本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及二代測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)。

背景技術(shù)：

二代測(cè)序由于其超高的測(cè)序能力在科研和臨床中具有極為重要的應(yīng)用。二代測(cè)序技術(shù)也稱(chēng)深度測(cè)序、大規(guī)模平行測(cè)序，核心思想是邊合成邊測(cè)序(Sequencing by Synthesis)，即通過(guò)捕捉新合成的末端的標(biāo)記來(lái)確定DNA的序列，現(xiàn)有的技術(shù)平臺(tái)主要有Roche/454FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。這三個(gè)技術(shù)平臺(tái)各有優(yōu)點(diǎn)，454FLX的測(cè)序片段比較長(zhǎng)，高質(zhì)量的讀長(zhǎng)能達(dá)到400bp；Solexa測(cè)序性價(jià)比最高，不僅機(jī)器的售價(jià)比其他兩種低，而且運(yùn)行成本也低，在數(shù)據(jù)量相同的情況下，成本只有454測(cè)序的1/10；SOLID測(cè)序的準(zhǔn)確度高，原始?jí)A基數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度大于99.94％，而在15×覆蓋率時(shí)的準(zhǔn)確度可以達(dá)到99.999％。

Illumina/Solexa Genome Analyzer測(cè)序的基本原理是邊合成變測(cè)序。在Sanger等測(cè)序方法的基礎(chǔ)上，通過(guò)技術(shù)創(chuàng)新，用不同顏色的熒光標(biāo)記四種不同的dNTP，當(dāng)DNA聚合酶合成互補(bǔ)鏈時(shí)，每添加一種dNTP就會(huì)釋放出不同的熒光，根據(jù)捕捉的熒光信號(hào)并經(jīng)過(guò)特定的計(jì)算機(jī)軟件處理，從而獲得待測(cè)DNA的序列信息。

二代測(cè)序的一般流程如下：1)文庫(kù)制備，將DNA用霧化或超聲波隨機(jī)片段化成幾百堿基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端，緊接著磷酸化并增加一個(gè)核苷酸黏性末端。然后將測(cè)序接頭與片段連接；2) 簇的創(chuàng)建，將模板分子加入芯片用于產(chǎn)生克隆簇和測(cè)序循環(huán)。芯片有8個(gè)縱向泳道的硅基片。每個(gè)泳道內(nèi)芯片表面有無(wú)數(shù)的被固定的單鏈接頭。上述步驟得到的帶接頭的DNA片段變性成單鏈后與測(cè)序通道上的接頭引物結(jié)合形成橋狀結(jié)構(gòu)，以供后續(xù)的預(yù)擴(kuò)增使用。通過(guò)不斷循環(huán)獲得上百萬(wàn)條成簇分布的雙鏈待測(cè)片段；3)測(cè)序，DNA聚合酶結(jié)合熒光可逆終止子，熒光標(biāo)記簇成像，在下一個(gè)循環(huán)開(kāi)始前將結(jié)合的核苷酸剪切并分解；4)數(shù)據(jù)分析，測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)是長(zhǎng)度為幾十個(gè)堿基的序列，要通過(guò)生物信息學(xué)工具將這些短的序列組裝成長(zhǎng)的Contigs甚至是整個(gè)基因組的框架，或者把這些序列比對(duì)到已有的基因組或者相近物種基因組序列上，進(jìn)一步分析得到有生物學(xué)意義的結(jié)果。

聚合酶鏈反應(yīng)(即PCR)是一種廣泛運(yùn)用于分子遺傳和診斷的技術(shù)，用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段，可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，可分析任何短的DNA序列，PCR的最大特點(diǎn)，是能將微量的DNA大幅增加，即使樣品中只含有低水平的DNA。PCR技術(shù)可用于擴(kuò)增分析用的DNA或RNA選定片段。

目前市場(chǎng)上最成功的商業(yè)化多重PCR建庫(kù)技術(shù)是Thermo Fisher公司的Ampliseq技術(shù)，該技術(shù)可以在同一孔反應(yīng)中完成上千對(duì)引物的擴(kuò)增，使得多個(gè)靶標(biāo)區(qū)域的富集可以通過(guò)一次PCR反應(yīng)完成，隨后加上Ion Torrent測(cè)序平臺(tái)的通用接頭建好文庫(kù)用于二代測(cè)序。然而，這個(gè)產(chǎn)品存在最大的缺陷是客戶定制化的panel設(shè)計(jì)生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，需要兩到三個(gè)月，嚴(yán)重的增加了時(shí)間成本；并且每個(gè)樣本的建庫(kù)費(fèi)用高達(dá)1000-2000元，致使其經(jīng)濟(jì)成本極高；另外該試劑盒只適用于Ion Torrent測(cè)序平臺(tái)，受平臺(tái)因素影響大，亦不利于測(cè)序費(fèi)用的降低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于以上問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種基于多重PCR的二代測(cè)序建庫(kù)技術(shù)，該技術(shù)可以有效的解決Ampliseq試劑盒存在的問(wèn)題，對(duì)于客戶定制化的panel設(shè)計(jì)生產(chǎn)周期只需要兩周，并且可以極大的降低單個(gè)樣本建庫(kù)的成本，且在IonTorrent和Illumina測(cè)序平臺(tái)都通用。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明中用到了兩輪多重PCR來(lái)建庫(kù)。

首先針對(duì)每個(gè)靶標(biāo)區(qū)域或者靶標(biāo)位點(diǎn)，需要設(shè)計(jì)兩條特異性引物，一條引物在另一條引物的3’下游100-150bp的位置，處于下游的引物在5’端加上二代測(cè)序平臺(tái)通用的測(cè)序接頭。上游的引物OP用于第一輪多重PCR，下游的引物IP用于第二輪多重PCR。

具體的建庫(kù)過(guò)程是：

步驟1，將樣本DNA進(jìn)行片段化處理，隨后每個(gè)片段兩端加上特殊的接頭；

步驟2，加入第一輪擴(kuò)增的上游引物混合池，與特殊接頭互補(bǔ)的通用引物，配制成PCR總體系，進(jìn)行第一輪擴(kuò)增；

步驟3，將第一輪PCR產(chǎn)物純化后，加入第二輪擴(kuò)增的下游引物混合池，與第二步中使用過(guò)的特殊接頭互補(bǔ)的通用引物配制成PCR總體系，進(jìn)行第二輪擴(kuò)增；

步驟4，將第二輪PCR產(chǎn)物純化后，配置反應(yīng)總體系，進(jìn)行Q-PCR定量，稀釋到合適的濃度，即可用于二代測(cè)序。

上述技術(shù)方案中，作為優(yōu)選，步驟2中，第一輪特異性引物是普通的PCR擴(kuò)增引物，共20個(gè)左右的堿基，Tm值設(shè)定在60℃，序列根據(jù)目標(biāo)區(qū)域設(shè)計(jì)得到，多個(gè)引物混成一個(gè)OP引物池做為第一輪PCR的上游引物。PCR總體系為：2倍PCR Mix 35uL，10umol/L P7 1uL，1umol/L OP 1uL或0.5umol/L OP 2uL，DNA 25uL。

上述技術(shù)方案中，作為優(yōu)選，步驟3中，第二輪特異性引物是普通的PCR擴(kuò)增引物，在其5’端加上測(cè)序接頭5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’共80個(gè)左右的堿基，其中根據(jù)目標(biāo)區(qū)域設(shè)計(jì)得到的序列長(zhǎng)度是20個(gè)堿基左右，Tm值設(shè)定在60℃，多個(gè)引物混成一個(gè)IP引物池做為第二輪PCR的上游引物。P7的序列：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG 3’。PCR總體系為：2倍PCR Mix 15uL，10umol/L P7 1uL，1umol/L OP 1uL或0.5umol/L OP 2uL，DNA 5uL，NFW 5uL。

上述技術(shù)方案中，作為優(yōu)選，所述步驟4中的PCR總體系10uL具體為：VAHTS SYBR qPCR Master Mix 5uL，qPCR Primer Mix 1uL，DNA 2uL，ROXReference Dye 2 0.2uL，NFW 5uL。

上述技術(shù)方案中，作為優(yōu)選，所述的第一輪PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)目為10-14。

上述技術(shù)方案中，作為優(yōu)選，所述的第二輪PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)目為10-14。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果在于：提供一種基于多重PCR的二代測(cè)序建庫(kù)技術(shù)。在二代測(cè)序過(guò)程中采用該技術(shù)則不需要再購(gòu)買(mǎi)商業(yè)的建庫(kù)試劑盒，所有反應(yīng)試劑都可以單獨(dú)購(gòu)買(mǎi)組合，極大的降低了實(shí)驗(yàn)成本。另外由于在PCR過(guò)程中固定了一端的通用引物，極大的降低了多重PCR反應(yīng)體系中的引物種類(lèi)和數(shù)量，可以有效的抑制非特異性擴(kuò)增和引物之間的相互干擾，也降低了不同引物間的擴(kuò)增效率的差異。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為兩輪多重PCR的二代測(cè)序建庫(kù)過(guò)程。

圖2為10個(gè)樣本100 SNPs平均覆蓋深度。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步描述。以下實(shí)施例僅用于更加清楚地說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而不能以此來(lái)限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1.基因組DNA片段化

a.打開(kāi)Qsonica超聲破碎儀，提前讓循環(huán)水浴降溫，工作溫度為4℃。

b.轉(zhuǎn)移總量為1ug的基因組DNA到0.2mL的離心管中，用Nuclease Free Water(以下稱(chēng)NFW)補(bǔ)足到100uL，震蕩混勻，短時(shí)離心。

c.將0.2mL的離心管裝入超聲破碎儀的適配器，旋緊中軸，插入頂蓋，閉合機(jī)器，設(shè)定打斷程序：振幅-25％，on&off為20s-30秒，時(shí)長(zhǎng)15分鐘。開(kāi)始打斷。

d.打斷結(jié)束后，取出0.2mL離心管，按照順序排列整齊，開(kāi)蓋。

實(shí)施例2. 3in 1接頭連接

a.配置反應(yīng)體系22uL，先配置去除DNA之外的試劑，按照理論值的125％配，震蕩混勻，短時(shí)離心，分裝到96孔板中，每孔加7uL，之后從前面0.2mL離心管中轉(zhuǎn)移15uL的DNA到每孔中，蓋上蓋子。震蕩混勻，短時(shí)離心。

b.96孔板或八聯(lián)管放入PCR儀。設(shè)定程序：25℃30分鐘、72℃15分鐘、4℃保持。

c.結(jié)束后，每孔中加入0.5uL的T4 Ligase(單槍)和1uL的Adapter，蓋上新的蓋子。震蕩混勻，短時(shí)離心。室溫下孵育20-30分鐘。

d.磁珠震蕩30秒，充分混勻后，每一孔中加入25uL的磁珠，蓋上新蓋子。震蕩混勻，短時(shí)離心。室溫下孵育5分鐘。

e.將96孔板或八聯(lián)管放上磁力架，等待2分鐘，溶液澄清后，吸棄上清。

f.每孔加入100uL 80％乙醇，靜置30秒，吸棄上清。重復(fù)一遍。短時(shí)離心，吸棄上清。

g.晾干3-5分鐘，觀察磁珠表面不再潮濕反光，成霧面狀，可離開(kāi)磁力架，每孔加入30uL NFW，吹打混勻重懸磁珠，室溫孵育1分鐘。

h.孔板再次放上磁力架，等待2分鐘，溶液澄清后，轉(zhuǎn)移上清到新的孔板中。

實(shí)施例3.多重PCR

一、第一輪多重PCR

a.按照Qubit dsDNA HS Assay Kit操作手冊(cè)檢測(cè)樣品濃度，根據(jù)Qubit檢測(cè)的樣本濃度，每個(gè)樣品取同樣的量(10ng)，每5～10個(gè)樣本混合在一起轉(zhuǎn)移到新的孔板中。

b.第一輪特異性引物是普通的PCR擴(kuò)增引物，共20個(gè)左右的堿基，Tm值設(shè)定在60℃，序列根據(jù)目標(biāo)區(qū)域設(shè)計(jì)得到，多個(gè)引物混成一個(gè)OP引物池做為第一輪PCR的上游引物。配置PCR總體系,按照理論值的125％配，震蕩混勻，短時(shí)離心。

c.孔板放入PCR儀中，選擇MAPlex-1st程序運(yùn)行2個(gè)小時(shí)。

二、PCR產(chǎn)物純化

a.PCR結(jié)束后，取下孔板，打開(kāi)蓋子，每孔加入60uL的磁珠，吹打混勻，室溫下孵育5分鐘。

b.將孔板或八聯(lián)管放上磁力架，等待2分鐘，溶液澄清后，吸棄上清。

c.每孔加入100uL 80％乙醇，靜置30秒，吸棄上清。重復(fù)一遍。

d.晾干3-5分鐘，觀察磁珠表面不再潮濕反光，成霧面狀，可離開(kāi)磁力架，每孔加入20uL NFW，吹打混勻重懸磁珠，室溫孵育1分鐘。

e.孔板再次放上磁力架，等待2分鐘，溶液澄清后，轉(zhuǎn)移上清到新的孔板中。

三、第二輪多重PCR

a.第二輪特異性引物是普通的PCR擴(kuò)增引物，在其5’端加上測(cè)序接頭5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’共80個(gè)左右的堿基，其中根據(jù)目標(biāo)區(qū)域設(shè)計(jì)得到的序列長(zhǎng)度是20個(gè)堿基左右，Tm值設(shè)定在60℃，多個(gè)引物混成一個(gè)IP引物池做為第二輪PCR的上游引物。P7的序列：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG-3’。配置PCR總體系，按照理論值的125％配制，震蕩混勻，短時(shí)離心。

b.孔板放入PCR儀中，選擇MAPlex-2nd程序運(yùn)行2個(gè)小時(shí)。

四、PCR產(chǎn)物純化

步驟同二，做兩次純化，徹底去除引物二聚體。第一次使用28uL的磁珠純化，用20uL的NFW洗脫；第二次用20uL的磁珠純化，用25uL的NFW洗脫。

五、電泳鑒定

每個(gè)樣品取5uL，進(jìn)行2.5％的瓊脂糖電泳，觀察是否有條帶，以及條帶長(zhǎng)度是否在300-400bp之間。

實(shí)施例5.文庫(kù)定量與混合

a.將標(biāo)準(zhǔn)品、熒光定量試劑、引物從-20℃取出放置于冰上融化。

b.樣品稀釋10000倍，分兩次梯度稀釋。第一次取文庫(kù)原液2uL，加入198uL的NFW，振蕩混勻或者用槍吹打混勻，短時(shí)離心。再?gòu)闹腥〕?0uL，加入990uL NFW，振蕩混勻或者用槍吹打混勻，短時(shí)離心。

c.配置反應(yīng)體系10uL，,按照理論值的125％配，震蕩混勻，短時(shí)離心。

d.打開(kāi)ABI7500熒光定量PCR儀，放入樣品，開(kāi)始檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)束，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果將所有樣品稀釋到同樣濃度，使終濃度不小于2.5nmol/L，體積不小于30uL，再等量混合后，送出測(cè)序。

e.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，MAPlex custom panel中包含100個(gè)SNPs，基因組DNA起始量是250ng，通過(guò)MAPlex方法建庫(kù)，HiSeq2500測(cè)序平臺(tái)PE 2*150測(cè)序，單個(gè)樣本取100Mb數(shù)據(jù)，上靶率93％，平均深度為321×，92％的位點(diǎn)測(cè)序深度在20×以上，可重復(fù)性100％。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海美迪維康生物科技有限公司

<120> 基于多重PCR的二代測(cè)序建庫(kù)技術(shù)

<130> 123

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

caagcagaag acggcatacg ag 22