本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種用于婦科中慢性盆腔炎診斷用的適配子及其試劑盒。
背景技術(shù)：
：慢性盆腔炎是指女性內(nèi)生殖器及其周圍結(jié)締組織、盆腔腹膜的慢性炎癥。其主要臨床表現(xiàn)為月經(jīng)紊亂、白帶增多、腰腹疼痛及不孕等，如已形成慢性附件炎，則可觸及腫塊。癥狀可見(jiàn)：1)慢性盆腔痛：慢性炎癥形成的瘢痕粘連以及盆腔充血，常引起下腹部墜脹、疼痛及腰骶部酸痛。常在勞累、性交后及月經(jīng)前后加劇。2)不孕及異位妊娠：輸卵管粘連阻塞可致不孕和異位妊娠。急性盆腔炎后不孕發(fā)生率為20％～30％。3)月經(jīng)異常：子宮內(nèi)膜炎常有月經(jīng)不規(guī)則；盆腔淤血可致經(jīng)量增多；卵巢功能損害時(shí)可致月經(jīng)失調(diào)。4)全身癥狀：多不明顯，有時(shí)僅有低熱，易感疲倦。由于病程時(shí)間較長(zhǎng)，部分患者可出現(xiàn)神經(jīng)衰弱癥狀，如精神不振、周身不適、失眠等。當(dāng)患者抵抗力差時(shí)，易有急性或亞急性發(fā)作。體征，若為子宮內(nèi)膜炎，子宮增大、壓痛；若為輸卵管炎，則在子宮一側(cè)或兩側(cè)觸到呈索條狀的增粗輸卵管，并有輕度壓痛。若為輸卵管積水或輸卵管卵巢囊腫，則在盆腔一側(cè)或兩側(cè)觸及囊性腫物，活動(dòng)多受限。若為盆腔結(jié)締組織炎時(shí)，子宮常呈后傾后屈，活動(dòng)受限或粘連固定，子宮一側(cè)或兩側(cè)有片狀增厚、壓痛，宮骶韌帶常增粗、變硬，有觸痛。盆腔炎的檢查主要分為以下三步：第一步檢查臨床癥狀。第二步白帶常規(guī)檢查,這項(xiàng)檢查主要是檢查陰道清潔度、細(xì)菌性陰道病包括霉菌、滴蟲(chóng)等。第三步B超檢查,利用B超檢查可以識(shí)別來(lái)自輸卵管、卵巢及腸管粘連一起形成的包塊或膿腫有85％的準(zhǔn)確性。但輕度或中等度的盆腔炎很難在B型超聲影象中顯示出特征。如果進(jìn)行以上三項(xiàng)檢查之后，并未發(fā)現(xiàn)明顯的盆腔炎特征，還可以做相關(guān)的輔助檢查以確診是否患有盆腔炎。臨床上，主要有以下三項(xiàng)輔助檢查：第一項(xiàng)放射性同位素掃描近年來(lái)有人采用67鎵或111銦標(biāo)記的白細(xì)胞作掃描以診斷腹腔膿腫，取得較高的準(zhǔn)確率，應(yīng)用111銦作掃描，準(zhǔn)確率可高達(dá)85～100％。但目前臨床上尚少應(yīng)用，第二項(xiàng)超聲檢查如果條件允許，還應(yīng)給患者作超聲檢查以了解盆腔內(nèi)有無(wú)包塊。如有包塊，看是否為膿腫。此法為非損傷性檢查，簡(jiǎn)便易行，可靠性可高達(dá)90％以上。第三項(xiàng)計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)。但是以上檢測(cè)，檢測(cè)比較耗時(shí)，初篩復(fù)雜，效率低下，因此具有很大的改進(jìn)空間。在現(xiàn)有技術(shù)中，已知的宮頸分泌物中，分泌型免疫球蛋白A(SIgA)含量對(duì)慢性盆腔炎的診斷價(jià)值。通過(guò)抽取宮頸管內(nèi)粘液作SIgA定量測(cè)定，盆腔炎病人的SIgA平均含量可以達(dá)到166.8mg/L，而正常婦女的結(jié)果為約9.8mg/L，二者差異顯著，因此，通過(guò)定量分析宮頸分泌物中SIgA的含量可以初步用來(lái)判斷時(shí)候患有慢性盆腔炎。雖然可以采用抗體通過(guò)酶聯(lián)免疫反應(yīng)來(lái)定量分析宮頸分泌物中SIgA的含量，但是該方法對(duì)抗體的要求比較高，并且檢測(cè)成本也比較高，因此，對(duì)于貧窮落后地區(qū)，并不適宜大面積推廣。SELEX技術(shù)是20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來(lái)的一種新的組合化學(xué)技術(shù)。利用該技術(shù)可以從隨機(jī)單鏈寡核苷酸庫(kù)中篩選到特異性與靶物質(zhì)高度親和的核酸適配體。其基本思路是體外化學(xué)合成一個(gè)單鏈寡核苷酸庫(kù)，與靶物質(zhì)混合，形成靶物質(zhì)-核酸復(fù)合物，洗脫未結(jié)合的核酸，分離與靶物質(zhì)結(jié)合的核酸分子，并以此核酸分子為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再進(jìn)入下輪的篩選。通過(guò)重復(fù)的篩選與擴(kuò)增，一些與靶物質(zhì)不結(jié)合或與靶物質(zhì)有低親和力、中親和力的核酸分子被洗去，而與革G物質(zhì)有強(qiáng)親和力的核酸分子從非常大的隨機(jī)庫(kù)中分尚出來(lái)，且純度隨SELEX過(guò)程的進(jìn)行而增高，最后占據(jù)庫(kù)的大多數(shù)(>90％左右)。自Tuerk和Ellington等首先運(yùn)用此技術(shù)篩選到特異性吸附噬菌體T4DNA聚合酶和有機(jī)染料分子的特異核酸適配體后，經(jīng)過(guò)十幾年的發(fā)展，SELEX技術(shù)已經(jīng)成為一種重要的研宄手段和工具。因此，采用selex技術(shù)，篩選特定的結(jié)合SIgA的適配體，進(jìn)而將適配體制備成為特異性檢測(cè)SIgA含量的試劑盒具有較為重要的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的技術(shù)方案通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)：本發(fā)明的目的是提供一種SIgA的核酸適配體序列。本發(fā)明中，所述的SIgA的核酸適配體(序列1-15)能夠特異結(jié)合SIgA。本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供所述核酸適配體序列的用途。本發(fā)明中根據(jù)對(duì)該序列應(yīng)用，可進(jìn)一步用于制備特異性結(jié)合SIgA的試劑盒。從體外合成的隨機(jī)寡聚DNA文庫(kù)，(5′-TGACCTAACGGCATGACTTA----N36----GGCACCATGGACCAGTTACC-3′)，其中N36為36個(gè)隨機(jī)寡核苷酸；從中篩選出與SIgA特異結(jié)合的核酸適配體；將篩選出的序列用引物P1：TGACCTAACGGCATGACTTA；引物P2：GGTAACTGGTCCATGGTGCC，進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行TA克隆入pMD19-T載體(購(gòu)自上海博光生物公司)，轉(zhuǎn)化DH5a細(xì)菌(購(gòu)自北京天根生物公司)；挑去白色菌落進(jìn)行PCR確定陽(yáng)性克隆后，抽提質(zhì)粒并測(cè)序反應(yīng)，上測(cè)序儀測(cè)序。本發(fā)明采用核酸適配體的體外篩選(SELEX)技術(shù)，以SIgA為正篩靶標(biāo)，篩選與SIgA特異結(jié)合的核酸適配體，制得具有特異結(jié)合SIgA的序列，本發(fā)明中命名為適配體SIgAap-1～15。序列如下：SIgAap-1:UGACCUAACGGCAUGACUUAUCCAAAUCCUCUCAUCUAUGCUACCAAUCUUACAUUGGCACCAUGGACCAGUUACC；SIgAap-2:UGACCUAACGGCAUGACUUACCUUCCACUCCCUUAUGCAUCUUACAUUCCCCCUCAGGCACCAUGGACCAGUUACC；SIgAap-3:UGACCUAACGGCAUGACUUAUUUCUACCAACUCCUUGUUCCUUCUUCACACCACUUGGCACCAUGGACCAGUUACC；SIgAap-4:UGACCUAACGGCAUGACUUACCCUUAUCCCAAUUUUCUGCUUCAACAUAAACAAUCGGCACCAUGGACCAGUUACC；SIgAap-5:UGACCUAACGGCAUGACUUAUACUAAUCAAACUCUUAGCCCACCCUCUAUCUUAUAGGCACCAUGGACCAGUUACC；SIgAap-6:UGACCUAACGGCAUGACUUACUCACCAUAACUUUUACGAUCUAAUACCCACACACCGGCACCAUGGACCAGUUACC；SIgAap-7:UGACCUAACGGCAUGACUUACCACCUAACUUCUUUAAGCUUAAAUACUUCUUCCAAGGCACCAUGGACCAGUUACC；SIgAap-8:UGACCUAACGGCAUGACUUACCUUCCCCAUUAAAUCAGCACCAUUCACCUCAAUCAGGCACCAUGGACCAGUUACC；SIgAap-9:UGACCUAACGGCAUGACTTACTCACCCATTCACTCATGACTTCATAATCTTTTCTCGGCACCATGGACCAGTTACC；SIgAap-10:TGACCUAACGGCAUGACUUAACCUCAAUUCCAUCCAUAUCUUAAUCUCUAUACAUAGGCACCAUGGACCAGUUACC；SIgAap-11:UGACCUAACGGCAUGACUUAACUCCACAUACACCCCAGACACCCCUAAUAUUAUAUGGCACCAUGGACCAGUUACC；SIgAap-12:UGACCUAACGGCAUGACUUAUAAUAACUACUUUUACCAGCUUCUAUCAUACCAUAUGGCACCAUGGACCAGUUACC；SIgAap-13:UGACCUAACGGCAUGACUUACAAUCUAAAACUCUUCUAUUCUAUACCCUUUAAUUCGGCACCAUGGACCAGUUACC；SIgAap-14:UGACCUAACGGCAUGACUUAAUAACAAAUCCUCCCAUCACACCCACUUAUAAAAAUGGCACCAUGGACCAGUUACC；SIgAap-15:UGACCUAACGGCAUGACUUAUCCUCUCCCUCCUAUAAUACAAUCCUCAAACUCUACGGCACCAUGGACCAGUUACC；本發(fā)明的適配子可以用于構(gòu)建試劑盒，該試劑盒可以用于特異性的分離和定量檢測(cè)SIgA，具有分離效果快，效率高，節(jié)省時(shí)間，節(jié)約成本的功效。具有很廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明的有益效果：獲得了一種能夠特異高效結(jié)合SIgA的適配子,通過(guò)將該適配子制備成為試劑盒即可定量的用于檢測(cè)SIgA的濃度，即可快速高效的用于慢性盆腔炎的快速篩查。具體實(shí)施方式實(shí)施例1:核酸適配體篩選從體外合成的隨機(jī)寡聚DNA文庫(kù)，5′-TGACCTAACGGCATGACTTA----N36----GGCACCATGGACCAGTTACC-3′。所用引物:F：5，-TGACCTAACGGCATGACTTA-3R：5，-GGTAACTGGTCCATGGTGCC-3將單鏈DNA文庫(kù)擴(kuò)增為雙鏈DNA,產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收純化；以回收的雙鏈DNA為模板，體外轉(zhuǎn)錄出單鏈RNA隨機(jī)文庫(kù)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)PAGE純化。80μgRNA文庫(kù)經(jīng)硝酸纖維素膜反篩去除與膜結(jié)合的RNA分子，然后與10ugSIgA蛋白37℃孵育40min，反應(yīng)液經(jīng)硝酸纖維素膜濾過(guò)，洗滌濾膜；然后將濾膜剪碎，置于洗脫緩沖液(6mol/L尿素，0.7mol/L醋酸銨，l.6mmol/LEDTA,0.15％SDS)中煮沸5min，離心，取上清，無(wú)水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20μ1DEPC水中；以RNA為模板RT-PCR擴(kuò)增雙鏈DNA，體外轉(zhuǎn)錄出RNA文庫(kù)用于下一輪篩選；每輪篩選過(guò)程中RT-PCR得到雙鏈DNA文庫(kù)，以該雙鏈DNA為模板體外轉(zhuǎn)錄出RNA適配子庫(kù)，篩選共進(jìn)行16輪。將最后一輪篩選得到的適配子上測(cè)序儀測(cè)序。測(cè)定得到序列如SEQIDNO：1-15所示。實(shí)施例2特異性高親和力的SIgA結(jié)合適配子的獲得將RNA適配子分別取1.5μg，用牛小腸堿性磷酸酶(CIP)37℃消化1h，純化回收去磷酸化的RNA；通過(guò)T4多核苷酸激酶標(biāo)記[γ-32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。10nmol放射性標(biāo)記的RNA適配子分別與不同濃度(1-200nM)的SIgA蛋白37℃孵育30min，各組反應(yīng)液經(jīng)硝酸纖維素膜濾過(guò)，洗滌濾膜，干燥濾膜，液閃計(jì)數(shù)儀測(cè)定濾膜上殘留的放射量，同一樣品平行做兩次測(cè)定。計(jì)算各個(gè)適配子與SIgA蛋白的解離常數(shù)。結(jié)果如下：名稱解離常數(shù)Kd(nM)SIgAap-19.7SIgAap-28.5SIgAap-37.6SIgAap-48.8SIgAap-59.0SIgAap-610.2SIgAap-711.3SIgAap-89.7SIgAap-99.4SIgAap-108.6SIgAap-1111.3SIgAap-129.5SIgAap-138.8SIgAap-149.5SIgAap-1510.5PBS空白對(duì)照無(wú)結(jié)合能力實(shí)施例3所述適配子特異性分析以及穩(wěn)定性分析從以上結(jié)果可以看出，本發(fā)明的15個(gè)適配子具有非常強(qiáng)的結(jié)合特性，現(xiàn)有技術(shù)中也沒(méi)有所述結(jié)合特性的適配子能夠結(jié)合SIgA蛋白。實(shí)施例4降解活性分析分別采用人血白蛋白，IgA，IgG，血紅蛋白與15條適配子進(jìn)行特異性檢測(cè)，經(jīng)過(guò)結(jié)合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這些適配子都不與這些蛋白相結(jié)合，而只與SIgA蛋白結(jié)合保持較高的特異性。將所述的適配子，取0.5ug，分別置于常溫的血清、水溶液中，放置四周。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)四周的放置其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，沒(méi)有被降解。實(shí)施例5臨床試驗(yàn)分析將15個(gè)適配子分別用于檢測(cè)同樣的婦女陰道分泌物的臨床樣本，包括有慢性盆腔炎組和健康對(duì)照組，其中慢性盆腔炎組為60例，健康對(duì)照組為10例，以婦女的陰道分泌物作為待檢樣本。將70組婦女陰道分泌物加入到無(wú)菌離心管中，加入PBS溶液震蕩溶解。分別將偶聯(lián)有磁珠的15組適配子與70組的陰道分泌物溶液混合孵育20分鐘，而后磁分離，即可獲得相應(yīng)的分離的SIgA蛋白，通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在60例慢性盆腔炎組中，15組適配子均檢測(cè)到高濃度的SIgA蛋白，平均檢測(cè)濃度為158.1mg/L，并且分布均勻，而在健康組中SIgA蛋白的濃度平均為10.2mg/L同樣分布均勻，由此可見(jiàn)，可以采用本發(fā)明的15種適配子可以快速的實(shí)現(xiàn)100％的初步篩選的檢測(cè)效果。具有極高的準(zhǔn)確性。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。序列表〈110〉楊嶺燕〈120〉一種用于檢測(cè)婦科慢性盆腔炎的試劑盒及其檢測(cè)方法〈210〉1〈211〉76〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉SIgAap-1UGACCUAACGGCAUGACUUAUCCAAAUCCUCUCAUCUAUGCUACCAAUCUUACAUUGGCACCAUGGACCAGUUACC；〈210〉2〈211〉76〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉SIgAap-2UGACCUAACGGCAUGACUUACCUUCCACUCCCUUAUGCAUCUUACAUUCCCCCUCAGGCACCAUGGACCAGUUACC；〈210〉3〈211〉76〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉SIgAap-3UGACCUAACGGCAUGACUUAUUUCUACCAACUCCUUGUUCCUUCUUCACACCACUUGGCACCAUGGACCAGUUACC；〈210〉4〈211〉76〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉SIgAap-4UGACCUAACGGCAUGACUUACCCUUAUCCCAAUUUUCUGCUUCAACAUAAACAAUCGGCACCAUGGACCAGUUACC；〈210〉5〈211〉76〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉SIgAap-5UGACCUAACGGCAUGACUUAUACUAAUCAAACUCUUAGCCCACCCUCUAUCUUAUAGGCACCAUGGACCAGUUACC；〈210〉6〈211〉76〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉SIgAap-6UGACCUAACGGCAUGACUUACUCACCAUAACUUUUACGAUCUAAUACCCACACACCGGCACCAUGGACCAGUUACC；〈210〉7〈211〉76〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉SIgAap-7UGACCUAACGGCAUGACUUACCACCUAACUUCUUUAAGCUUAAAUACUUCUUCCAAGGCACCAUGGACCAGUUACC；〈210〉8〈211〉76〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉SIgAap-8UGACCUAACGGCAUGACUUACCUUCCCCAUUAAAUCAGCACCAUUCACCUCAAUCAGGCACCAUGGACCAGUUACC；〈210〉9〈211〉76〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉SIgAap-9UGACCUAACGGCAUGACTTACTCACCCATTCACTCATGACTTCATAATCTTTTCTCGGCACCATGGACCAGTTACC；〈210〉10〈211〉76〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉SIgAap-10TGACCUAACGGCAUGACUUAACCUCAAUUCCAUCCAUAUCUUAAUCUCUAUACAUAGGCACCAUGGACCAGUUACC；〈210〉11〈211〉76〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉SIgAap-11UGACCUAACGGCAUGACUUAACUCCACAUACACCCCAGACACCCCUAAUAUUAUAUGGCACCAUGGACCAGUUACC；〈210〉12〈211〉76〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉SIgAap-12UGACCUAACGGCAUGACUUAUAAUAACUACUUUUACCAGCUUCUAUCAUACCAUAUGGCACCAUGGACCAGUUACC；〈210〉13〈211〉76〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉SIgAap-13UGACCUAACGGCAUGACUUACAAUCUAAAACUCUUCUAUUCUAUACCCUUUAAUUCGGCACCAUGGACCAGUUACC；〈210〉14〈211〉76〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉SIgAap-14UGACCUAACGGCAUGACUUAAUAACAAAUCCUCCCAUCACACCCACUUAUAAAAAUGGCACCAUGGACCAGUUACC；〈210〉15〈211〉76〈212〉RNA〈213〉人工序列〈400〉SIgAap-15UGACCUAACGGCAUGACUUAUCCUCUCCCUCCUAUAAUACAAUCCUCAAACUCUACGGCACCAUGGACCAGUUACC；當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3