本發(fā)明涉及五味子組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種五味子體細(xì)胞胚及其培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
五味子主產(chǎn)于吉林、遼寧、黑龍江、河北、山西、陜西、寧夏等北方各省的山區(qū)、半山區(qū)。五味子為常用中藥之一，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。五味子的有效成分是木質(zhì)素成分,已從五味子科植物中分離出23個聯(lián)苯環(huán)辛二烯木質(zhì)素類化合物,其中起主要作用的是五味子甲素、乙素、丙素、醇甲、醇乙、醋甲、醋乙、五味子酚，中醫(yī)認(rèn)為它具有收斂固澀、益氣生津、被腎寧心的功能。近年醫(yī)藥學(xué)研究表明，五味子有抗疲勞、抗氧化、抗衰老、抗低溫等作用，對治療肝炎、急性腸道炎、神經(jīng)衰弱、潛在克山病有一定療效。五味子(Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.)的次生代謝產(chǎn)物木質(zhì)素是工業(yè)生產(chǎn)中的主要原料之一，其具有廣泛的應(yīng)用價值。但現(xiàn)有的通過直接利用五味子果實直接提取木質(zhì)素的技術(shù)容易受季節(jié)以及生長周期的限制，不利于木質(zhì)素工業(yè)化生產(chǎn)，另外現(xiàn)有的通過組織培養(yǎng)方法培養(yǎng)得到的用作提取木質(zhì)素原料的五味子愈傷組織中的木質(zhì)素含量較低，不能起到促進(jìn)利用五味子愈傷組織培養(yǎng)物為原料提取木質(zhì)素的工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模的作用。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的第一目的在于提供一種五味子體細(xì)胞胚的培養(yǎng)方法，此培養(yǎng)方法采用組織培養(yǎng)技術(shù)對五味子外植體培養(yǎng)得到含有木質(zhì)素的體細(xì)胞胚，并且通過該培養(yǎng)方法得到體細(xì)胞胚含有的木質(zhì)素量較高。
本發(fā)明的第二目的在于提供一種用于培養(yǎng)五味子體細(xì)胞胚的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基能夠誘導(dǎo)五味子胚性愈傷組織分化形成含有木質(zhì)素的體細(xì)胞胚，且經(jīng)該培養(yǎng)基培養(yǎng)得到體細(xì)胞胚中的木質(zhì)素含量較高。
本發(fā)明的第三目的在于提供一種五味子體細(xì)胞胚，其由上述培養(yǎng)方法培養(yǎng)得到，其木質(zhì)素含量較高，可用作提取木質(zhì)素工業(yè)化生產(chǎn)中的原料。
本發(fā)明的第四目的在于提供五味子體細(xì)胞胚在制備木質(zhì)素中的應(yīng)用，以具有較高木質(zhì)素含量的五味子體細(xì)胞胚用作提取木質(zhì)素的原料，有利于實現(xiàn)木質(zhì)素的大規(guī)模生產(chǎn)。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。
一種五味子體細(xì)胞胚的培養(yǎng)方法，其包括：
取五味子外植體進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到五味子胚性愈傷組織；
將所述五味子胚性愈傷組織接種至體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進(jìn)行體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到含木質(zhì)素的體細(xì)胞胚；
其中，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基由每升1/2MS培養(yǎng)基中添加0.45-0.52mg BA、28-32g碳源以及0.4-0.6g氮源制成，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基pH為5.6-6.0，碳源是選自葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖以及山梨醇中的任意一種，氮源是選自椰汁、酵母提取物、水解酪蛋白以及水解乳蛋白中的任意一種。
一種用于培養(yǎng)五味子體細(xì)胞胚的培養(yǎng)基，其是由每升MS培養(yǎng)基中添加0.45-0.52mg BA、28-32g碳源以及0.4-0.6g氮源制成的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基pH為5.6-6.0，碳源是選自葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖以及山梨醇中的任意一種，氮源是選自椰汁、酵母提取物、水解酪蛋白以及水解乳蛋白中的任意一種。
一種五味子體細(xì)胞胚，其上述五味子體細(xì)胞胚的培養(yǎng)方法培養(yǎng)所得到。
上述五味子體細(xì)胞胚在制備木質(zhì)素中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的一種五味子體細(xì)胞胚及其培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基及應(yīng)用有益效果是：本發(fā)明的五味子體細(xì)胞胚的培養(yǎng)方法通過對體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基的體系優(yōu)化，調(diào)整體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的BA濃度為0.45-0.52mg/L、碳源的濃度為28-32g/L、氮源的濃度為0.4-0.6g/L等影響因素以使五味子胚性愈傷組織在分化成體細(xì)胞胚的過程中產(chǎn)生最大量的木質(zhì)素，并選用葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖以及山梨醇中的任意一種作為碳源和選用椰汁、酵母提取物、水解酪蛋白以及水解乳蛋白中的任意一種作為氮源，進(jìn)一步為體細(xì)胞胚的生長以及木質(zhì)素合成的提供最佳碳源和氮源，以使得到的體細(xì)胞胚中的木質(zhì)素含量最大化，進(jìn)而為五味子細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物木質(zhì)素的工廠化生產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供材料和依據(jù)。
具體實施方式
為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
下面對本發(fā)明實施例的一種五味子體細(xì)胞胚及其培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基及應(yīng)用進(jìn)行具體說明。
一種五味子體細(xì)胞胚的培養(yǎng)方法，其包括以下步驟。
S1獲取五味子胚性愈傷組織
取五味子外植體進(jìn)行前誘導(dǎo)培養(yǎng)，以得到五味子胚性愈傷組織。
具體包括：
(1)將五味子外植體于預(yù)培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，得到五味子愈傷組織。
其中，預(yù)培養(yǎng)基由每升MS培養(yǎng)基中添加2.8-3.2mg 2,4-D、0.18-0.22mg TDZ、28-32g蔗糖、6.8-7.2g瓊脂制成，預(yù)培養(yǎng)基的pH值為5.6-6.0。
優(yōu)選地，預(yù)培養(yǎng)的條件是在溫度為23-27℃條件下，黑暗培養(yǎng)28-30d。
優(yōu)選地，五味子外植體為0.4-0.5cm長的五味子莖段。需要說明的是，五味子外植體還可以是五味子的根、葉等器官組織，并不限于五味子的莖。
(2)將五味子愈傷組織于胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到五味子胚性愈傷組織。
其中，胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)基由每升MS培養(yǎng)基中添加0.8-1.2mg TDZ、0.018-0.22mg ZT、28-32g蔗糖、6.8-7.2g瓊脂制成，胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH為5.6-6.0。
優(yōu)選地，胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件是：溫度為23-27℃、光周期為15-17h、培養(yǎng)時間為28-30d。
S2獲取體細(xì)胞胚
(1)將五味子胚性愈傷組織接種至體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進(jìn)行體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到含木質(zhì)素的體細(xì)胞胚。
其中，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基由每升1/2MS培養(yǎng)基中添加0.45-0.52mg BA、28-32g碳源以及0.4-0.6g氮源制成，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH為5.6-6.0。其中，碳源是選自葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖以及山梨醇中的任意一種，氮源是選自椰汁、酵母提取物、水解酪蛋白以及水解乳蛋白以及中的任意一種。
優(yōu)選地，進(jìn)行體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件是：溫度為23-27℃、通氣量為0.15-0.25vvm的條件下暗培養(yǎng)28-30d。
優(yōu)選地，按質(zhì)量體積比為10-15：1的比例(指每升體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中接種10-15g五味子胚性愈傷組織)將五味子胚性愈傷組織接種至體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。
一種五味子體細(xì)胞胚，其由上述的五味子體細(xì)胞胚的培養(yǎng)方法培養(yǎng)所得到，該五味子體細(xì)胞胚具有較高含量的木質(zhì)素。
上述五味子體細(xì)胞胚在在制備木質(zhì)素中的應(yīng)用，五味子體細(xì)胞胚具有較高含量的木質(zhì)素，可用作提取木質(zhì)素的原料。
由此，本發(fā)明所提供的五味子體細(xì)胞胚的培養(yǎng)方法，以五味子莖段為外植體，誘導(dǎo)出愈傷組織，以及進(jìn)一步誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織和體細(xì)胞胚，通過對不同接種量，以及體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基的碳源、通氣量和氮源的選擇和控制，以使體細(xì)胞胚生長以及木質(zhì)素合成的達(dá)到最佳狀態(tài)，其對提高五味子組織培養(yǎng)物中的有效成分產(chǎn)率，篩選高產(chǎn)的細(xì)胞組織，實現(xiàn)木質(zhì)素的大規(guī)模生產(chǎn)具有重要意義，同時為五味子細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物木質(zhì)素的工廠化生產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供材料和依據(jù)。
需要說明的是，本發(fā)明中的2,4-D是2，4－二氯苯氧乙酸；BA是6-芐氨基腺嘌呤；TDZ是噻苯??；ZT是玉米素。
以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
實施例1
本實施例以五味子嫣紅品種的嫩莖段作為五味子外植體，五味子嫩莖段取自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所的國家果樹種質(zhì)資源圃。
本實施例的五味子體細(xì)胞胚的培養(yǎng)方法包括如下步驟：
(1)將取好的五味子嫩莖段用自來水沖洗4h，然后在超凈工作臺上用70％的酒精消毒30s，倒出酒精，用0.1％升汞消毒5min，再用無菌水沖洗3-4次。
(2)將五味子嫩莖段放入培養(yǎng)皿中，用鑷子及刀片在無菌條件下切成約0.5cm長的五味子莖段。
(3)將切好的五味子莖段接種至含有預(yù)培養(yǎng)基的三角瓶(容量為100ml，含30ml預(yù)培養(yǎng)基)中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，每個三角瓶中接種3個外植體，在溫度為25℃的預(yù)培養(yǎng)條件下，暗培養(yǎng)28天，以誘導(dǎo)形成愈傷組織。
其中，預(yù)培養(yǎng)基按如下方法制得：以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，按每升MS培養(yǎng)基中添加3.0mg 2,4-D、0.2mg TDZ、30g蔗糖、7g瓊脂，pH調(diào)節(jié)為5.8，經(jīng)高壓滅菌(指在溫度為121℃，壓力為1.2kg/cm的條件下滅菌20min，以下述及高壓滅菌的，其滅菌條件同此)，冷凝后制得。
(4)預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，將形成的愈傷組織切成約為0.3cm×0.3cm的小塊，然后轉(zhuǎn)移至胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)，在溫度為25℃，光周期16h(光照強(qiáng)度為30μmol·m–2·s–1)的胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)28天，以誘導(dǎo)愈傷組織進(jìn)一步形成胚性愈傷組織。
其中，胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以每升MS培養(yǎng)基中添加1mg TDZ、0.2mg ZT、30g蔗糖、7g瓊脂，pH調(diào)節(jié)為5.8，經(jīng)高壓滅菌，冷凝后制得。
(5)胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，按每升體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基接種20g胚性愈傷組織的比例，將胚性愈傷組織接種至含有體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器(哈爾濱道外化玻站，氣升式生物反應(yīng)器，含2L體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基)中，于溫度為25℃，通氣量為0.2vvm的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，暗培養(yǎng)30天，以誘導(dǎo)形成含木質(zhì)素的體細(xì)胞胚。
其中，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基由每升1/2MS培養(yǎng)基中添加0.5mgBA、30g蔗糖以及0.5g水解酪蛋白，pH調(diào)節(jié)為5.8后，經(jīng)高壓滅菌，冷凝后制得。
實施例2
本實施例的五味子體細(xì)胞胚的培養(yǎng)方法包括如下步驟：
(1)將取好的五味子嫩莖段用自來水沖洗4h，然后在超凈工作臺上用70％的酒精消毒30s，倒出酒精，用0.1％升汞消毒5min，再用無菌水沖洗3-4次。
(2)將五味子嫩莖段放入培養(yǎng)皿中，用鑷子及刀片在無菌條件下切成約0.4cm長的五味子莖段即外植體。
(3)將切好的五味子莖段接種至含有預(yù)培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，每個三角瓶中接種3個外植體，在溫度為27℃下的預(yù)培養(yǎng)條件下，暗培養(yǎng)28天，以誘導(dǎo)形成愈傷組織。
其中，所用預(yù)培養(yǎng)基按如下方法制得：以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，按每升MS培養(yǎng)基中添加3.2mg 2,4-D、0.18mg TDZ、32g蔗糖、6.8g瓊脂，pH調(diào)節(jié)為5.8，然后在溫度為121℃，壓力為1.2kg/cm的條件下高壓滅菌20min，冷凝后制得。
(4)預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，將形成的愈傷組織切成約為0.3cm×0.3cm的小塊，然后轉(zhuǎn)移至胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)，在溫度為25℃，光周期15h(光照強(qiáng)度為30μmol·m–2·s–1)的胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)28天，以誘導(dǎo)愈傷組織進(jìn)一步形成胚性愈傷組織。
其中，胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以每升MS培養(yǎng)基中添加1.2mg TDZ、0.22mg ZT、28g蔗糖、7.2g瓊脂，pH調(diào)節(jié)為5.8，經(jīng)高壓滅菌，冷凝后制得。
(5)胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，按每升體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基接種20g胚性愈傷組織的比例，將胚性愈傷組織接種至含有體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器中，于溫度為23℃，通氣量為0.25vvm的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，暗培養(yǎng)30天，以誘導(dǎo)形成含木質(zhì)素的體細(xì)胞胚。
其中，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基由每升1/2MS培養(yǎng)基中添加0.52mgBA、30g山梨醇以及0.6g水解乳蛋白，pH調(diào)節(jié)為5.8后，經(jīng)高壓滅菌，冷凝后制得。
實施例3
本實施例的五味子體細(xì)胞胚的培養(yǎng)方法包括如下步驟：
(1)將取好的五味子嫩莖段用自來水沖洗4h，然后在超凈工作臺上用70％的酒精消毒30s，倒出酒精，用0.1％升汞消毒5min，再用無菌水沖洗3-4次。
(2)將五味子嫩莖段放入培養(yǎng)皿中，用鑷子及刀片在無菌條件下切成約0.5cm長的五味子莖段即外植體。
(3)將切好的五味子莖段接種至含有預(yù)培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，每個三角瓶中接種3個外植體，在溫度為27℃下的預(yù)培養(yǎng)條件下，暗培養(yǎng)28天，以誘導(dǎo)形成愈傷組織。
其中，所用預(yù)培養(yǎng)基按如下方法制得：以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，按每升MS培養(yǎng)基中添加2.8mg 2,4-D、0.22mg TDZ、28g蔗糖、7.2g瓊脂，pH調(diào)節(jié)為5.8，然后在溫度為121℃，壓力為1.2kg/cm的條件下高壓滅菌20min，冷凝后制得。
(4)預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，將形成的愈傷組織切成約為0.3cm×0.3cm的小塊，然后轉(zhuǎn)移至胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)，在溫度為25℃，光周期16h(光照強(qiáng)度為30μmol·m–2·s–1)的胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)28天，以誘導(dǎo)愈傷組織進(jìn)一步形成胚性愈傷組織。
其中，胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以每升MS培養(yǎng)基中添加0.5mg BA、0.1mg NAA、30g蔗糖以及7g瓊脂，pH調(diào)節(jié)為5.8，經(jīng)高壓滅菌，冷凝后制得。
(5)胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，按每升體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基接種30g胚性愈傷組織的比例，將胚性愈傷組織接種至含有體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器中，于溫度為27℃，通氣量為0.15vvm的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，暗培養(yǎng)28天，以誘導(dǎo)形成含木質(zhì)素的體細(xì)胞胚。
其中，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基由每升MS培養(yǎng)基中添加0.45mg BA、30g蔗糖以及0.4g椰汁，pH調(diào)節(jié)為5.8后，經(jīng)高壓滅菌，冷凝后制得。
實施例4
本實施例的五味子體細(xì)胞胚的培養(yǎng)方法包括如下步驟：
(1)將取好的五味子嫩莖段用自來水沖洗4h，然后在超凈工作臺上用70％的酒精消毒30s，倒出酒精，用0.1％升汞消毒5min，再用無菌水沖洗3-4次。
(2)將五味子嫩莖段放入培養(yǎng)皿中，用鑷子及刀片在無菌條件下切成約0.5cm長的五味子莖段即外植體。
(3)將切好的五味子莖段接種至含有預(yù)培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，每個三角瓶中接種3個外植體，在溫度為27℃下的預(yù)培養(yǎng)條件下，暗培養(yǎng)28天，以誘導(dǎo)形成愈傷組織。
其中，所用預(yù)培養(yǎng)基按如下方法制得：以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，按每升MS培養(yǎng)基中添加3.0mg 2,4-D、0.2mg TDZ、30g蔗糖、7g瓊脂，pH調(diào)節(jié)為5.8，然后在溫度為121℃，壓力為1.2kg/cm的條件下高壓滅菌20min，冷凝后制得。
(4)預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，將形成的愈傷組織切成約為0.3cm×0.3cm的小塊，然后轉(zhuǎn)移至胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)，在溫度為25℃，光周期17h(光照強(qiáng)度為30μmol·m–2·s–1)的胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)28天，以誘導(dǎo)愈傷組織進(jìn)一步形成胚性愈傷組織。
其中，胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以每升MS培養(yǎng)基中添加1mg TDZ、0.2mg ZT、30g蔗糖、7g瓊脂，pH調(diào)節(jié)為5.6，經(jīng)高壓滅菌，冷凝后制得。
(5)胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，按每升體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基接種15g胚性愈傷組織的比例，將胚性愈傷組織接種至含有體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器中，于溫度為25℃，通氣量為0.2vvm的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，暗培養(yǎng)30天，以誘導(dǎo)形成含木質(zhì)素的體細(xì)胞胚。
其中，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基由每升MS培養(yǎng)基中添加0.45mg BA、32g乳糖以及0.6g酵母提取物，pH調(diào)節(jié)為5.8后，經(jīng)高壓滅菌，冷凝后制得。
實施例5
本實施例的五味子體細(xì)胞胚的培養(yǎng)方法包括如下步驟：
(1)將取好的五味子嫩莖段用自來水沖洗4h，然后在超凈工作臺上用70％的酒精消毒30s，倒出酒精，用0.1％升汞消毒5min，再用無菌水沖洗3-4次。
(2)將五味子嫩莖段放入培養(yǎng)皿中，用鑷子及刀片在無菌條件下切成約0.4cm長的五味子莖段即外植體。
(3)將切好的五味子莖段接種至含有預(yù)培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，每個三角瓶中接種3個外植體，在溫度為27℃下的預(yù)培養(yǎng)條件下，暗培養(yǎng)28天，以誘導(dǎo)形成愈傷組織。
其中，所用預(yù)培養(yǎng)基按如下方法制得：以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，按每升MS培養(yǎng)基中添加3.0mg 2,4-D、0.2mg TDZ、30g蔗糖、7g瓊脂，pH調(diào)節(jié)為5.8，然后在溫度為121℃，壓力為1.2kg/cm的條件下高壓滅菌20min，冷凝后制得。
(4)預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，將形成的愈傷組織切成約為0.3cm×0.3cm的小塊，然后轉(zhuǎn)移至胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)，在溫度為25℃，光周期16h(光照強(qiáng)度為30μmol·m–2·s–1)的胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)28天，以誘導(dǎo)愈傷組織進(jìn)一步形成胚性愈傷組織。
其中，胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以每升MS培養(yǎng)基中添加1mg TDZ、0.2mg ZT、30g蔗糖、7g瓊脂、30g蔗糖以及7g瓊脂，pH調(diào)節(jié)為5.8，經(jīng)高壓滅菌，冷凝后制得。
(5)胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，按每升體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基接種30g胚性愈傷組織的比例，將胚性愈傷組織接種至含有體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器中，于溫度為25℃，通氣量為0.2vvm的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，暗培養(yǎng)30天，以誘導(dǎo)形成含木質(zhì)素的體細(xì)胞胚。
其中，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基由每升MS培養(yǎng)基中添加0.5mg BA、30g蔗糖以及0.5g椰汁，pH調(diào)節(jié)為6.0后，經(jīng)高壓滅菌，冷凝后制得。
對比例1
本對比例的五味子體細(xì)胞胚的培養(yǎng)方法包括如下步驟：
(1)將取好的五味子嫩莖段用自來水沖洗4h，然后在超凈工作臺上用70％的酒精消毒30s，倒出酒精，用0.1％升汞消毒5min，再用無菌水沖洗3-4次。
(2)將五味子嫩莖段放入培養(yǎng)皿中，用鑷子及刀片在無菌條件下切成約0.5cm長的五味子莖段即外植體。
(3)將切好的五味子莖段接種至含有預(yù)培養(yǎng)基的三角瓶(容量為100ml，含30ml預(yù)培養(yǎng)基)中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)形成愈傷組織，每個三角瓶中接種3個外植體，在溫度為25℃下的預(yù)培養(yǎng)條件下，暗培養(yǎng)28天。
其中，所用預(yù)培養(yǎng)基按如下方法制得：以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，按每升MS培養(yǎng)基中添加3.0mg 2,4-D、0.2mg TDZ、30g蔗糖、7g瓊脂，pH調(diào)節(jié)為5.8，然后在溫度為121℃，壓力為1.2kg/cm的條件下高壓滅菌20min，冷凝后制得。
(4)預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，將形成的愈傷組織切成約為0.3cm×0.3cm的小塊，然后轉(zhuǎn)移至胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)，以誘導(dǎo)愈傷組織被進(jìn)一步誘導(dǎo)形成胚性愈傷組織，在溫度為25℃，光周期16h(光照強(qiáng)度為30μmol·m–2·s–1)的胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)28天。
其中，胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以每升MS培養(yǎng)基中添加1mg TDZ、0.2mg ZT、30g蔗糖、7g瓊脂，pH調(diào)節(jié)為5.8，經(jīng)高壓滅菌，冷凝后制得。
(5)胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，按每升體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基接種35g胚性愈傷組織的比例，將胚性愈傷組織接種至含有體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器中，于溫度為25℃，通氣量為0.2vvm的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，暗培養(yǎng)30天，以誘導(dǎo)形成含木質(zhì)素的體細(xì)胞胚。
其中，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基由每升MS培養(yǎng)基中添加0.5mg BA、pH調(diào)節(jié)為5.8后，經(jīng)高壓滅菌，冷凝后制得，該體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基未加入本發(fā)明所要求保護(hù)的碳源和氮源。
對比例2
本對比例的五味子體細(xì)胞胚的培養(yǎng)方法的步驟與對比例1相同，不同之處在于：在本對比例的步驟(5)中，按每升體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基接種35g胚性愈傷組織的比例，將胚性愈傷組織接種至含有體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器中；所用的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基由每升MS培養(yǎng)基中添加0.5mg BA、35g蔗糖以及0.3g椰汁，pH調(diào)節(jié)為5.8后，經(jīng)高壓滅菌，冷凝后制得。
實驗例
制作標(biāo)準(zhǔn)曲線:
(1)稱取標(biāo)準(zhǔn)品五味子醇甲1mg，置于5ml容量瓶中，用甲醇溶解定溶，混勻制成200μg/ml標(biāo)準(zhǔn)儲備液備用。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備1.0ml稀釋成100μg/ml、50μg/ml、20μg/ml、10μg/ml五味子醇甲標(biāo)準(zhǔn)對照液。按上述方法，分別制備五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素標(biāo)準(zhǔn)對照液。
(2)進(jìn)樣(美國Aglient1200系列高效液相色譜儀)，進(jìn)樣量為20μl，梯度洗脫：A相(超純水)、B相(甲醇)；梯度洗脫條件為：0-15min內(nèi)B相從30％線形降至57％，15-38min線形增至80％，35-40min降到57％，40-45min降到30％，與檢測器檢測波長為254nm下檢測五味子醇甲標(biāo)準(zhǔn)對照液的吸光值，以五味子醇甲標(biāo)準(zhǔn)對照液的濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)繪制出五味子醇甲的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝1421.1x-40.917，R2＝0.9997。
按上述方法，制得五味子醇乙的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝1327.7x-26.492，R2＝0.9997；制得五味子酯甲的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝952.77x-30.041，R2＝0.9999，制得五味子甲素的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝1602.5x-32.046，R2＝0.9999，制得五味子乙素的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝1440.3x-65.537，R2＝0.9994，制得五味子丙素的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝1216.1x-27.549，R2＝0.9999。
取上述實施例1-5、對比例1-2得到的體細(xì)胞胚，檢測其中的木質(zhì)素含量，檢測方法如下：分別取1g體細(xì)胞胚鮮樣加甲醇研磨，定容至5ml，進(jìn)樣(美國Aglient1200系列高效液相色譜儀)，梯度洗脫：A相(超純水)、B相(甲醇)；梯度洗脫條件為：0-15min內(nèi)B相從30％線形降至57％，15-38min線形增至80％，35-40min降到57％，40-45min降到30％，檢測器檢測波長為254nm，進(jìn)樣量為20μl。根據(jù)測得的吸光值代入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可分別測得樣品中的五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的濃度c，代入計算公式Y(jié)＝(c×5)/1×100％，可得到每g體細(xì)胞胚中的五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素含量，另外，木質(zhì)素總含量＝五味子醇甲+五味子醇乙+五味子酯甲+五味子甲素+五味子乙素+五味子丙素。重復(fù)3次，結(jié)果以平均值表示，檢測結(jié)果見表1。
表1.由實施例1-5以及對比例1-2得到的體細(xì)胞胚中的木質(zhì)素含量
注：表中小寫字母表示差異顯著，p<0.05，單位為％。
由表1可以得知，本發(fā)明實施例1-5的五味子體細(xì)胞胚的培養(yǎng)方法所得到體細(xì)胞胚中的木質(zhì)素含量明顯地高于對比例1-2，由于對比例1中的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基沒有加入本發(fā)明所要求保護(hù)的碳源(葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖以及山梨醇中的任意一種)和氮源(椰汁、酵母提取物、水解酪蛋白以及水解乳蛋白中的任意一種)，所以導(dǎo)致對比例1得到的體細(xì)胞胚中的木質(zhì)素含量低于實施例1-5，另外，雖然對比例2所用的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基加入有本發(fā)明所要求保護(hù)的碳源(35g蔗糖)和氮源(0.3g椰汁)，但其所用碳源和氮源的加入量并不在本發(fā)明所要求的碳源(28-32g)和氮源(0.4-06g)保護(hù)范圍內(nèi)，導(dǎo)致對比例2得到的體細(xì)胞胚中的木質(zhì)素含量仍然低于實施例1-5。由此表明，采用本發(fā)明提供的五味子體細(xì)胞胚的培養(yǎng)方法，特別是含碳源(葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖以及山梨醇中的任意一種)和氮源(椰汁、酵母提取物、水解酪蛋白、水解乳蛋白以及脯氨酸中的任意一種)的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基的使用能夠明顯地促進(jìn)木質(zhì)素在體細(xì)胞胚中的合成，提高其含量。
另外，再按上述檢測方法檢測實施例1中各階段的組織培養(yǎng)物即得到愈傷組織和胚性愈傷組織中的木質(zhì)素總含量，結(jié)果見表2。
表2.實施例1中各階段的組織培養(yǎng)物的木質(zhì)素總含量
注：表中小寫字母表示差異顯著，p<0.05，單位為％，“-”代表未檢出。
由表2可知，經(jīng)過體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)后的得到體細(xì)胞胚中的木質(zhì)素總含量明顯高于愈傷組織和胚性愈傷組織中，進(jìn)一步表明采用本發(fā)明提供的五味子體細(xì)胞胚的培養(yǎng)方法，特別是體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基的使用能夠明顯地促進(jìn)木質(zhì)素在體細(xì)胞胚中的合成，提高其含量。
綜上，本發(fā)明所提供的五味子體細(xì)胞胚的培養(yǎng)方法，以五味子莖段為外植體，誘導(dǎo)出愈傷組織，以及進(jìn)一步誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織和體細(xì)胞胚，通過對不同接種量，以及體細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基的碳源、通氣量和氮源的選擇和控制，以使體細(xì)胞胚生長以及木質(zhì)素合成的達(dá)到最佳狀態(tài)，其對提高五味子組織培養(yǎng)物中的有效成分產(chǎn)率，篩選高產(chǎn)的細(xì)胞組織，實現(xiàn)木質(zhì)素的大規(guī)模生產(chǎn)具有重要意義，同時為五味子細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物木質(zhì)素的工廠化生產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供材料和依據(jù)。
以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。