本發(fā)明涉及醫(yī)用試劑盒技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒及其應(yīng)用方法。

背景技術(shù)：

大腸癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，也是我國發(fā)病率上升最快的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均排在癌癥譜的前三位。原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是建立大腸癌體外研究模型，進(jìn)而研究大腸癌的有效手段，同時(shí)也是分離純化大腸癌細(xì)胞株的必要步驟，因而對于大腸癌的研究具有極為重要的意義。

但是，總體看來，對大腸癌直接進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)的成功率較低，僅為9％-30％。

現(xiàn)有技術(shù)中，影響大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)成功率的因素主要包括：

首先，腸道中細(xì)菌豐富，大腸癌標(biāo)本極易污染，需要多種抗生素及消毒劑反復(fù)處理，滅菌過程非常繁瑣，且效果難以保證。

其次，對于大腸癌標(biāo)本的處理缺乏簡捷、標(biāo)準(zhǔn)的流程，組織細(xì)胞的分離與消化過程缺乏有效的方法，導(dǎo)致培養(yǎng)成功率低下。

第三，原代培養(yǎng)基的成分直接決定了成功率的高低，原代細(xì)胞培養(yǎng)基需要添加多種激素、細(xì)胞因子和其它營養(yǎng)物質(zhì)，以保證腫瘤細(xì)胞的生長增殖。傳統(tǒng)的方法要么成分不足，細(xì)胞生長緩慢；要么配方復(fù)雜，配置過程繁瑣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒及其應(yīng)用方法，其能夠提高大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)的成功率，從而更加適于實(shí)用。

為了達(dá)到上述第一個(gè)目的，本發(fā)明提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒包括第一試劑、第二試劑、第三試劑、第四試劑和第五試劑，

所述第一試劑中的有效成分包括絡(luò)合碘，其有效碘的質(zhì)量濃度為5000mg/L；

所述第二試劑中的有效成分及物質(zhì)的量濃度包括：EDTA，0.5mmol/L；NaCl，137mmol/L；KCl，2.7mmol/L；Na₂HPO₄·12H₂O，10mmol/L；K₂HPO₄，1.76mmol/L

所述第三試劑中的有效成分包括NaClO，其質(zhì)量百分含量的取值范圍為8％～12％；

所述第四試劑中的有效成分及質(zhì)量濃度包括：膠原酶I，10mg/mL；膠原酶Ⅱ，10mg/mL；膠原酶IV，5mg/L；

所述第五試劑中的有效成分及含量包括：EGF，5μg；Y27632，1.6mg；氫化可的松，250μg；霍亂毒素，4.2μg；PBS溶液：5mL；

所述第一試劑、第二試劑、第三試劑、第四試劑、第五試劑分別單獨(dú)封裝，其中，所述第一試劑、第二試劑、第三試劑、第四試劑、第五試劑的體積份數(shù)比為200mL∶200mL∶20mL∶5mL∶5mL。

本發(fā)明提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒還可采用以下技術(shù)措施進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)。

作為優(yōu)選，所述第一試劑的保存條件包括常溫、避光。

作為優(yōu)選，所述第二試劑的保存條件包括常溫。

作為優(yōu)選，所述第三試劑的保存條件包括常溫、避光。

作為優(yōu)選，所述第四試劑的保存條件包括0℃～4℃溫度下保存0.5個(gè)月～1.5個(gè)月。

作為優(yōu)選，所述第五試劑的保存條件包括0℃～4℃溫度下保存0.5個(gè)月～1.5個(gè)月。

作為優(yōu)選，所述大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒還包括第一封裝容器、第二封裝容器、第三封裝容器、第四封裝容器、第五封裝容器和卡盤，

所述第一封裝容器用于封裝所述第一試劑，所述第二封裝容器用于封裝所述第二試劑，所述第三封裝容器用于封裝所述第三試劑，所述第四封裝容器用于封裝所述第四試劑，所述第五封裝容器用于封裝所述第五試劑；

所述卡盤包括卡盤本體，所述卡盤本體上至少設(shè)有第一通孔、第二通孔、第三通孔、第四通孔和第五通孔；

所述第一封裝容器能夠穿設(shè)于所述第一通孔中，所述第二封裝容器能夠穿設(shè)于所述第二通孔中，所述第三封裝容器能夠穿設(shè)于所述第三通孔中，所述第四封裝容器能夠穿設(shè)于所述第四通孔中，所述第五封裝容器能夠穿設(shè)于所述第五通孔中。

作為優(yōu)選，

所述第一封裝容器與所述第一通孔間隙配合；和/或，

所述第二封裝容器與所述第二通孔間隙配合；和/或，

所述第三封裝容器與所述第三通孔間隙配合；和/或，

所述第四封裝容器與所述第四通孔間隙配合；和/或，

所述第五封裝容器與所述第五通孔間隙配合。

作為優(yōu)選，所述第一封裝容器和/或第二封裝容器和/或第三封裝容器和/或第四封裝容器和/或第五封裝容器的底面呈圓弧狀過渡。

作為優(yōu)選，所述大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒還包括包裝盒，所述包裝盒包括盒體，所述盒體的橫截面形狀與所述卡盤的形狀相適配。

作為優(yōu)選，所述包裝盒還包括上蓋，所述上蓋能夠覆蓋住所述盒體。

作為優(yōu)選，所述上蓋與所述盒體為分體式結(jié)構(gòu)。

作為優(yōu)選，所述上蓋與所述盒體之間鉸接。

作為優(yōu)選，所述盒體上設(shè)有一卡扣結(jié)構(gòu)的子端，所述上蓋上設(shè)有所述卡扣結(jié)構(gòu)的母端，所述子端與所述母端相適配。

作為優(yōu)選，所述卡盤的形狀選自矩形或者圓形。

為了達(dá)到上述第二個(gè)目的，本發(fā)明提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒的應(yīng)用方法的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒的應(yīng)用方法包括以下步驟：

取200mg～500mg大腸癌腫瘤組織，于超凈工作臺中將所述大腸癌腫瘤組織置入第一離心管，得到第一產(chǎn)物；

于超凈工作臺中向所述第一產(chǎn)物中加入所述第一試劑，所述第一試劑的加入量的取值范圍為10mL～25mL，并混勻，得到第二產(chǎn)物；

于超凈工作臺吸凈所述第一離心管內(nèi)的第一試劑后，將處于所述第一離心管內(nèi)的大腸癌腫瘤組織置入第二離心管，得到第三產(chǎn)物；

向所述第三產(chǎn)物中加入所述第二試劑，所述第二試劑的加入量的取值范圍為10mL～25mL，并混勻，得到第四產(chǎn)物；

于超凈工作臺上配置所述第三試劑的PBS稀釋液，其中，在稀釋時(shí)，所述第三試劑與PBS溶液的體積比的取值范圍為1∶(6～12)；

于超凈工作臺上取出所述第二離心管中的腫瘤組織置入到第三離心管中，并向所述第三離心管中加入10mL～25mL所述第三試劑的PBS稀釋液，混勻后得到第五產(chǎn)物；

于超凈工作臺上取出所述第三離心管中的大腸癌腫瘤組織置入到第四離心管中，向所述第四離心管中加入10mL～25mL無菌PBS緩沖液，混勻后置于搖床40-60rpm轉(zhuǎn)速下5-10分鐘，并重復(fù)此步驟；

于超凈工作臺上吸凈所述第四離心管內(nèi)的PBS緩沖液后，將大腸癌腫瘤組織置入組織凍存管中，得到第六產(chǎn)物；

應(yīng)用無菌剪刀將所述第六產(chǎn)物剪碎，得到第七產(chǎn)物；

向所述第七產(chǎn)物中加入200μL～500μL所述第四試劑后將其置于37℃孵箱，第一次孵育50-60分鐘，使得所述第七產(chǎn)物消化后，得到第八產(chǎn)物；

向300mL～600mL含有8％～15％(wt)胎牛血清及抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基中加入所述第五試劑并混勻，得到孵育培養(yǎng)基；

于超凈工作臺上將所述第八產(chǎn)物移入培養(yǎng)皿后，向所述培養(yǎng)皿內(nèi)加入所述孵育培養(yǎng)基，并于37℃條件下在孵箱中進(jìn)行大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)。

本發(fā)明提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒的應(yīng)用方法還可采用以下技術(shù)措施進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)。

作為優(yōu)選，所述混勻的方法包括顛倒和/或應(yīng)用搖床。

作為優(yōu)選，于超凈工作臺上將所述第八產(chǎn)物移入培養(yǎng)皿后，還包括靜置5min～10min的步驟。

作為優(yōu)選，應(yīng)用無菌剪刀將所述第六產(chǎn)物剪碎，得到第七產(chǎn)物過程中，所述第六產(chǎn)物被剪碎的標(biāo)志是所述第六產(chǎn)物為糊狀，且其中無肉眼可見的團(tuán)塊。

本發(fā)明提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒在應(yīng)用過程中，應(yīng)用第一試劑進(jìn)行了一次消毒，之后，所有的操作都是在無菌的環(huán)境下進(jìn)行操作，相當(dāng)于提供了一種二步滅菌法，其不僅簡化了大腸癌標(biāo)本的處理流程，還能夠減少抗生素的使用，因此，能夠基本上實(shí)現(xiàn)零污染；并且，該試劑盒在應(yīng)用過程中應(yīng)用的消化方法是向第七產(chǎn)物中加入200μL～500μL第四試劑后將其置于37℃孵箱，第一次孵育40-60分鐘，使得第七產(chǎn)物消化，與單純機(jī)械分離相比，能夠減少大腸癌細(xì)胞在這一過程中的損失，并且能夠減少操作過程中的污染，并提高消化效率。此外，該試劑盒將大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)過程中應(yīng)用到的第一試劑、第二試劑、第三試劑、第四試劑和第五試劑分別單獨(dú)封裝，在應(yīng)用過程中，無需重復(fù)配制該各試劑，因此能夠使得操作過程得到簡化，從而提高大腸癌原代細(xì)胞的培養(yǎng)效率。

附圖說明

通過閱讀下文優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)描述，各種其他的優(yōu)點(diǎn)和益處對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將變得清楚明了。附圖僅用于示出優(yōu)選實(shí)施方式的目的，而并不認(rèn)為是對本發(fā)明的限制。而且在整個(gè)附圖中，用相同的參考符號表示相同的部件。在附圖中：

圖1為本發(fā)明實(shí)施例一提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒的盒體結(jié)構(gòu)示意圖(圖中，各試劑未示出)；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例一提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒中應(yīng)用的卡盤的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例二提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒的盒體結(jié)構(gòu)示意圖(圖中，各試劑未示出)；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例二提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒中應(yīng)用的卡盤的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例一或者實(shí)施例二提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒中應(yīng)用的第一封裝容器和/或第二封裝容器和/或第三封裝容器和/或第四封裝容器和/或第五封裝容器的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例三提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒的應(yīng)用方法步驟流程圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒及其應(yīng)用方法，其能夠提高大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)的成功率，從而更加適于實(shí)用。

為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明為達(dá)成預(yù)定發(fā)明目的所采取的技術(shù)手段及功效,以下結(jié)合附圖及較佳實(shí)施例，對依據(jù)本發(fā)明提出的大腸癌原代細(xì)胞試劑盒及其應(yīng)用方法，其具體實(shí)施方式、結(jié)構(gòu)、特征及其功效，詳細(xì)說明如后。在下述說明中，不同的“一實(shí)施例”或“實(shí)施例”指的不一定是同一實(shí)施例。此外，一或多個(gè)實(shí)施例中的特定特征、結(jié)構(gòu)、或特點(diǎn)可由任何合適形式組合。

本文中術(shù)語“和/或”，僅僅是一種描述關(guān)聯(lián)對象的關(guān)聯(lián)關(guān)系，表示可以存在三種關(guān)系，例如，A和/或B，具體的理解為：可以同時(shí)包含有A與B，可以單獨(dú)存在A，也可以單獨(dú)存在B，能夠具備上述三種任一種情況。

本發(fā)明提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒包括第一試劑、第二試劑、第三試劑、第四試劑和第五試劑。

第一試劑中的有效成分包括絡(luò)合碘，其有效碘的質(zhì)量濃度為5000mg/L；

第二試劑中的有效成分及物質(zhì)的量濃度包括：EDTA，0.5mmol/L；NaCl，137mmol/L；KCl，2.7mmol/L；Na₂HPO₄·12H₂O，10mmol/L；K₂HPO₄，1.76mmol/L

第三試劑中的有效成分包括NaClO，其質(zhì)量百分含量的取值范圍為8％～12％；

第四試劑中的有效成分及質(zhì)量濃度包括：膠原酶I，10mg/mL；膠原酶Ⅱ，10mg/mL；膠原酶IV，5mg/L；

第五試劑中的有效成分及含量包括：EGF，5μg；Y27632(廠家Abcam；貨號：ab120129；批號：GR195774-32)，1.6mg；氫化可的松，250μg；霍亂毒素，4.2μg；PBS溶液：5mL；

第一試劑、第二試劑、第三試劑、第四試劑、第五試劑分別單獨(dú)封裝，其中，第一試劑、第二試劑、第三試劑、第四試劑、第五試劑的體積份數(shù)比為200mL∶200mL∶20mL∶5mL∶5mL。

其中，第一試劑的保存條件包括常溫、避光。

其中，第二試劑的保存條件包括常溫。

其中，第三試劑的保存條件包括常溫、避光。

其中，第四試劑的保存條件包括0℃～4℃溫度下保存0.5個(gè)月～2個(gè)月。

其中，第五試劑的保存條件包括0℃～4℃溫度下保存0.5個(gè)月～2個(gè)月。

本實(shí)施例中，大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒還包括第一封裝容器(圖中未示出)、第二封裝容器(圖中未示出)、第三封裝容器(圖中未示出)、第四封裝容器(圖中未示出)、第五封裝容器(圖中未示出)和卡盤(附圖1和附圖2中標(biāo)號為101，附圖3和附圖4中標(biāo)號為201)。第一封裝容器(圖中未示出)用于封裝第一試劑，第二封裝容器(圖中未示出)用于封裝第二試劑，第三封裝容器(圖中未示出)用于封裝第三試劑，第四封裝容器(圖中未示出)用于封裝第四試劑，第五封裝容器(圖中未示出)用于封裝第五試劑。在附圖1和附圖2所示的實(shí)施例一中，卡盤101包括卡盤本體102，卡盤本體102上至少設(shè)有第一通孔103、第二通孔104、第三通孔105、第四通孔106和第五通孔107；第一封裝容器(圖中未示出)能夠穿設(shè)于第一通孔103中，第二封裝容器(圖中未示出)能夠穿設(shè)于第二通孔104中，第三封裝容器(圖中未示出)能夠穿設(shè)于第三通孔105中，第四封裝容器(圖中未示出)能夠穿設(shè)于第四通孔106中，第五封裝容器(圖中未示出)能夠穿設(shè)于第五通孔107中。在附圖3和附圖4所示的實(shí)施例二中，卡盤201包括卡盤本體202，卡盤本體202上至少設(shè)有第一通孔203、第二通孔204、第三通孔205、第四通孔206和第五通孔207；第一封裝容器(圖中未示出)能夠穿設(shè)于第一通孔203中，第二封裝容器(圖中未示出)能夠穿設(shè)于第二通孔204中，第三封裝容器(圖中未示出)能夠穿設(shè)于第三通孔205中，第四封裝容器(圖中未示出)能夠穿設(shè)于第四通孔206中，第五封裝容器(圖中未示出)能夠穿設(shè)于第五通孔207中。

其中，第一封裝容器(圖中未示出)與第一通孔(實(shí)施例一的103，實(shí)施例二的203)間隙配合；和/或，第二封裝容器(圖中未示出)與第二通孔(實(shí)施例一的104，實(shí)施例二的204)間隙配合；和/或，第三封裝容器(圖中未示出)與第三通孔(實(shí)施例一的105，實(shí)施例二的205)間隙配合；和/或，第四封裝容器(圖中未示出)與第四通孔(實(shí)施例一的106，實(shí)施例二的206)間隙配合；和/或，第五封裝容器(圖中未示出)與第五通孔(實(shí)施例一的107，實(shí)施例二的207)間隙配合。在這種情況下，由于各封裝容器(圖中未示出)在各通孔中的剩余活動(dòng)空間較小，能夠避免各封裝容器(圖中未示出)發(fā)生傾倒，避免各試劑的損失或者污染。

參見附圖5，第一封裝容器和/或第二封裝容器和/或第三封裝容器和/或第四封裝容器和/或第五封裝容器的底面呈圓弧狀過渡，本實(shí)施例中，標(biāo)號301概括表示各封裝容器，標(biāo)號302表示設(shè)置于各封裝容器底面的圓弧狀過渡，在這種情況下，能夠避免由于封裝容器底部的死角而導(dǎo)致的試劑中容質(zhì)的沉積，進(jìn)一步保證各封裝容器內(nèi)的各試劑均一穩(wěn)定，降低操作誤差。

其中，還包括包裝盒(實(shí)施例一中的108，實(shí)施例二中的208)，包裝盒(實(shí)施例一中的108，實(shí)施例二中的208)包括盒體(實(shí)施例一中的111，實(shí)施例二中的211)，盒體(實(shí)施例一中的111，實(shí)施例二中的211)的橫截面形狀與卡盤(實(shí)施例一中的101，實(shí)施例二中的201)的形狀相適配，在這種情況下，能夠保證卡盤(實(shí)施例一中的101，實(shí)施例二中的201)在盒體(實(shí)施例一中的109，實(shí)施例二中的209)內(nèi)與側(cè)壁(實(shí)施例一中的111，實(shí)施例二中的211)之間不發(fā)生傾斜，更進(jìn)一步避免各封裝容器(圖中未示出)發(fā)生傾倒，避免各試劑的損失或者污染。

其中，包裝盒(實(shí)施例一中的108，實(shí)施例二中的208)還包括上蓋(實(shí)施例一中的112，實(shí)施例二中的212)，上蓋(實(shí)施例一中的112，實(shí)施例二中的212)能夠覆蓋住盒體(實(shí)施例一中的109，實(shí)施例二中的209)，在這種情況下，能夠避免本發(fā)明提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒在運(yùn)輸或者攜帶過程中，各封裝容器(圖中未示出)丟失。

其中，參見附圖3，在本發(fā)明實(shí)施例二提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒208中，作為上蓋212與盒體209之間的一種配合方式，上蓋212與盒體209之間可以為分體式結(jié)構(gòu)。在這種前提下，上蓋212與盒體209之間還可以采用螺紋連接或者嵌合配合的方式實(shí)現(xiàn)配合。

其中，參見附圖1，在本發(fā)明實(shí)施例一提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒108中，作為上蓋112與盒體109之間的又一種配合方式，上蓋112與盒體109之間鉸接。本實(shí)施例中，上蓋112與盒體109通過其側(cè)壁的其中一條邊沿116實(shí)現(xiàn)鉸接，上蓋112可以以該邊沿116為旋轉(zhuǎn)中心旋轉(zhuǎn)，實(shí)現(xiàn)上蓋112的開啟或者關(guān)閉，此時(shí)，該盒體的材質(zhì)可以為紙、塑料等材質(zhì)；有時(shí)，為了使得該鉸接更加合理，還可以在該處設(shè)置合頁等配件。

本實(shí)施例中，上蓋112的一端還設(shè)有蓋緣113，此時(shí)，當(dāng)上蓋110覆蓋住盒體109時(shí)，該蓋緣113能夠附著在盒體109的側(cè)壁111上，能夠進(jìn)一步地保證盒體109被上蓋110全面覆蓋，從而保證盒體109的封裝效果。

其中，盒體(實(shí)施例一的109，實(shí)施例二的209)上設(shè)有一卡扣結(jié)構(gòu)的子端(實(shí)施例一的114，實(shí)施例二的214)，上蓋(實(shí)施例一的110，實(shí)施例二的210)上設(shè)有卡扣結(jié)構(gòu)的母端(實(shí)施例一的115，實(shí)施例二的215)，子端(實(shí)施例一的114，實(shí)施例二的214)與母端(實(shí)施例一的115，實(shí)施例二的215)相適配。此時(shí)，能夠避免上蓋(實(shí)施例一的110，實(shí)施例二的210)從盒體(實(shí)施例一的109，實(shí)施例二的209)上丟失，進(jìn)一步降低各封裝容器(圖中未示出)丟失的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

其中，卡盤的形狀選自矩形(實(shí)施例一)或者圓形(實(shí)施例二)。

參見附圖6，本發(fā)明提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒的應(yīng)用方法包括以下步驟：

步驟S1：取200mg～500mg大腸癌腫瘤組織，于超凈工作臺中將大腸癌腫瘤組織置入第一離心管并混勻，得到第一產(chǎn)物；

步驟S2：向第一產(chǎn)物中加入第一試劑，第一試劑的加入量的取值范圍為10mL～25mL，并混勻，得到第二產(chǎn)物，蓋緊蓋子，室溫下置于搖床40rpm～60rpm，15min～20min；

步驟S3：于超凈工作臺吸凈第一離心管內(nèi)的第一試劑后，將處于第一離心管內(nèi)的大腸癌腫瘤組織置入第二離心管，得到第三產(chǎn)物；

步驟S4：向第三產(chǎn)物中加入第二試劑，第二試劑的加入量的取值范圍為10mL～25mL，并混勻，得到第四產(chǎn)物，蓋緊蓋子，室溫下置于搖床40rpm～60rpm，8min～10min；

步驟S5：于超凈工作臺上配置第三試劑的PBS稀釋液，其中，在稀釋時(shí)，第三試劑與PBS溶液的體積比的取值范圍為1∶(6～12)；

步驟S6：于超凈工作臺上取出第二離心管中的腫瘤組織置入到第三離心管中，并向第三離心管中加入10mL～25mL第三試劑的PBS稀釋液，混勻后得到第五產(chǎn)物，蓋緊蓋子，室溫下置于搖床40rpm～60rpm，15min～20min；

步驟S7：于超凈工作臺上取出第三離心管中的大腸癌腫瘤組織置入到第四離心管中，向第四離心管中加入10mL～25mL無菌PBS緩沖液，混勻后取出，置入第五離心管，并重復(fù)此步驟，直至使得大腸癌腫瘤組織置入到第N離心管；

步驟S8：于超凈工作臺上吸凈第N離心管內(nèi)的PBS緩沖液后，將處于第N離心管內(nèi)的大腸癌腫瘤組織置入組織凍存管中，得到第六產(chǎn)物；

步驟S9應(yīng)用無菌剪刀將第六產(chǎn)物剪碎，得到第七產(chǎn)物；

步驟S10：向第七產(chǎn)物中加入200μL～500μL第四試劑后將其置于37℃孵箱，第一次孵育1h以上，使得第七產(chǎn)物消化后，得到第八產(chǎn)物；

步驟S11：向300mL～600mL含有8％～15％(wt)胎牛血清及抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基中加入第五試劑并混勻，得到孵育培養(yǎng)基；

步驟S12：于超凈工作臺上將第八產(chǎn)物移入培養(yǎng)皿后，向培養(yǎng)皿內(nèi)加入孵育培養(yǎng)基，并于37℃條件下在孵箱中進(jìn)行大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)。

其中，混勻的方法包括顛倒和/或應(yīng)用搖床。

其中，于超凈工作臺上將第八產(chǎn)物移入培養(yǎng)皿后，還包括靜置5min～10min的步驟，從而保證消化后的腫瘤組織均勻地鋪滿培養(yǎng)皿底部，增強(qiáng)大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)的穩(wěn)定性。

其中，應(yīng)用無菌剪刀將第六產(chǎn)物剪碎，得到第七產(chǎn)物過程中，第六產(chǎn)物被剪碎的標(biāo)志是第六產(chǎn)物為糊狀，且其中無肉眼可見的團(tuán)塊。

實(shí)施例3～22表1

實(shí)施例3～22續(xù)表1-2

實(shí)施例3～22續(xù)表1-3

本發(fā)明提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒在應(yīng)用過程中，應(yīng)用第一試劑進(jìn)行了一次消毒，之后，所有添加試劑和處理組織的操作都是在無菌的環(huán)境下進(jìn)行，相當(dāng)于提供了一種二步滅菌法，其不僅簡化了大腸癌標(biāo)本的處理流程，還能夠減少抗生素的使用，因此，能夠基本上實(shí)現(xiàn)零污染；并且，該試劑盒在應(yīng)用過程中應(yīng)用的消化方法是向第七產(chǎn)物中加入200μL～500μL第四試劑后將其置于37℃孵箱，第一次孵育1h以上，使得第七產(chǎn)物消化，與機(jī)械分離相比，能夠減少大腸癌細(xì)胞在這一過程中的損失，并且能夠減少操作過程中的污染，并提高消化效率。此外，該試劑盒將大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)過程中應(yīng)用到的第一試劑、第二試劑、第三試劑、第四試劑和第五試劑分別單獨(dú)封裝，在應(yīng)用過程中，無需重復(fù)配制該各試劑，因此能夠使得操作過程得到簡化，從而提高大腸癌原代細(xì)胞的培養(yǎng)效率。此外，從本發(fā)明實(shí)施例3～22的實(shí)驗(yàn)結(jié)論，可知，應(yīng)用本發(fā)明提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒，能夠使得培養(yǎng)成功率達(dá)到50％～60％。

盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對這些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實(shí)施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。

顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動(dòng)和變型在內(nèi)。