一種硒脲彈頭及其構建方法與流程
本發(fā)明屬于藥物化學領域，具體涉及一種含硒類化合物及其制備技術。
背景技術：
作為一種主要的翻譯后修飾，賴氨酸側鏈?；捌淙ヵ；言诮曜C明能有效地調節(jié)細胞內被修飾蛋白質的結構和功能[1-3]。細胞內蛋白賴氨酸側鏈?；叭ヵ；且粋€動態(tài)過程，其中的?；梢允禽^小的乙?；?acetyl)也可以是較龐大的丁二?；?succinyl)或十四酰基(myristoyl)。需要指出的是，根據現有的知識，?；梢允敲复呋倪^程(比如被乙酰轉移酶家族成員(protein lysine acetyltransferases)所催化)[4]也可以是非酶催化的過程[5]，而去?；敲复呋倪^程，即被蛋白?；嚢彼崛ヵ；讣易宄蓡T(protein acyl-lysine deacylases)所催化[6-8]。
Sirtuin代表一類細胞內蛋白?；嚢彼崛ヵ；竅7,8]。Sirtuin能催化NAD+和?；嚢彼岬目s合，形成去酰化的產物以及煙酰胺(nicotinamide)和2’-O-AADPR?，F有研究表明，除了組蛋白(histones)，sirtuin也接受其它細胞內蛋白質作為天然底物[9]。從細菌到人類的各種活性生物體中均已發(fā)現了sirtuin[10]。酵母中的沉默信息調節(jié)蛋白2(Sir2)是所發(fā)現的首例sirtuin；它的蛋白乙酰賴氨酸去乙酰催化活性是在2000年被發(fā)現的[11]。迄今為止，哺乳類動物和人體中已發(fā)現了7個sirtuin，即SIRT1,SIRT2,SIRT3,SIRT4,SIRT5,SIRT6,SIRT7。SIRT1,SIRT2和SIRT3均能有效地催化去除較小的乙酰基(acetyl)和較龐大的十四?；?myristoyl)；SIRT5能有效地催化去除丁二?；?succinyl)；SIRT6能有效地催化去除十四酰基(myristoyl)[1,7]。
Sirtuin催化的去?；磻驯蛔C明能有效地調節(jié)一些非常重要的生命過程，比如基因轉錄，細胞凋亡，DNA損傷修復，代謝[12-14]，并且該去?；磻囊种票徽J為是當今發(fā)展針對一些人類疾病(比如癌癥和代謝疾病)的一個重要新型策略[15-17]。Sirtuin抑制劑也應能幫助更進一步探索抑制sirtuin催化的去?；磻闹委煗摿?。
現有的sirtuin抑制劑主要由兩大途徑獲得[7,15,18]：化合物庫篩選(包括虛擬篩選)和sirtuin催化機制導向的設計。后者是由本申請發(fā)明人課題組(在美國Akron大學期間)和John M.Denu教授課題組(美國Wisconsin大學Madison分校)所開拓的一個重要領域[19,20]。到目前為止，多種sirtuin催化機制導向的抑制劑所賴以發(fā)揮sirtuin抑制功效的催化機制導向的sirtuin抑制彈頭已被發(fā)現[7,18]；但是在所有的彈頭當中，目前只有硫脲彈頭能被sirtuin催化形成一個絕對不能夠被繼續(xù)催化轉化的中間體(即化學穩(wěn)定的異硫脲中間體)；而其它的彈頭被sirtuin催化形成的中間體仍然能夠緩慢地被sirtuin繼續(xù)催化轉化形成終產物，以至于削弱對于sirtuin的抑制功效。然而，
硫的極化度和親核性相對于硒來說都較小，所以硫脲彈頭在sirtuin催化下與NAD+的親核取代反應的能力比硒脲要差，并且硫脲的抗氧化能力也比硒脲的要弱。
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技術實現要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種硒脲彈頭及其構建方法，以提高之前報道的硫脲彈頭的極化度和親核性，且提高其抗氧化能力。
現已存在的sirtuin原型抑制彈頭及其衍生型彈頭主要包括硫?；嚢彼犷?目前最強但是側鏈硫酰胺在體內代謝后能呈現肝毒性)和硫脲類(也較強，能避開硫酰基賴氨酸的代謝毒性問題，并且具有抗氧化功效)。為了更進一步優(yōu)化硫脲類sirtuin抑制彈頭，本發(fā)明中發(fā)展了硒脲類sirtuin抑制彈頭。硫脲類(或者硒脲類)彈頭被sirtuin催化處理得到穩(wěn)定的異硫脲(或者異硒脲)中間體，以至于抑制sirtuin的催化活性。
為了解決以上技術問題，本發(fā)明采用的具體技術方案如下：
一種硒脲彈頭的構建方法，其特征在于包括以下步驟：
步驟一，甲酰胺充分溶解于經過干燥的二氯甲烷(DCM)中，加入伯吉斯試劑，加熱回流反應至完全反應，生成淡黃色液體；在所述淡黃色液體中加DCM稀釋后，加入蒸餾水分液，洗去過量的伯吉斯試劑以及相關副產物，得到有機層A；對所述有機層A加入飽和食鹽水分液，分離掉過量的水，得有機層B；在有機層B中加入無水硫酸鈉干燥處理，經過濾、旋蒸后，得到產物一；在所述加熱回流反應過程中，需要防止空氣中的水汽進入反應體系；甲酰胺與DCM的比例為1mmol比2ml～5ml；甲酰胺與伯吉斯試劑摩爾比為1：1.2～1.6；
步驟二，將產物一充分溶解于四氫呋喃(THF)中，加入三乙胺及硒粉并加熱回流至充分反應，生成深黃色液體；對所述深黃色液體使用硅藻土過濾，得濾液，經旋干、稀鹽酸酸化后，加乙酸乙酯萃取兩次，得有機層C；對有機層C用蒸餾水洗去過量的酸后，再用飽和食鹽水分離掉過量的水，用無水硫酸鈉干燥，過濾取有機層并經旋蒸后，得產物二；所述步驟二為無水無氧反應；產物一與THF的比例為1mmol比10ml～15ml；產物一與三乙胺及
硒粉的摩爾比是1比0.7比3；
所述產物二為R1-N＝C＝Se結構通式(I)；R1是甲基(CH3)或CH2CH2COOR2或或CH2-(CH)10-CH3、CH2-(CH)11-CH3、CH2-(CH)12-CH3、CH2-(CH)13-CH3、CH2-(CH)14-CH3中的任意一種；R2是任何烷基、芳基或芳烷基；
步驟三，將載體或帶有保護基團的載體充分溶解于混合溶劑A中，第一次加入三乙胺，調pH至7～8，第二次加入三乙胺，再加入上述產物二，之后混勻，放置在零下80攝氏度4.5～5.5min以減緩初始反應速率，然后在4攝氏度環(huán)境下充分反應，之后將反應物濃縮然后直接用硅膠柱層析法或者高效液相色譜法(HPLC)純化，或使反應物經三氟乙酸處理后進行冰乙醚沉降處理然后用高效液相色譜法(HPLC)純化；之后得到中間產物；所述的混合溶劑A為N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和超純水(ddH2O)的混合物，體積比為50:13；載體和混合溶劑A的比例關系為1mmol/15.75mL；所述的第二次加入三乙胺的量與載體的摩爾比為1:1；
步驟四，對上述中間產物進行處理，使R1中的保護基團離去，純化后，得到最終產物即帶有載體的硒脲彈頭。
所述的甲酰胺為R1NHCHO結構通式(II)；R1是甲基(CH3)或CH2CH2COOR2或或CH2-(CH)10-CH3、CH2-(CH)11-CH3、CH2-(CH)12-CH3、CH2-(CH)13-CH3、CH2-(CH)14-CH3中的任意一種；R2是任何烷基、芳基或芳烷基。
3、根據權利要求1所述的一種硒脲彈頭的構建方法，其特征在于：所述步驟三中載體或帶有保護基團的載體包含以下結構：
所述載體或帶有保護基團的載體為：
一種根據所述的構建方法得到的帶有載體的硒脲彈頭，其特征在于具有下列結構通式(III)：
R1是甲基(CH3)或CH2CH2COOH或CH2CH2COOR2或或
CH2-(CH)10-CH3、CH2-(CH)11-CH3、CH2-(CH)12-CH3、CH2-(CH)13-CH3、CH2-(CH)14-CH3中的任意一種；R2是任何烷基、芳基或芳烷基。
所述的帶有載體的硒脲彈頭，其特征在于所述結構通式(III)為具有以下結構通式(IV)的化合物：
R1是甲基(CH3)或CH2CH2COOH或CH2CH2COOR2或或
CH2-(CH)10-CH3、CH2-(CH)11-CH3、CH2-(CH)12-CH3、CH2-(CH)13-CH3、CH2-(CH)14-CH3中的任意一種；R2是任何烷基、芳基或芳烷基。
所述的帶有載體的硒脲彈頭，其特征在于所述結構通式(III)為具有以下結構通式(V)的化合物：
R1是甲基(CH3)或CH2CH2COOH或CH2CH2COOR2或或
CH2-(CH)10-CH3、CH2-(CH)11-CH3、CH2-(CH)12-CH3、CH2-(CH)13-CH3、CH2-(CH)14-CH3中的任意一種；R2是任何烷基、芳基或芳烷基。
所述的帶有載體的硒脲彈頭，其特征在于所述結構通式(III)為具有以下結構通式(VI)的化合物：
R1是甲基(CH3)或CH2CH2COOH或CH2CH2COOR2或或
CH2-(CH)10-CH3、CH2-(CH)11-CH3、CH2-(CH)12-CH3、CH2-(CH)13-CH3、CH2-(CH)14-CH3中的任意一種；R2是任何烷基、芳基或芳烷基。
所述的帶有載體的硒脲彈頭，其特征在于所述結構通式(III)為具有以下結構通式(VII)的化合物：
R1是甲基(CH3)或CH2CH2COOH或CH2CH2COOR2或或
CH2-(CH)10-CH3、CH2-(CH)11-CH3、CH2-(CH)12-CH3、CH2-(CH)13-CH3、CH2-(CH)14-CH3中的任意一種；R2是任何烷基、芳基或芳烷基。
所述的帶有載體的硒脲彈頭，其特征在于所述結構通式(III)為具有以下結構通式(VIII)的化合物：
R1是甲基(CH3)或CH2CH2COOH或CH2CH2COOR2或或
CH2-(CH)10-CH3、CH2-(CH)11-CH3、CH2-(CH)12-CH3、CH2-(CH)13-CH3、CH2-(CH)14-CH3中的任意一種；R2是任何烷基、芳基或芳烷基。
以上所述任意一項的化合物在制備所有sirtuin催化活性抑制劑中的用途。
本發(fā)明具有有益效果。因為硒比硫有著更高的極化度以至于更強的親核性，所以通過本發(fā)明的構建方法得到的硒脲彈頭比之前報道的硫脲彈頭更容易進行sirtuin催化的第一步與NAD+的親核取代反應，以及比硫脲彈頭具有更強的抗氧化能力。所以本發(fā)明的硒脲類sirtuin抑制彈頭比硫脲類的sirtuin抑制彈頭更優(yōu)越。硒脲類sirtuin抑制彈頭的發(fā)展將極大地促進發(fā)展有效的sirtuin抑制劑作為新型的治療人類疾病的藥物。
附圖說明
圖1中從左到右分別為含有硒脲類SIRT5，SIRT1/2/3，SIRT6抑制彈頭的三個抑制劑。
圖2為本發(fā)明的硒脲類SIRT5抑制劑的合成方案。
圖3為本發(fā)明的硒脲類SIRT1/2/3抑制劑的合成方案。
圖4為本發(fā)明的硒脲類SIRT6抑制劑的合成方案。
圖5為本發(fā)明的另一個硒脲類SIRT5抑制劑的合成方案。
具體實施例
下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明的技術方案做進一步的詳細說明。需要指出的是，本發(fā)明人課題組在之前的工作中(參見：Zang,W.；Hao,Y.；Wang,Z.；Zheng,W.Bioorg.Med.Chem.Lett.2015,25,3319-3324；Liu,J.；Zheng,W.Org.Biomol.Chem.2016,14,5928-5935)運用了圖1中的肽骨架將硫脲類的抑制彈頭裝入以評估各個彈頭的sirtuin抑制強度，所示的三個彈頭的硫脲版是本申請發(fā)明人課題組之前所發(fā)現的最強的硫脲類SIRT5,SIRT1/2/3,SIRT6抑制彈頭，所以這些同樣的肽骨架也被用于裝入硒脲類sirtuin抑制彈頭以評估它們對于sirtuin的抑制強度，如圖1所示。
實施例1.一個含有硒脲類SIRT5抑制彈頭的抑制劑(圖1)的化學合成。該化合物的合成過程如圖2所示，具體步驟如下：
步驟一.3mmol H3COOC(CH2)2NHCHO溶于15ml的DCM中，加3.6mmol伯吉斯試劑，回流反應2h，生成黃色液體；加10ml的DCM稀釋，用10ml蒸餾水分液兩次，棄水層；5ml的飽和食鹽水分液，保留有機層。往有機層中加入無水硫酸鈉干燥，經過濾，旋蒸，得到產物一。
步驟二.將產物一充分溶解于30ml的四氫呋喃(THF)中，加入三乙胺及0.48g硒粉加熱回流至充分反應，生成深黃色液體；對所述深黃色液體使用硅藻土過濾，得濾液，經旋蒸、稀鹽酸酸化后，再加乙酸乙酯萃取兩次，得有機層；對有機層繼續(xù)用蒸餾水洗去過量的酸后，再用飽和食鹽水分離掉過量的水，用無水硫酸鈉干燥，過濾取有機層并經旋蒸后，得產物二。所述步驟二為無水無氧反應。
步驟三.稱取0.02mmol賴氨酸三聚體，加三乙胺調pH到7，再加入2.8 l三乙胺。同時取5μl的產物二溶于250μlDMF和65 l水的混和溶劑中。所配制的兩個溶液混合后，先在零下80攝氏度存放4.5min，然后在4攝氏度反應2h，之后用冰乙醚沉降得到產物三。
步驟四.將產物三溶解于甲醇125μl和超純水42μl的混合溶劑中，加入2.1mg氫氧化鋰一水合物(LiOH·H2O)，混合均勻，放置在零下80攝氏度4.5min以減緩初始反應速率，然后在4攝氏度環(huán)境下充分反應，鹽酸酸化后進行冰乙醚沉降處理并使用高效液相色譜法(HPLC)純化，得到硒脲類SIRT5抑制彈頭及含有它的硒脲類SIRT5抑制劑。
實施例2.一個含有硒脲類SIRT1/2/3抑制彈頭的抑制劑(圖1)的化學合成。該化合物的合成過程如圖3所示，具體步驟如下：
步驟一.2mmol CH3NHCHO溶于6ml的DCM中，加3mmol伯吉斯試劑，回流反應2h；加5ml的DCM稀釋，用5ml蒸餾水分液兩次，棄水層；2ml飽和食鹽水分液，保留有機層。有機層中加入無水硫酸鈉干燥，經過濾，旋蒸，得到產物一。
步驟二.將產物一充分溶解于24ml四氫呋喃(THF)中，加入三乙胺及0.72g硒粉加熱回流5h，生成粗品；對所述粗品使用硅藻土過濾，得濾液，經旋整、稀鹽酸酸化后，再加乙酸乙酯萃取兩次，得有機層；對有機層繼續(xù)用蒸餾水洗去過量的酸后，再用飽和食鹽水分離掉過量的水，用無水硫酸鈉干燥，過濾取有機層并經旋蒸后，得產物二。所述步驟二為無水無氧反應。
步驟三.稱取0.02mmol賴氨酸三聚體，加三乙胺調pH到7，再加入2.8 l三乙胺。同時取5μl的產物二溶于250μlDMF和65 l水的混和溶劑中。所配制的兩個溶液混合后，先在零下80攝氏度存放5min，然后在4攝氏度反應2h，之后用冰乙醚沉降產物并使用高效液相色譜法(HPLC)純化，得到硒脲類SIRT1/2/3抑制彈頭及含有它的硒脲類SIRT1/2/3抑制劑。
實施例3.一個含有硒脲類SIRT6抑制彈頭的抑制劑(圖1)的化學合成。該化合物的合成過程如圖4所示。
步驟一.通過固相多肽合成(SPPS)的方法，側鏈完全保護的五肽被接在MBHA樹脂上。
步驟二.經1％的TFA/DMF溶液處理，中間位置的賴氨酸側鏈被選擇性地脫保護釋放出游離的氨基。
步驟1a.1mmol H3C(CH2)11NHCHO溶于10ml的DCM，加1.6mmol伯吉斯試劑，回流反應3h；加5ml的DCM稀釋，用15ml蒸餾水分液兩次，棄水層；10ml飽和食鹽水分液，保留有機層；有機層中加入無水硫酸鈉干燥，經過濾，旋蒸，得到產物一。
步驟1b.將產物一充分溶解于15ml四氫呋喃(THF)中，加入0.97ml三乙胺及0.24g硒粉加熱回流至充分反應，生成粗品；對所述粗品使用硅藻土過濾，得濾液，經旋蒸、稀鹽酸酸化后，再加乙酸乙酯萃取兩次，得有機層；對有機層繼續(xù)用蒸餾水洗去過量的酸后，再用飽和食鹽水分離掉過量的水，用無水硫酸鈉干燥，過濾取有機層并經旋蒸后，得產物二。所述步驟1b為無水無氧反應。
步驟三.取5μl的產物二溶于250μl DMF和65 l水的混和溶劑中，然后將此溶液與步驟二得到的樹脂混合，先在零下80攝氏度存放5.5min，之后在4攝氏度反應2h，然后樹脂用DMF和DCM洗滌，并用真空泵干燥，得到仍連接在樹脂上的含有硒脲類SIRT6抑制彈頭的側鏈完全保護的五肽。
步驟四.步驟三得到的干燥樹脂與TFA/DCM/H2O的混合溶劑混勻，在室溫反應4h后過濾，濾液經旋蒸濃縮后用冰乙醚沉降產物并使用高效液相色譜法(HPLC)純化，得到硒脲類SIRT6抑制彈頭及含有它的硒脲類SIRT6抑制劑。
實施例4.另一個含有硒脲類SIRT5抑制彈頭的抑制劑的化學合成。該化合物的合成如圖5所示，具體過程如下：
步驟一.3mmol H3COOC(CH2)2NHCHO溶于15ml的DCM中，加3.6mmol伯吉斯試劑，回流反應2h，生成黃色液體；加10ml的DCM稀釋，用10ml蒸餾水分液兩次，棄水層；5ml飽和食鹽水分液，保留有機層；有機層中加入無水硫酸鈉干燥，經過濾，旋蒸，得到產物一。
步驟二.將產物一充分溶解于30ml四氫呋喃(THF)中，加入三乙胺及0.48g硒粉加熱回流至充分反應，生成深黃色液體；對所述深黃色液體使用硅藻土過濾，得濾液，經旋蒸、稀鹽酸酸化后，再加乙酸乙酯萃取兩次，得有機層；對有機層繼續(xù)用蒸餾水洗去過量的酸后，再用飽和食鹽水分離掉過量的水，用無水硫酸鈉干燥，過濾取有機層并經旋蒸后，得產物二。所述步驟二為無水無氧反應。
步驟三.取5μl的產物二溶于250μl DMF和65 l水的混合溶劑中，然后將此溶液與0.02mmol如圖5所示的環(huán)肽混合，先在零下80攝氏度存放4.5min，之后在4攝氏度反應2h，旋蒸后得到產物三。
步驟四.產物三與TFA/DCM/H2O的混合溶劑混勻，在室溫反應4h后旋蒸濃縮，之后用冰乙醚沉降產物并使用高效液相色譜法(HPLC)純化，得到產物四。
步驟五.產物四然后溶解于甲醇125μl和超純水42μl的混合溶劑中，加入2.1mg氫氧化鋰一水合物(LiOH·H2O)，混合均勻，放置在零下80攝氏度4.5min以減緩初始反應速率，然后在4攝氏度環(huán)境下充分反應，鹽酸酸化后進行冰乙醚沉降處理并使用高效液相色譜法(HPLC)純化，得到最終產物即另一個含有硒脲類SIRT5抑制彈頭的抑制劑。
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