuǎn)至細(xì)胞工廠進(jìn)行擴增培養(yǎng)；2、當(dāng)擴增培養(yǎng)的細(xì)胞長至匯合度70～85％時，棄掉原培養(yǎng)基，添加誘導(dǎo)培養(yǎng)基至細(xì)胞工廠，繼續(xù)培養(yǎng)，收集誘導(dǎo)培養(yǎng)基；3、將收集的誘導(dǎo)培養(yǎng)基通過中空纖維濾膜進(jìn)行循環(huán)過濾8遍，收集第一粗純液，將第一粗純液泵至切向流超濾膜包，循環(huán)過濾至第一粗純液體積濃縮為原體積的1/30，然后向濃縮粗純液中加入PBS緩沖液補至原體積得到第二粗純液，繼續(xù)泵至切向流超濾膜包循環(huán)過濾至第二粗純液體積濃縮為原體積的1/40后，向第二濃縮粗純液中加入生理鹽水補至原體積得到第三粗純液，繼續(xù)超濾至第三粗純液體積濃縮為原體積的1/30，收集濃縮濾液得間充質(zhì)干細(xì)胞因子濃縮液；其中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基由培養(yǎng)基由體積比為30:68.5:1.5的DMEM、PBS緩沖液和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液的混合培養(yǎng)基及誘導(dǎo)劑組成，所述誘導(dǎo)劑包括如下濃度的組分：10mmol/L的HEPES、1g/100ml的D-葡萄糖和40μmol/L的L-維生素C，5mg/ml的硫代甘油和0.8mmol/L的吡哆醇鹽酸鹽，其中DMEM濃度為1500mg/L，PBS緩沖液緩沖溶液的濃度為0.01M，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液的濃度為300mM。。實施例3一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法，包括以下步驟：1、選取間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)體外原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)至4代后，將4代細(xì)胞消化計數(shù)，轉(zhuǎn)至細(xì)胞工廠進(jìn)行擴增培養(yǎng)；2、當(dāng)細(xì)胞長至匯合度70～85％時，棄掉原培養(yǎng)基，并按照原培養(yǎng)基一半體積添加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)調(diào)整參數(shù)為:37℃、5％CO2、5％O2，24h后調(diào)整培養(yǎng)參數(shù)為：37℃、5％CO2、20％O2，48h后收集半量誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并向細(xì)胞工廠中加入等量新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基，調(diào)整參數(shù)為37℃、5％CO2、5％O2，繼續(xù)培養(yǎng)；72h后收集全部誘導(dǎo)培養(yǎng)基；3、將收集的誘導(dǎo)培養(yǎng)基通過0.1um的中空纖維濾膜進(jìn)行循環(huán)過濾7遍，收集第一粗純液，將第一粗純液泵至切向流超濾膜包，循環(huán)過濾至第一粗純液體積濃縮為原體積的1/60，然后向濃縮粗純液中加入PBS緩沖液補至原體積得到第二粗純液，繼續(xù)泵至切向流超濾膜包循環(huán)過濾至第二粗純液體積濃縮為原體積的1/60后，向第二濃縮粗純液中加入生理鹽水補至原體積得到第三粗純液，繼續(xù)超濾至第三粗純液體積濃縮為原體積的1/50，收集濃縮濾液得間充質(zhì)干細(xì)胞因子濃縮液其中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基由培養(yǎng)基由體積比為80:19.8:0.2的DMEM、PBS緩沖液和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液的混合培養(yǎng)基及誘導(dǎo)劑組成，所述誘導(dǎo)劑包括如下濃度的組分：20mmol/L的HEPES、2g/100ml的D-葡萄糖和70μmol/L的L-維生素C，7mg/ml的硫代甘油和1.3mmol/L的吡哆醇鹽酸鹽，其中DMEM濃度為3000mg/L，PBS緩沖液緩沖溶液的濃度為0.03M，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液的濃度為300mM。實施例4一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法，包括以下步驟：1、選取間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)體外原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)至4代后，將4代細(xì)胞消化計數(shù)，轉(zhuǎn)至細(xì)胞工廠進(jìn)行擴增培養(yǎng)；2、當(dāng)細(xì)胞長至匯合度70～85％時，棄掉原培養(yǎng)基，并按照原培養(yǎng)基一半體積添加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)調(diào)整參數(shù)為:37℃、5％CO2、5％O2，24h后調(diào)整培養(yǎng)參數(shù)為：37℃、5％CO2、20％O2，48h后收集半量誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并向細(xì)胞工廠中加入等量新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基，調(diào)整參數(shù)為37℃、5％CO2、5％O2，繼續(xù)培養(yǎng)；72h后收集全部誘導(dǎo)培養(yǎng)基；3、將收集的誘導(dǎo)培養(yǎng)基通過0.1um的中空纖維濾膜進(jìn)行循環(huán)過濾6遍，收集第一粗純液，將第一粗純液泵至切向流超濾膜包，循環(huán)過濾至第一粗純液體積濃縮為原體積的1/50，然后向濃縮粗純液中加入PBS緩沖液補至原體積得到第二粗純液，繼續(xù)泵至切向流超濾膜包循環(huán)過濾至第二粗純液體積濃縮為原體積的1/50后，向第二濃縮粗純液中加入生理鹽水補至原體積得到第三粗純液，繼續(xù)超濾至第三粗純液體積濃縮為原體積的1/50，收集濃縮濾液得間充質(zhì)干細(xì)胞因子濃縮液；4、將間充質(zhì)干細(xì)胞因子濃縮液收集至合適離心管，取樣ELISA法測定VEGF、BDNF、GDNF、bFGF濃度，用生理鹽水稀釋至適當(dāng)濃度得純化液，然后將純化液用注射器吸出，0.22μm濾膜過濾除菌，分裝到2ml無菌、無熱源西林瓶，每管1ml，將西林瓶置于-80℃冰箱速凍4h；將西林瓶置于壓蓋式真空冷凍干燥機，浮蓋蓋好，啟動冷凍干燥機，設(shè)置真空度1.05mbar，干燥時間24h；干燥結(jié)束，真空壓蓋，西林瓶取出-20℃保存。其中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基由培養(yǎng)基由體積比為50:49:1的DMEM、PBS緩沖液和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液的混合培養(yǎng)基及誘導(dǎo)劑組成，所述誘導(dǎo)劑包括如下濃度的組分：10mmol/L的HEPES、2g/100ml的D-葡萄糖和50μmol/L的L-維生素C。凍干保護(hù)劑包括：250mmol/L海藻糖、180mmol/L山梨醇和0.8g/L的人血白蛋白。實施例5一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法，與實施例4的區(qū)別在于凍干保護(hù)劑包括：400mmol/L海藻糖、220mmol/L山梨醇和1.3g/L的人血白蛋白，50mmol/L的二氨基乙烷聚丙烯酰胺和36mmol/L的黃體酮。實施例6一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法，包括以下步驟：1、間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)：1)提前確定臍帶來源孕婦，調(diào)查家族遺傳病史，抽母血進(jìn)行病毒檢測，記錄健康調(diào)查表；2)新生兒出生當(dāng)場采集臍帶，保存于儲運液，保存時間<12h；3)將臍帶消毒、清洗，剪成小塊，縱向撕開，剖離1根靜脈血管和2根動脈血管，去除羊膜，撕取華通膠；4)將華通膠洗滌，充分剪碎至1mm3-3mm3大小，即得含有間充質(zhì)干細(xì)胞組織塊；5)將組織塊并裝于培養(yǎng)瓶中，加入間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，保持培養(yǎng)瓶絕對靜止培養(yǎng)5天，其后每3天換液；6)待細(xì)胞長至80％愈合時，棄舊培養(yǎng)基，于非細(xì)胞培養(yǎng)面加入生理鹽水洗滌兩次，然后加入0.25％胰酶均勻浸潤細(xì)胞貼壁面，室溫孵育3-5min，待細(xì)胞變圓后加無血清培養(yǎng)基，快速震蕩并吹打細(xì)胞貼壁面，得到細(xì)胞懸液，離心棄上清，沉淀加生理鹽水再次洗滌并離心得細(xì)胞沉淀，所述細(xì)胞沉淀用無血清培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞篩過濾，計數(shù)并以為1-2×104個/ml細(xì)胞濃度鋪瓶，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)；7)取間充質(zhì)干細(xì)胞因子的4代細(xì)胞，消化計數(shù)按1-2×104/ml密度接種到細(xì)胞工廠中，同時按相同密度接種于培養(yǎng)瓶伴隨培養(yǎng)，以37℃、5％CO2、20％O2條件進(jìn)行培養(yǎng)。2、間充質(zhì)干細(xì)胞因子的誘導(dǎo)分泌：當(dāng)細(xì)胞長至匯合度70～85％時，棄掉原培養(yǎng)基，并按照原培養(yǎng)基一半體積添加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)調(diào)整參數(shù)為:37℃、5％CO2、5％O2，24h后調(diào)整培養(yǎng)參數(shù)為：37℃、5％CO2、20％O2，48h后收集半量誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并向細(xì)胞工廠中加入等量新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基，調(diào)整參數(shù)為37℃、5％CO2、5％O2，繼續(xù)培養(yǎng)；72h后收集全部誘導(dǎo)培養(yǎng)基；3、間充質(zhì)干細(xì)胞因子的分離純化：將收集的誘導(dǎo)培養(yǎng)基通過0.1um的中空纖維濾膜進(jìn)行循環(huán)過濾6遍，收集第一粗純液，將第一粗純液泵至切向流超濾膜包，循環(huán)過濾至第一粗純液體積濃縮為原體積的1/50，然后向濃縮粗純液中加入PBS緩沖液補至原體積得到第二粗純液，繼續(xù)泵至切向流超濾膜包循環(huán)過濾至第二粗純液體積濃縮為原體積的1/50后，向第二濃縮粗純液中加入生理鹽水補至原體積得到第三粗純液，繼續(xù)超濾至第三粗純液體積濃縮為原體積的1/50，收集濃縮濾液得間充質(zhì)干細(xì)胞因子濃縮液；4、間充質(zhì)干細(xì)胞因子的冷凍干燥，將間充質(zhì)干細(xì)胞因子濃縮液用生理鹽水稀釋，添加凍干保護(hù)劑混合均勻，過濾除菌后-80℃冷凍干燥，得到的間充質(zhì)干細(xì)胞因子凍干粉，-20℃保存；其中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基由培養(yǎng)基由體積比為50:49:1的DMEM、PBS緩沖液和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液的混合培養(yǎng)基及誘導(dǎo)劑組成，所述誘導(dǎo)劑包括如下濃度的組分：10mmol/L的HEPES、1.5g/100ml的D-葡萄糖和55μmol/L的L-維生素C。凍干保護(hù)劑包括：250mmol/L海藻糖、180mmol/L山梨醇和0.8g/L的人血白蛋白，30mmol/L的二氨基乙烷聚丙烯酰胺和12mmol/L的黃體酮。實施例7一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法所需的制備裝置，包括通過管路依次密閉連接的細(xì)胞工廠、誘導(dǎo)培養(yǎng)基儲罐、中空纖維膜微濾器、粗純液儲罐和切向流超濾膜超濾器，所述粗純液儲罐還通過管路連接有PBS緩沖液儲罐和生理鹽水儲罐；所述中空纖維膜微濾器與所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基儲罐間還設(shè)有第一循環(huán)管路，所述切向流超濾膜超濾器與所述粗純液儲罐間還設(shè)有第二循環(huán)管路，所述第一循環(huán)管路、第二循環(huán)管路，細(xì)胞工廠與誘導(dǎo)培養(yǎng)基儲罐之間、中空纖維膜微濾器與粗純液儲罐之間、PBS緩沖液儲罐或生理鹽水儲罐與粗純液儲罐之間和切向流超濾膜超濾器與生物安全柜之間的管道上均設(shè)有閥門，所述中空纖維膜微濾器與所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基儲罐之間及切向流超濾膜超濾器與所述粗純液儲罐間之間的管路上還安裝有無菌泵，優(yōu)選地，所述無菌泵為無菌蠕動泵，所述切向流超濾膜超濾器的截留分子量為5kD。實施例8一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法所需的制備裝置，與實施例7的區(qū)別在于，誘導(dǎo)培養(yǎng)基儲罐、粗純液儲罐、PBS緩沖液儲罐和生理鹽水儲罐上均設(shè)有空氣過濾器。對照實施例1一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法，與實施例1的區(qū)別在于，誘導(dǎo)培養(yǎng)基與原培養(yǎng)基相同，所述原培養(yǎng)基為常規(guī)無血清培養(yǎng)基。對照實施例2一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法，與實施例1的區(qū)別在于，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)劑包括的組分及各組分在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度如下：10mmol/L的HEPES、1g/100ml的甘露糖、50μmol/L的維生素E。對照實施例3一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法，與實施例1的區(qū)別在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)基由體積比為50:50的DMEM和PBS緩沖液混合而成。對照實施例4一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法，與實施例1的區(qū)別在于，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)劑包括的組分及各組分在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度如下：10mmol/L的HEPES、1g/100ml的D-葡萄糖、50μmol/L的L-維生素C5mg/ml的硫代甘油。對照實施例5一種間充質(zhì)干細(xì)胞因子大規(guī)模制備方法，與實施例4的區(qū)別在于，所述凍干保護(hù)劑為，每100ml中含有如下組分：抗壞血酸(VC)0.5g，人白蛋白0.5ml,右旋糖苷3.5g、海藻糖1.5g，甘氨酸0.04g、精氨酸0.17g、氨基乙酸2g、檸檬酸鈉0.26g、叔丁醇15ml。試驗1：間充質(zhì)干細(xì)胞因子濃縮液中細(xì)胞因子的含量測定取等量實施例1-3、對照例1-4及中國專利申請CN105543313A中公開的人源間充質(zhì)干細(xì)胞因子制備方法所制備出的間充質(zhì)干細(xì)胞因子濃縮液，采用ELISA法測定VEGF、BDNF、GDNF、bFGF濃度，結(jié)果見表1。表1各細(xì)胞因子的濃度組別VEGFBDNFGDNFbFGF實施例1457ng/ml269ng/ml206ng/ml353ng/ml實施例2537ng/ml321ng/ml257ng/ml398ng/ml實施例3602ng/ml364ng/ml283ng/ml435ng/ml對照例1211ng/ml137ng/ml89ng/ml159ng/ml對照例2397ng/ml221ng/ml153ng/ml301ng/ml對照例3335ng/ml158ng/ml183ng/ml226ng/ml對照例4462ng/ml285ng/ml213ng/ml363ng/mlCN105543313A385ng/ml214ng/ml164ng/ml297ng/ml由表1可以看出，實施例1與對照例1-3相比，極大程度提高了各細(xì)胞因子的濃度，對間充質(zhì)干細(xì)胞分泌細(xì)胞因子具有很好的誘導(dǎo)作用，對照實施例2與實施例1的區(qū)別在于，將D-葡萄糖替換為其同分異構(gòu)體甘露糖、將L-維生素C替換為同族的維生素E；對照實施例3與實施例1的區(qū)別在于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的混合培養(yǎng)基中不含L-丙氨酰-L-谷氨酰胺水溶液；試驗結(jié)果可知，上述改變所構(gòu)成的誘導(dǎo)培養(yǎng)基均不能較好的起到誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的作用，各個組分相互協(xié)同，缺一不可且不可替代；實施例2相對于實施例1進(jìn)一步優(yōu)化了誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組分，有實驗結(jié)果可知實施例2的細(xì)胞因子濃度高于實施例1，對照例4與實施例2的區(qū)別在于誘導(dǎo)培養(yǎng)基組分不同，由試驗結(jié)果可知，實施例2的間充質(zhì)干細(xì)胞因子誘導(dǎo)分泌效果遠(yuǎn)優(yōu)于對照例4；而實施例3在實施例2的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了細(xì)胞培養(yǎng)的條件，更進(jìn)一步提高了細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的量；與中國專利申請CN105543313A的方法制備間充質(zhì)干細(xì)胞因子數(shù)量相比較，本發(fā)明所提供的間充質(zhì)干細(xì)胞因子制備方法得到的細(xì)胞因子更多，效率高，且方法簡單。試驗2：間充質(zhì)干細(xì)胞因子凍干粉檢驗取實施例4、實施例5和對照實施例2所得的間充質(zhì)干細(xì)胞因子凍干粉，于-10℃放置18個月，分別于6個月、12個月和18個月時觀察凍干粉的性狀、剩余水分及bFGF活性進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果見表2。表2試驗組和對照組神經(jīng)干細(xì)胞分化結(jié)果經(jīng)試驗結(jié)果分析可知，本發(fā)明所提供的凍干保護(hù)劑，可以形成穩(wěn)定的間充質(zhì)干細(xì)胞因子凍干粉，使產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，易于保存，在-10℃條件下可放置12個月以上無變化，含水量在1.33％以下，其中實施例5所提供的凍干保護(hù)劑較實施例4效果更佳；實施例1與對照例2相比效果更佳，且成分簡單，成本低廉。當(dāng)前第1頁1 2 3