本申請涉及一種醫(yī)用水凝膠前體及其制備方法和醫(yī)用水凝膠以及應用，屬于生物醫(yī)學領域。

背景技術(shù)：

水凝膠是一種具有三維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的親水性聚合物，具有高含水量和柔軟特性，在生物醫(yī)學領域具有廣泛的應用?，F(xiàn)有的醫(yī)用水凝膠主要包括天然聚合物類產(chǎn)品、丙烯酰胺類產(chǎn)品和聚乙二醇(PEG)類產(chǎn)品。其中，PEG類醫(yī)用水凝膠以其良好的生物相容性、可降解性等特點在藥物緩釋、組織工程、組織粘合封閉等方面有很好的應用前景。

現(xiàn)有技術(shù)中，基于邁克爾加成機理的醫(yī)用水凝膠均以聚醚結(jié)構(gòu)為材料主體結(jié)構(gòu)單元，例如DURESEAL、HYPERBRANCH等公司的產(chǎn)品，均是以PEG材料為主體成分，PEG端基修飾后作為醫(yī)用水凝膠的制備原料。但是現(xiàn)有的PEG類醫(yī)用水凝膠其制備原料的合成工藝復雜，市場銷售價格較高，對患者造成了比較大的經(jīng)濟壓力。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明要解決的問題

本申請的目的在于提供一種醫(yī)用水凝膠前體及其制備方法和醫(yī)用水凝膠以及應用。該醫(yī)用水凝膠前體能夠用于制備醫(yī)用水凝膠和可負載活體細胞的生物支架。

進一步地，醫(yī)用水凝膠前體的制備方法簡單，成本較低。

用于解決問題的方案

本申請?zhí)峁┮环N醫(yī)用水凝膠前體，所述醫(yī)用水凝膠前體包括如下式(1)所示的化合物：

其中，R表示多元醇中除去n個羥基而得到的基團；A、B表示碳原子數(shù)為2-6的亞烷基；R’表示活性基團，所述活性基團含有N-琥珀酰亞胺基、氨基或巰基中的一種；n≥3，k≥1，m≥1，且n、k、m為整數(shù)。

根據(jù)本申請的醫(yī)用水凝膠前體，所述亞烷基選自如下式(2)或式(3)所示的基團：

其中，R₁表示氫原子或者碳原子數(shù)為1-4的烷基。

根據(jù)本申請的醫(yī)用水凝膠前體，所述A選自下式(4)或式(5)所示的基團：

根據(jù)本申請的醫(yī)用水凝膠前體，所述B為如下式(6)所示的基團：

-CH₂-CH₂- (6)。

根據(jù)本申請的醫(yī)用水凝膠前體，所述多元醇包括丙三醇、三羥甲基乙烷、季戊四醇、木糖醇、山梨糖醇中的一種。

本申請還提供一種根據(jù)本申請的醫(yī)用水凝膠前體的制備方法，包括以下步驟：

聚合步驟：在無水無氧，且氮氣存在的環(huán)境下，將多元醇與碳原子數(shù)為2-6的環(huán)氧化物進行陰離子開環(huán)聚合反應，得到星形共聚物；

修飾步驟：利用活性基團對所述星形共聚物進行修飾，得到醫(yī)用水凝膠前體；所述活性基團含有N-琥珀酰亞胺基，氨基或巰基中的一種。

根據(jù)本申請的醫(yī)用水凝膠前體的制備方法，所述聚合步驟包括：

第一聚合步驟：在無水無氧，且氮氣存在的環(huán)境下，將多元醇與碳原子數(shù)為2-6的第一環(huán)氧化物進行陰離子開環(huán)聚合反應，得到星形共聚物前體；

第二聚合步驟：在無水無氧，且氮氣存在的環(huán)境下，將所述星形共聚物前體與碳原子數(shù)為2-6的第二環(huán)氧化物進行陰離子開環(huán)聚合反應，得到所述星形共聚物。

根據(jù)本申請的醫(yī)用水凝膠前體的制備方法，所述第一環(huán)氧化物為環(huán)氧丙烷；所述第二環(huán)氧化物為環(huán)氧乙烷。

根據(jù)本申請的醫(yī)用水凝膠前體的制備方法，在一種具體的實施方式中，所述修飾步驟包括：

將所述星形共聚物與亞硫酰二溴置于甲苯和三乙胺溶液中反應，得到修飾有溴原子的星形共聚物；

將所述修飾有溴原子的星形共聚物與乙醇和氨氣進行反應，得到修飾有氨基的星形共聚物，或者

在催化劑的存在下，將所述修飾有溴原子的星形共聚物與疊氮鈉反應，得到修飾有氨基的星形共聚物。

根據(jù)本申請的醫(yī)用水凝膠前體的制備方法，在本實施方式中，所述修飾步驟還包括：

在碳二亞胺類縮合劑和?；呋瘎┐嬖诘臈l件下，將修飾有氨基的星形共聚物與巰基化試劑反應，得到修飾有巰基的星形共聚物；

優(yōu)選地，所述巰基化試劑包括半胱氨酸、乙酰基半胱氨酸、巰基乙酸、巰基丙酸中的一種或多種；

更優(yōu)選地，所述碳二亞胺類縮合劑包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽及其衍生物、N,N'-二異丙基碳二亞胺及其衍生物、二環(huán)己基碳二亞胺及其衍生物中的一種或多種；

進一步優(yōu)選地，所述?；呋瘎┌?-二甲氨基吡啶及其衍生物、4-吡咯烷基吡啶及其衍生物、羥基苯并三唑及其衍生物、N-羥基琥珀酰亞胺及其衍生物、N-羥基硫代琥珀酰亞胺及其衍生物中的一種或多種。

根據(jù)本申請的醫(yī)用水凝膠前體的制備方法，在另一種具體的實施方式中，所述修飾步驟包括：

羧基引入步驟：在縛酸劑的存在下，將所述星形共聚物與酸酐類化合物反應，得到修飾有羧基的星形共聚物；

羧基活化步驟：在碳二亞胺類縮合劑和?；噭┐嬖诘臈l件下，將所述修飾有羧基的星形共聚物中的羧基活化為羧基活性酰胺，得到修飾有N-琥珀酰亞胺基的星形共聚物；

優(yōu)選地，所述酸酐類化合物包括丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐中的一種或兩種以上的組合；

更優(yōu)選地，所述縛酸劑包括三乙胺、吡啶中一種或兩種；

再優(yōu)選地，所述碳二亞胺類縮合劑包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽及其衍生物、N,N'-二異丙基碳二亞胺及其衍生物、二環(huán)己基碳二亞胺及其衍生物中的一種或多種；

進一步優(yōu)選地，所述?；噭┌?-二甲氨基吡啶及其衍生物、4-吡咯烷基吡啶及其衍生物、羥基苯并三唑及其衍生物、N-羥基琥珀酰亞胺及其衍生物、N-羥基硫代琥珀酰亞胺及其衍生物中的一種或多種。

本申請還提供一種醫(yī)用水凝膠前體組合物，所述醫(yī)用水凝膠前體組合物包含(A)含有氨基和/或巰基的醫(yī)用水凝膠前體的第一組分，和(B)含有N-琥珀酰亞胺基的醫(yī)用水凝膠前體的第二組分；

其中所述含有氨基和/或巰基的醫(yī)用水凝膠前體是本申請的醫(yī)用水凝膠前體中活性基團含有氨基和/或巰基的醫(yī)用水凝膠前體；

所述含有N-琥珀酰亞胺基的醫(yī)用水凝膠前體是本申請的醫(yī)用水凝膠前體中活性基團含有N-琥珀酰亞胺基的醫(yī)用水凝膠前體。

本申請還提供一種醫(yī)用水凝膠，所述醫(yī)用水凝膠通過使用本申請的含有氨基和/或巰基的醫(yī)用水凝膠前體與所述的含有N-琥珀酰亞胺基的醫(yī)用水凝膠前體反應后形成。

根據(jù)本申請的醫(yī)用水凝膠，由所述含有氨基和/或巰基的醫(yī)用水凝膠前體溶于第一緩沖溶液中，所述含有N-琥珀酰亞胺基的醫(yī)用水凝膠前體溶于第二緩沖溶液中，然后使兩種溶液混合、反應后形成。

本申請還提供一種可負載活體細胞的生物支架，包括本申請的含有氨基和/或巰基的醫(yī)用水凝膠前體與所述的含有N-琥珀酰亞胺基的醫(yī)用水凝膠前體反應后形成。

本申請還提供一種根據(jù)本申請的醫(yī)用水凝膠的制備方法，包括以下步驟：

將所述含有氨基和/或巰基的醫(yī)用水凝膠前體溶于第一緩沖溶液中，得到第一混合液；

將所述含有N-琥珀酰亞胺基的醫(yī)用水凝膠前體溶于第二緩沖溶液中，得到第二混合液；

將所述第一混合液與第二混合液混合，得到所述醫(yī)用水凝膠。

根據(jù)本申請的醫(yī)用水凝膠的制備方法，所述第一緩沖溶液和/或第二緩沖溶液包括磷酸鹽溶液、碳酸鹽溶液、硼酸鹽溶液、磷酸溶液、乙酸溶液、鹽酸溶液中一種或多種。

本申請還提供一種醫(yī)用水凝膠試劑盒，包括本申請的含有氨基和/或巰基的醫(yī)用水凝膠前體、含有N-琥珀酰亞胺基的醫(yī)用水凝膠前體以及用于溶解所述醫(yī)用水凝膠前體的緩沖溶液。

本申請還提供一種根據(jù)本申請的醫(yī)用水凝膠在制備傷口粘合制品、內(nèi)臟或軟組織傷口閉合制品、腦脊液及組織液封堵制品、大面積創(chuàng)傷止血輔助物、軟組織修復補片或軟組織粘合制品中的應用。

本申請還提供一種根據(jù)本申請的可負載活體細胞的生物支架在細胞培養(yǎng)中的應用。

發(fā)明的效果

通過采用本申請的醫(yī)用水凝膠前體所制備得到的醫(yī)用水凝膠具有良好的粘附強度，可以使組織創(chuàng)面快速閉合，能夠有效起到組織封閉的作用，防止組織液或血液或腦脊液泄漏，且所述醫(yī)用水凝膠前體可以完全生物降解，從而避免二次手術(shù)，減少病人痛苦，還能夠降低治療費用。

進一步地，通過采用本申請的醫(yī)用水凝膠前體所制備得到的可負載活體細胞的生物支架能夠為細胞的分裂增殖提供一個良好的生長環(huán)境和三維空間，浸潤在培養(yǎng)基中可使細胞在生物支架存在的環(huán)境中增殖。

附圖說明

圖1為實驗組T2接受硬腦膜修補術(shù)后，將醫(yī)用水凝膠IV噴涂于人工硬腦膜周圍后的照片。

圖2為醫(yī)用水凝膠II應用于自體硬腦膜修復部位的組織切片圖。

圖3為細胞毒實驗中，實驗組、對照組分別減去空白組后(即以空白為參照)的吸光度值(OD值)。

圖4為采用實施例3的醫(yī)用水凝膠前體經(jīng)生物3D打印后的生物支架的光學照片。

圖5為負載骨髓間質(zhì)干細胞的生物支架的顯微鏡照片。

圖6為生物支架的場發(fā)射電子掃描顯微鏡照片。

具體實施方式

本申請一種醫(yī)用水凝膠前體，所述醫(yī)用水凝膠前體包括如下式(1)所示的化合物：

其中，R表示多元醇中除去n個羥基而得到的基團；A、B表示碳原子數(shù)為2-6的亞烷基；R’表示活性基團，所述活性基團含有N-琥珀酰亞胺基、氨基或巰基中的一種；n≥3，k≥1，m≥1，且n、k、m為整數(shù)。

優(yōu)選地，n為3-6之間的整數(shù)，更優(yōu)選地，n為3或4；k為1-10之間的整數(shù)，m為1-10之間的整數(shù)；更優(yōu)選地，k與m之和在5-10的范圍內(nèi)。此時所述醫(yī)用水凝膠前體具有較合適的分子量，可以使制得的醫(yī)用水凝膠具有適宜的降解效果。

當R’為含有N-琥珀酰亞胺基的基團時，所述R’可以為-R”NHS，其中，所述R”可以不存在，即R’為-NHS；

或者所述R”可以為-OC(CH₂)_x-、-OC(CH₂)_xCO-、-CH₂CO-、-(CH₂)_xNHOC(CH₂)_xCO-或-(CH₂)_xNHOC(CH₂)_x+1CO-；其中，x為0-10之間的整數(shù)，優(yōu)選0-5之間的整數(shù)，更優(yōu)選為0-3之間的整數(shù)。

當R’為含有氨基或巰基的基團時，所述R’可以為-R⁰SH或-R⁰NH₂，其中，所述R⁰可以為-(CH₂)_y-，y可以為0-10之間的整數(shù)，優(yōu)選0-5之間的整數(shù)，更優(yōu)選0-2之間的整數(shù)；當y為0時，所述R⁰不存在，即R’為-SH或-NH₂。

本申請的醫(yī)用水凝膠前體是修飾有活性基團的星形共聚物，(即：多臂共聚物)，具有多臂聚醚結(jié)構(gòu)。在使用時，將修飾有N-琥珀酰亞胺基的醫(yī)用水凝膠前體與修飾有氨基和/或巰基的醫(yī)用水凝膠前體物理混合，從而原位形成醫(yī)用水凝膠。

優(yōu)選地，所述亞烷基選自如下式(2)或式(3)所示的基團：

其中，R₁表示氫原子或者碳原子數(shù)為1-4的烷基。

根據(jù)本申請的醫(yī)用水凝膠前體，其中，所述多元醇包括丙三醇、三羥甲基乙烷、季戊四醇、木糖醇、山梨糖醇中的一種。

根據(jù)本申請的醫(yī)用水凝膠前體，其中，所述A選自下式(4)或式(5)所示的基團：

所述B為如下式(6)所示的基團：

-CH₂-CH₂- (6)。

本申請還提供一種根據(jù)本申請的醫(yī)用水凝膠前體的制備方法，包括以下步驟：

聚合步驟：在無水無氧，且氮氣存在的環(huán)境下，將多元醇與碳原子數(shù)為2-6的環(huán)氧化物進行陰離子開環(huán)聚合反應，得到星形共聚物；

修飾步驟：利用活性基團對所述星形共聚物進行修飾，得到醫(yī)用水凝膠前體，即

其中，R表示多元醇中除去n個羥基而得到的基團；A、B表示碳原子數(shù)為2-6的亞烷基；R’表示活性基團，所述活性基團含有N-琥珀酰亞胺基、氨基或巰基中的一種；n≥3，k≥1，m≥1，且n、k、m為整數(shù)。

優(yōu)選地，n為3-6之間的整數(shù)，更優(yōu)選地，n為3或4；k為1-10之間的整數(shù)，m為1-10之間的整數(shù)；優(yōu)選地，k與m之和在5-10的范圍內(nèi)。此時所述醫(yī)用水凝膠前體具有較合適的分子量，可以使制得的醫(yī)用水凝膠具有適宜的降解效果。

當R’為含有N-琥珀酰亞胺基的基團時，所述R’可以為-R”NHS，其中，所述R”可以不存在，即R’為-NHS；

或者所述R”可以為-OC(CH₂)_x-、-OC(CH₂)_xCO-、-CH₂CO-、-(CH₂)_xNHOC(CH₂)_xCO-或-(CH₂)_xNHOC(CH₂)_x+1CO-；其中，x為0-10之間的整數(shù)，優(yōu)選0-5之間的整數(shù)，更優(yōu)選為0-3之間的整數(shù)。

當R’為含有氨基或巰基的基團時，所述R’可以為-R⁰SH或-R⁰NH₂，其中，

所述R⁰可以為-(CH₂)_y-，y可以為0-10之間的整數(shù)，優(yōu)選0-5之間的整數(shù)，更優(yōu)選0-2之間的整數(shù)；當y為0時，所述R⁰不存在，即R’為-SH或-NH₂。

優(yōu)選地，當本申請中的A、B不相同時，所制備得到的星形共聚物為星形嵌段共聚物。

優(yōu)選地，所述多元醇為丙三醇三羥甲基乙烷季戊四醇木糖醇山梨糖醇等。

根據(jù)本申請的醫(yī)用水凝膠前體的制備方法，所述聚合步驟包括：

第一聚合步驟：在無水無氧，且氮氣存在的環(huán)境下，將多元醇與碳原子數(shù)為2-6的第一環(huán)氧化物進行陰離子開環(huán)聚合反應，得到星形共聚物前體；

第二聚合步驟：在無水無氧，且氮氣存在的環(huán)境下，將所述星形共聚物前體與碳原子數(shù)為2-6的第二環(huán)氧化物進行陰離子開環(huán)聚合反應，得到所述星形共聚物。

優(yōu)選地，當所述第一環(huán)氧化物與所述第二環(huán)氧化物不相同時，所制備得到的星形共聚物前體為星形嵌段共聚物前體，所制備得到的星形共聚物為星形嵌段共聚物。

具體地，在第一聚合步驟中的反應溫度在多元醇的凝固點以上，碳原子數(shù)為2-6的第一環(huán)氧化物的沸點以下。在第二聚合步驟中的反應溫度在碳原子數(shù)為2-6的第二環(huán)氧化物的沸點以下?？梢酝ㄟ^加入氫氧化物、醇鹽、金屬氧化物、金屬有機化合物或其他陰離子活性物作為引發(fā)劑從而引發(fā)陰離子開環(huán)聚合反應。

根據(jù)本申請的醫(yī)用水凝膠前體的制備方法，所述第一環(huán)氧化物為環(huán)氧丙烷；所述第二環(huán)氧化物為環(huán)氧乙烷。

舉例而言，丙三醇的凝固點為17.8℃，環(huán)氧丙烷的沸點為34℃，當采用丙三醇與環(huán)氧丙烷進行第一聚合步驟時，則反應溫度需在17.8℃～34℃之間。而環(huán)氧乙烷的沸點為10.4℃，當采用星形共聚物前體與環(huán)氧乙烷進行第二聚合步驟時，則反應溫度需低于10.4℃。

另外，當采用其它多元醇和其它第一環(huán)氧化物、第二環(huán)氧化物進行反應時，反應溫度的控制與采用丙三醇和環(huán)氧丙烷、環(huán)氧乙烷進行反應的方式相同。

根據(jù)本申請的醫(yī)用水凝膠前體的制備方法，在一種具體的實施方式中，所述修飾步驟包括：

將星形共聚物與亞硫酰二溴置于甲苯和三乙胺溶液中反應，得到修飾有溴原子的星形共聚物；

將所述修飾有溴原子的星形共聚物與乙醇和氨氣進行反應，得到修飾有氨基的星形共聚物，或者

將所述修飾有溴原子的星形共聚物與疊氮鈉在催化劑的存在下進行反應，得到修飾有氨基的星形共聚物；其中，所述催化劑為Pd/C，且所述修飾有溴原子的星形共聚物與疊氮鈉在二甲基甲酰胺(DMF)溶液中混合并進行反應。

根據(jù)本申請的醫(yī)用水凝膠前體的制備方法，在本實施方式中，所述修飾步驟還包括：

在碳二亞胺類縮合劑和?；呋瘎┐嬖诘臈l件下，將修飾有氨基的星形共聚物與巰基化試劑反應，得到修飾有巰基的星形共聚物；

優(yōu)選地，所述巰基化試劑包括但不限于：半胱氨酸、乙酰基半胱氨酸、巰基乙酸、巰基丙酸中的一種或多種；

更優(yōu)選地，所述的碳二亞胺類縮合劑包括但不限于：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)或其衍生物、N,N'-二異丙基碳二亞胺(DIC)或其衍生物、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)或其衍生物中的一種或多種。

進一步優(yōu)選地，所述?；呋瘎┌ǖ幌抻冢?-二甲氨基吡啶及其衍生物、4-吡咯烷基吡啶及其衍生物、羥基苯并三唑及其衍生物、N-羥基琥珀酰亞胺及其衍生物、N-羥基硫代琥珀酰亞胺及其衍生物中的一種或多種。

根據(jù)本申請的醫(yī)用水凝膠前體的制備方法，在另一種具體的實施方式中，所述修飾步驟包括：

羧基引入步驟：在縛酸劑的存在下，將所述星形共聚物與酸酐類化合物反應，得到修飾有羧基的星形共聚物；

羧基活化步驟：在碳二亞胺類縮合劑和?；噭┐嬖诘臈l件下，將所述修飾有羧基的星形共聚物中的羧基活化為羧基活性酰胺，得到修飾有N-琥珀酰亞胺基的星形共聚物。

優(yōu)選地，所述酸酐類化合物包括但不限于：丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐中的一種或兩種以上的組合，優(yōu)選為丁二酸酐；其中，戊二酸酐、己二酸酐具有一定的毒性，在終產(chǎn)物中可以除去。

更優(yōu)選地，所述縛酸劑包括但不限于：三乙胺、吡啶中的一種或兩種。

再優(yōu)選地，所述的碳二亞胺類縮合劑包括但不限于：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)或其衍生物、N,N'-二異丙基碳二亞胺(DIC)或其衍生物、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)或其衍生物中的一種或多種。另外，制備含氨基或巰基的醫(yī)用水凝膠前體與制備含N-琥珀酰亞胺基的醫(yī)用水凝膠前體所使用的碳二亞胺類縮合劑可以相同也可以不同。

進一步優(yōu)選地，所述?；噭┌ǖ幌抻冢?-二甲氨基吡啶及其衍生物、4-吡咯烷基吡啶及其衍生物、羥基苯并三唑及其衍生物、N-羥基琥珀酰亞胺及其衍生物、N-羥基硫代琥珀酰亞胺及其衍生物中的一種或多種。

本申請還提供一種醫(yī)用水凝膠前體組合物，所述醫(yī)用水凝膠前體組合物包含(A)含有氨基和/或巰基的醫(yī)用水凝膠前體的第一組分，和(B)含有N-琥珀酰亞胺基的醫(yī)用水凝膠前體的第二組分；

其中，所述含有氨基和/或巰基的醫(yī)用水凝膠前體是本申請的醫(yī)用水凝膠前體中活性基團含有氨基和/或巰基的醫(yī)用水凝膠前體。

所述含有N-琥珀酰亞胺基的醫(yī)用水凝膠前體是本申請的醫(yī)用水凝膠前體中活性基團含有N-琥珀酰亞胺基的醫(yī)用水凝膠前體。

本申請還提供一種醫(yī)用水凝膠，包括本申請的含有氨基和/或巰基的醫(yī)用水凝膠前體與含有N-琥珀酰亞胺基的醫(yī)用水凝膠前體反應后形成。一般而言，所述含有氨基和/或巰基的醫(yī)用水凝膠前體為親核試劑，所述含有N-琥珀酰亞胺基的醫(yī)用水凝膠前體為親電試劑。

根據(jù)本申請的醫(yī)用水凝膠，由所述含有氨基和/或巰基的醫(yī)用水凝膠前體(親核試劑)溶于第一緩沖溶液中，所述含有N-琥珀酰亞胺基的醫(yī)用水凝膠前體(親電試劑)溶于第二緩沖溶液中，然后混合、反應后形成。

通過采用本申請的醫(yī)用水凝膠前體制備得到的醫(yī)用水凝膠，具有良好的粘附強度，可以使組織創(chuàng)面快速閉合，有效起到組織封閉的作用，防止組織液或血液或腦脊液泄漏。還可以完全生物降解，避免二次手術(shù)，減少病人痛苦。

本申請還提供一種根據(jù)本申請的醫(yī)用水凝膠的制備方法，包括以下步驟：

將所述含有氨基和/或巰基的醫(yī)用水凝膠前體(親核試劑)溶于第一緩沖溶液中，得到第一混合液；

將所述含有N-琥珀酰亞胺基的醫(yī)用水凝膠前體(親電試劑)溶于第二緩沖溶液中，得到第二混合液；

將所述第一混合液與第二混合液混合，得到所述醫(yī)用水凝膠。

本申請的醫(yī)用水凝膠的制備方法，所述第一緩沖溶液和/或第二緩沖溶液包括但不限于：磷酸鹽溶液、碳酸鹽溶液、硼酸鹽溶液、磷酸溶液、乙酸溶液、鹽酸溶液中一種或多種。所述緩沖溶液的具體成分可根據(jù)親核試劑或親電試劑在緩沖溶液中的穩(wěn)定性和成型的醫(yī)用水凝膠的理化性能情況進行選擇，緩沖溶液不應含有有害或有毒的溶劑，通常選用水做溶劑，緩沖液的滲透壓應與生物體血液滲透壓相同或接近。

優(yōu)選地，所述第一緩沖溶液包括但不限于：pH值為8.0-10.0的四硼酸鈉緩沖溶液或pH為9.6～9.9的磷酸二氫鈉溶液與碳酸鈉溶液的組合的緩沖溶液；所述第二緩沖溶液包括但不限于：pH值為3.5-5.0的鹽酸溶液、pH為5.0～6.0的磷酸鈉緩沖溶液或pH為3.5-4.5的磷酸二氫鈉溶液和碳酸溶液的組合的緩沖溶液。

本申請的醫(yī)用水凝膠的制備方法，所述第一緩沖溶液液和/或第二緩沖溶液中包含有顯色劑；優(yōu)選地，所述顯色劑包括但不限于：FD&C藍色#1、FD&C藍色#2、FD&C藍色#3、D&C綠色#6、亞甲基藍中的一種或多種。

本申請還提供一種可負載活體細胞的生物支架，包括本申請的含有氨基和/或巰基的醫(yī)用水凝膠前體與含有N-琥珀酰亞胺基的醫(yī)用水凝膠前體反應后形成。

通過采用本申請的醫(yī)用水凝膠前體制備得到的可負載細胞的生物支架，可以為細胞的分裂增殖提供一個良好的生長環(huán)境和三維空間，浸潤在培養(yǎng)基中可使細胞在生物支架存在的環(huán)境中分裂增殖，通過負載不同細胞或不同細胞誘導因子，培養(yǎng)所需要的活體細胞。

本申請還提供一種根據(jù)本申請的可負載活體細胞的生物支架的制備方法，包括以下步驟：

將所述含有氨基和/或巰基的醫(yī)用水凝膠前體(親核試劑)溶于第三緩沖溶液中，得到第一混合液；

將所述含有N-琥珀酰亞胺基的醫(yī)用水凝膠前體(親電試劑)溶于第二緩沖溶液中，得到第二混合液；

將所述第一混合液與第二混合液混合，得到所述可負載活體細胞的生物支架；

其中，所述第三緩沖溶液包括但不限于pH為7.5～8.5的磷酸二氫鈉溶液與碳酸鈉溶液的組合的緩沖溶液。

通過采用醫(yī)用水凝膠前體所制備得到的可負載活體細胞的生物支架能夠為細胞的分裂增殖提供一個良好的生長環(huán)境和三維空間，浸潤在培養(yǎng)基中可使細胞在生物支架存在的環(huán)境中增殖，通過負載不同細胞或不同細胞誘導因子，培養(yǎng)所需要的活體細胞。

本申請還提供一種醫(yī)用水凝膠試劑盒，包括根據(jù)本申請的含有氨基和/或巰基的醫(yī)用水凝膠前體(親核試劑)、含有N-琥珀酰亞胺基的醫(yī)用水凝膠前體(親電試劑)以及用于溶液所述醫(yī)用水凝膠前體的緩沖溶液。

本申請還提供一種根據(jù)本申請的醫(yī)用水凝膠在傷口粘合制品、內(nèi)臟或軟組織傷口閉合制品、腦脊液及組織液封堵制品、大面積創(chuàng)傷止血輔助物、軟組織修復補片與軟組織粘合制品中的應用。

本申請還提供一種根據(jù)本申請的可負載活體細胞的生物支架在細胞培養(yǎng)中的應用。

另外，本申請中的成膠時間的測定方法為：將所述第一混合溶液與第二混合溶液混合后開始計時，當混合后的二元混合物不再流動時即為成膠，此段時間記為成膠時間。

本申請中的溶脹率的測試方法為：將制得的醫(yī)用水凝膠置于精確度為萬分之一位的天平上，測得其重量為x g。然后將所述醫(yī)用水凝膠置于pH＝7.4的磷酸鹽(PBS)緩沖溶液中12小時，使得醫(yī)用水凝膠達到溶脹平衡后取出。用濾紙擦干表面水分，再次將其置于精確度為萬分之一位的天平上，測得其重量為yg。重復測定十次，計算其平均值x和y。按照以下公式計算溶脹率：

溶脹率＝(y-x)/x×100％。

本申請中破裂強度的測定方法為：取新鮮豬皮或豬腸衣，其面積為20×20cm，將其固定于只有一個開口的密閉箱的開口處，然后將所述密閉箱的開口密封，密閉箱的另一側(cè)連接有壓力打氣泵，并配有壓力傳感器。在所述豬皮或豬腸衣的中心位置切開一個直徑為0.5cm±0.02cm的小口，然后將人工硬腦膜或其他可封堵的材料置于小口表面，通過雙聯(lián)注射器在封堵材料周圍均勻的噴上所述第一混合溶液和所述第二混合溶液，噴涂后計時1至5分鐘，然后通過壓力泵向密閉箱內(nèi)打氣，記錄人工硬腦膜或其他封堵材料被頂開時壓力傳感器的讀數(shù)，即破裂強度。

本申請中的降解時間的測定方法為：稱取一定重量的醫(yī)用水凝膠(例如0.5g)，置于不可降解的聚丙烯網(wǎng)袋中，將其充分干燥后，放入pH＝7.4的磷酸鹽(PBS)緩沖溶液中，然后置于恒溫恒濕的37℃烘箱內(nèi)。每隔24小時從緩沖溶液中取出一次樣品，吸干其表面水分并干燥樣品后測試其重量。重量損失超過其原始重量5％時記為開始降解時間；重量損失達到100％時為完全降解時間。

實施例

下面將結(jié)合實施例對本申請的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本申請，而不應視為限定本申請的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

巰基丙酸：Aladdin公司；產(chǎn)品編號：M103035。

可溶性碳二亞胺：Sigma-Aldrich公司；產(chǎn)品編號：MFCD00044916。

N-羥基琥珀酰亞胺(N-羥基丁二酰亞胺)：Sigma-Aldrich公司；產(chǎn)品編號：56480。

3-arm-PEG-NH₂：廈門賽諾邦格生物科技有限公司。

4-arm-PEG-NHS：廈門賽諾邦格生物科技有限公司。

4-arm-PEG-NH₂：廈門賽諾邦格生物科技有限公司。

實施例1

<醫(yī)用水凝膠前體的制備>

以丙三醇(10mmol，0.9209g，0.7303mL)作為起始劑，加入至100mL的反應瓶中，然后加入20mL的二氧六環(huán)，置于60℃水浴中，抽真空，并通入高純氮氣，反復操作，最后連續(xù)抽真空狀態(tài)下保持2小時，以除去水和氧氣。

將溫度降至20℃，并持續(xù)通入高純氮氣，向體系內(nèi)加入環(huán)氧丙烷(90mmol，5.2272g，6.2979mL)、甲醇鈉(0.1mmol，0.0054g，0.0042mL)引發(fā)環(huán)氧丙烷的開環(huán)聚合反應，反應2小時。

將溫度降至5℃，持續(xù)通入高純氮氣，然后加入適量環(huán)氧乙烷單體(180mmol，7.9294g，9.1027mL)，持續(xù)反應2小時，通過減壓蒸餾方式除去二氧六環(huán)，經(jīng)純化后，得到羥基封端的丙三醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物，產(chǎn)物質(zhì)量為10.7834g，產(chǎn)率為76.6％。

取羥基封端的丙三醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物(5.3917g，3.83mmol)與亞硫酰二溴(SOBr₂，11.49mmol，2.3884g)在50mL二氯甲烷和三乙胺(17.25mmol，1.7455g，2.3911mL)中反應得到溴封端的丙三醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物，純化后稱重，質(zhì)量為4.9848g。

將溴封端的丙三醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物與疊氮鈉(17.25mmol，1.1214g)在50mL的DMF溶劑中混合，以0.2g的Pd/C為催化劑，在20mL的乙醇溶劑中催化加氫，得到氨基封端的丙三醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物(親核試劑)，純化后稱重，質(zhì)量為4.6658g。

取羥基封端的丙三醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物(5.3917g，3.83mmol)與丁二酸酐(17.235mmol，1.7247g)在50mL二氯甲烷和三乙胺(25.8525mmol，2.6160g，3.5836mL)中進行反應，制備得到羧基封端的丙三醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物，純化后稱重，質(zhì)量為4.4784g。

將羧基封端的丙三醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物(4.4784g)與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(11.49mmol，2.2026g)和?；噭㎞-羥基琥珀酰亞胺(13.788mmol，1.3662g)于0℃的水溶液中連續(xù)攪拌反應40min，得到N-羥基琥珀酰亞胺基封端的丙三醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物(親電試劑)，純化后稱重，質(zhì)量為4.0845g。

<醫(yī)用水凝膠的制備>

將氨基封端的丙三醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物(1mmol，1.4230g)溶于2.5mL的磷酸二氫鈉與碳酸鈉混合的緩沖溶液(pH＝9.97±0.02)中，得到第一組分；將N-羥基琥珀酰亞胺基封端的丙三醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物(1mmol，2.0070g)溶于2.5mL磷酸鈉緩沖溶液(pH＝5.64±0.02)中，得到第二組分；將第一組分和第二組分通過擠出裝置等體積混合擠出，得到醫(yī)用水凝膠I。

實施例2

<醫(yī)用水凝膠前體的制備>

以季戊四醇(10mmol，1.3615g)為起始劑，加入至100mL的反應瓶中，加入20mL的吡啶，置于60℃水浴中，抽真空，并通入高純氮氣，反復操作，最后連續(xù)抽真空狀態(tài)下保持2小時，以除去水和氧氣。

將溫度降至20℃，并持續(xù)通入高純氮氣，加入環(huán)氧丙烷(80mmol，4.6464g，5.5981mL)、甲醇鈉(0.1mmol，0.0054g，0.0042mL)引發(fā)環(huán)氧丙烷開環(huán)反應，并持續(xù)反應2小時。

將溫度降至5℃，持續(xù)通入高純氮氣，然后加入環(huán)氧乙烷單體(160mmol，7.0483g，8.0913mL)，持續(xù)反應2小時，通過減壓蒸餾方式除去吡啶，經(jīng)純化后，得到羥基封端的季戊四醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物，產(chǎn)物質(zhì)量為9.4527g，產(chǎn)率為72.4％。

取羥基封端的季戊四醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物(4.7263g，3.62mmol)與亞硫酰二溴(14.48mmol，3.0110g)在二氯甲烷(50mL)和三乙胺(21.72mmol，2.1978g，3.0108mL)中反應得到溴封端的季戊四醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物，純化后稱重，質(zhì)量為4.6258g。

將溴封端的季戊四醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物(4.6258g)與疊氮鈉(21.72mmol，1.4120g)在50mL的DMF溶劑中混合，以0.2g的Pd/C為催化劑，在20mL的乙醇溶劑中催化加氫，得到氨基封端的季戊四醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物(親核試劑)，純化后稱重，質(zhì)量為4.0749g。

取羥基封端的季戊四醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物(4.7263g，3.62mmol)與丁二酸酐(21.72mmol，2.1735g)在50mL二氯甲烷和三乙胺(32.58mmol，3.2968g，4.5161mL)中反應，制備得到羧基封端的季戊四醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物，純化后稱重，質(zhì)量為4.5474g。

將羧基封端的季戊四醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物(4.5474g)與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(14.48mmol，2.7758g)和N-羥基琥珀酰亞胺(17.376mmol，1.7218g)于10℃的水溶液中連續(xù)攪拌反應20min，得到N-羥基琥珀酰亞胺基封端的季戊四醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物(親電試劑)，純化后稱重，質(zhì)量為4.1255g。

<醫(yī)用水凝膠的制備>

將氨基封端的季戊四醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物(1mmol，1.3696g)溶于2.5mL磷酸二氫鈉與碳酸鈉混合的緩沖溶液(pH＝9.97±0.02)中，得到第一組分；將N-羥基琥珀酰亞胺基封端的季戊四醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物(1mmol，2.1056g)溶于2.5mL磷酸二氫鈉與碳酸混合的緩沖溶液(pH＝3.64±0.02)中，得到第二組分；將第一組分和第二組分通過擠出裝置等體積混合擠出，得到醫(yī)用水凝膠II。

實施例3

<醫(yī)用水凝膠前體的制備>

以山梨糖醇(6mmol，1.0930g)為起始劑，加入至100mL的反應瓶中，加入20mL二氧六環(huán)，置于60℃水浴中，抽真空，通入高純氮氣，反復操作，最后連續(xù)抽真空狀態(tài)下保持2小時，以除去水和氧氣。

將溫度降至20℃，并持續(xù)通入高純氮氣，加入環(huán)氧丙烷(72mmol，4.1818g，5.0383mL)和甲醇鈉(0.05mmol，0.0027g，0.0021mL)引發(fā)環(huán)氧丙烷開環(huán)反應，并持續(xù)反應2小時。

將溫度降至5℃，持續(xù)通入高純氮氣，然后加入環(huán)氧乙烷單體(216mmol，9.5152g，10.9232mL)，持續(xù)反應2小時，通過減壓蒸餾方式除去二氧六環(huán)，經(jīng)純化后；得到羥基封端的山梨糖醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物，產(chǎn)物質(zhì)量為10.2123g，產(chǎn)率為69.05％。

取羥基封端的山梨糖醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物(5.1062g，2.07mmol)與亞硫酰二溴(12.42mmol，2.5817g)在二氯甲烷(50mL)和三乙胺(18.63mmol，1.8852g，2.5824mL)中反應得到溴封端的山梨糖醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物，純化后稱重，質(zhì)量為4.8345g。

將溴封端的山梨糖醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物(4.8345g)與疊氮鈉(18.63mmol，1.2111g)在50mL的DMF溶劑中混合，以0.2g的Pd/C為催化劑，在20mL的乙醇溶劑中催化加氫，得到氨基封端的山梨糖醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物，純化后稱重，質(zhì)量為4.1125g。

取羥基封端的山梨糖醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物(5.1062g，2.07mmol)與丁二酸酐(18.63mmol，1.8643g)在50mL的二氯甲烷和三乙胺(27.945mmol，2.8278g，3.8736mL)中反應，制備得到羧基封端的山梨糖醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物，純化后稱重，質(zhì)量為4.5566g。

將羧基封端的山梨糖醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物(4.5566g)與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(12.42mmol，2.3809g)、N-羥基琥珀酰亞胺(14.904mmol，1.4768g)于5℃的水溶液中連續(xù)攪拌反應15min，得到N-羥基琥珀酰亞胺基封端的山梨糖醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物，純化后稱重，質(zhì)量為4.0756g。

<醫(yī)用水凝膠的制備>

將氨基封端的山梨糖醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物(1mmol，2.5610g)溶于2.5mL磷酸二氫鈉與碳酸鈉混合的緩沖溶液(pH＝9.97±0.02)中，得到第一組分；將N-羥基琥珀酰亞胺基封端的山梨糖醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物(1mmol，3.6650g)溶于2.5mL磷酸鈉緩沖溶液(pH＝5.64±0.02)中，得到第二組分；將第一組分和第二組分通過擠出裝置等體積混合擠出，得到醫(yī)用水凝膠III。

實施例4

<第一醫(yī)用水凝膠前體(親核試劑)的制備>

以季戊四醇(5mmol，0.6808g)為起始劑，加入至50mL的反應瓶中，加入10mL吡啶，置于60℃水浴中，抽真空，并通入高純氮氣，反復操作，最后連續(xù)抽真空狀態(tài)下保持2小時，以除去水和氧氣。

將溫度降至20℃，并持續(xù)通入高純氮氣，然后加入環(huán)氧丙烷(40mmol，2.3232g，2.7991mL)、甲醇鈉(0.05mmol，0.0027g，0.0021mL)引發(fā)環(huán)氧丙烷開環(huán)反應，持續(xù)反應2小時；

將溫度降至5℃，持續(xù)通入高純氮氣，然后加入環(huán)氧乙烷單體(80mmol，3.5242g，4.0457mL)，持續(xù)反應2小時，通過減壓蒸餾方式除去吡啶，經(jīng)純化后，得到羥基封端的季戊四醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物，產(chǎn)物質(zhì)量為4.7201g，產(chǎn)率為72.3％。

取羥基封端的季戊四醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物(4.7201g，3.6mmol)與亞硫酰二溴(14.4mmol，2.9933g)在二氯甲烷(50mL)和三乙胺(21.6mmol，2.1857g，2.9941mL)中反應得到溴封端的季戊四醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物，純化后稱重，質(zhì)量為4.6114g。

將4.6114g的溴封端的季戊四醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物與疊氮鈉(21.6mmol，1.4042g)在50mL的DMF溶劑中混合，以0.2gPd/C為催化劑，在20mL的乙醇溶劑中催化加氫，獲得氨基封端的季戊四醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物(親核試劑)，純化后稱重，質(zhì)量為4.001g。

<第二醫(yī)用水凝膠前體(親電試劑)的制備>

以山梨糖醇(3mmol，0.5465g)為起始劑，加入至50mL的反應瓶中，加入10mL二氧六環(huán)，置于60℃水浴中，抽真空，通入高純氮氣，反復操作，最后連續(xù)抽真空狀態(tài)下保持2小時，以除去水和氧氣。

將溫度降至20℃，并持續(xù)通入高純氮氣，加入環(huán)氧丙烷(36mmol，2.0909g，2.5192mL)、甲醇鈉(0.05mmol，0.0027g，0.0021mL)引發(fā)環(huán)氧丙烷開環(huán)反應，持續(xù)反應2小時。

將溫度降至5℃，持續(xù)通入高純氮氣，然后加入環(huán)氧乙烷單體(108mmol，4.7576g，5.4616mL)，持續(xù)反應2小時，通過減壓蒸餾方式除去二氧六環(huán)，經(jīng)純化后，得到羥基封端的山梨糖醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物，產(chǎn)物質(zhì)量為5.1017g，產(chǎn)率為68.99％。

取羥基封端的山梨糖醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物(5.1017g，2.05mmol)與丁二酸酐(18.45mmol，1.8463g)在50mL二氯甲烷和三乙胺(27.675mmol，2.8004g，3.8362mL)中反應，制備得到羧基封端的山梨糖醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物，純化后稱重，質(zhì)量為4.4189g。

取羧基封端的山梨糖醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物(4.4189g)與水溶性碳二亞胺(12.3mmol，2.3579g)、N-羥基琥珀酰亞胺(14.76mmol，1.4625g)于0℃的水溶液中連續(xù)攪拌反應30min，得到N-羥基琥珀酰亞胺基封端的山梨糖醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物(親電試劑)，純化后稱重，質(zhì)量為3.9976g。

<醫(yī)用水凝膠的制備>

稱取第一醫(yī)用水凝膠前體(1mmol，1.3696g)溶于2.5mL磷酸二氫鈉與碳酸鈉混合的緩沖溶液(pH＝9.97±0.02)中，得到第一組分；稱取第二醫(yī)用水凝膠前體溶于2.5mL磷酸鈉緩沖溶液(pH＝5.64±0.02)中，得到第二組分；將第一組分和第二組分通過擠出裝置等體積混合擠出，得到醫(yī)用水凝膠IV。

標準例1

稱取1mmol的3-arm-PEG-NH₂，溶于2.5mL的pH＝10.0的磷酸鈉緩沖溶液中，震蕩使其完全溶解。

稱取1mmol的4-arm-PEG-NHS，溶于2.5mL的pH＝4.0的硼砂緩沖溶液中，震蕩使其完全溶解。

將經(jīng)緩沖溶液溶解后的3-arm-PEG-NH₂和4-arm-PEG-NHS通過擠出裝置等體積混合擠出，得到醫(yī)用水凝膠V。

標準例2

稱取1mmol的4-arm-PEG-NH₂，溶于2.5mL的pH＝10.0的磷酸鈉緩沖溶液中，震蕩使其完全溶解。

稱取1mmol的4-arm-PEG-NHS，溶于2.5mL的pH＝4.0的硼砂緩沖溶液中，震蕩使其完全溶解。

將經(jīng)緩沖溶液溶解后的4-arm-PEG-NH₂和4-arm-PEG-NHS通過擠出裝置等體積混合擠出，得到醫(yī)用水凝膠VI。

測定上述實施例1-4和標準例1-2的成膠時間、溶脹率、破裂強度、剝離拉伸承載強度、開始降解時間以及完全降解時間，結(jié)果如下表1所示：

表1

從表1可以看出，本申請實施例1-4制備得到的醫(yī)用水凝膠I-IV與標準例1-2的醫(yī)用水凝膠V-VI相比，本申請的水凝膠I-IV同樣具有較高的破裂強度和剝離拉伸承載強度，以及較低的溶脹率。因此本申請的水凝膠具有較好的抗破裂強度和粘合力，在組織封閉、創(chuàng)面閉合、防止組織液、血液或腦脊液泄漏方面具有較好的優(yōu)勢。

人工硬腦膜修補實驗

取9只健康的大犬作為實驗犬，體重均在15公斤以上。隨機標號T1，T2，T3，T4，T5，T6，T7，T8，T9。將實驗犬麻醉后在其頭頂制造2.5cm×2.0cm的硬腦膜缺口，然后進行人工硬腦膜修補手術(shù)。所有的實驗犬均接受硬腦膜修補術(shù)，其中T1、T2、T3為實驗組，T4、T5、T6為對照組，T7、T8、T9為空白組。

實驗組T1、T2、T3植入人工硬腦膜，采用按照實施例4的方法制備得到的第一組分和第二組分進行動物實驗。通過兩組分注射器將第一組分和第二組分混合后，噴涂于人工硬腦膜材料周圍及表面，30秒后檢查其交聯(lián)情況，待兩組分完全交聯(lián)形成醫(yī)用水凝膠IV后將傷口封閉縫合。圖1為實驗組T2接受硬腦膜修補術(shù)后，將醫(yī)用水凝膠IV噴涂于人工硬腦膜周圍后的照片。

對照組T4、T5、T6植入人工硬腦膜，采用按照標準例2的方法制備得到的第一組分和第二組分進行動物實驗。通過兩組分注射器將第一組分和第二組分混合后，噴涂于人工硬腦膜材料周圍及表面，30秒后檢查其交聯(lián)情況，待兩組分完全交聯(lián)形成醫(yī)用水凝膠VI后將傷口封閉縫合。圖2為實驗組T3接受硬腦膜修補術(shù)后，將醫(yī)用水凝膠VI噴涂于人工硬腦膜周圍后的照片。

空白組T7、T8、T9在植入人工硬腦膜后不進行噴涂，直接將傷口封閉縫合。

手術(shù)一周后觀察，所有的實驗犬均保持健康。解剖實驗組T1的實驗犬和對照組T4的實驗犬以及空白組T7的實驗犬后發(fā)現(xiàn)：空白組T7的實驗犬發(fā)生了人工硬腦膜側(cè)向移動或與附著位置脫離現(xiàn)象；實驗組T1的實驗犬在用醫(yī)用水凝膠IV封閉后未發(fā)生人工硬腦膜移動問題，對照組T4的實驗犬在用醫(yī)用水凝膠VI封閉后也未發(fā)生人工硬腦膜移動問題。

手術(shù)兩周后觀察，所剩余的實驗犬均保持健康。解剖實驗組T2的實驗犬和對照組T5的實驗犬以及空白組T8的實驗犬后發(fā)現(xiàn)：空白組T8的實驗犬發(fā)生了人工硬腦膜側(cè)向移動或與附著位置脫離現(xiàn)象，堆積至一側(cè)并發(fā)生腦脊液泄漏；實驗組T2的實驗犬在用醫(yī)用水凝膠IV封閉后未發(fā)生人工硬腦膜移動問題，水凝膠的顏色變淡并可觀察到已發(fā)生明顯的降解。對照組T5的實驗犬在用醫(yī)用水凝膠VI封閉后也未發(fā)生人工硬腦膜移動問題。

手術(shù)四周后觀察，剩余的實驗犬均存活，解剖實驗組T3的實驗犬和對照組T6的實驗犬以及空白組T9的實驗犬后發(fā)現(xiàn)：空白組T9已發(fā)生明顯的腦脊液外漏問題；實驗組T3和對照組T5中的醫(yī)用水凝膠前體已完全降解，消失不見，且并未發(fā)生腦脊液外漏的問題。

另外，在實驗組T1～T6中所有的實驗犬身上都沒有發(fā)現(xiàn)神經(jīng)缺陷，從最初的手術(shù)操作開始所有的實驗兔均保持健康。

上述結(jié)果表明，當采用本申請的醫(yī)用水凝膠前體制備得到的醫(yī)用水凝膠，可以有效地應用在人工硬腦膜及鄰近組織上，實現(xiàn)組織封閉，防止腦脊液泄露。

自體硬腦膜修復實驗

將實施例2的醫(yī)用水凝膠II應用于自體硬腦膜修復，兩個月后取出修復部位組織做病理切片，采用蘇木精-伊紅染色后在顯微鏡下觀察。圖2是醫(yī)用水凝膠II應用于自體硬腦膜修復部位的組織切片圖，如圖2所示，醫(yī)用水凝膠II已完全降解，并且醫(yī)用水凝膠II與硬腦膜接觸位置未見炎癥細胞，硬腦膜組織無變性，無壞死，無纖維化增生。另外，硬腦膜周圍其它組織細胞也未見細胞變性和壞死等病理改變。因此，本申請的醫(yī)用水凝膠具有良好的組織相容性，可完全生物降解。

細胞毒實驗

通過浸提液接觸培養(yǎng)細胞，以L929為實驗細胞，對細胞增殖觀察，評價實施例2所制備的醫(yī)用水凝膠II對體外細胞的毒性作用。

實驗的具體過程為：用完全培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基+10％胎牛血清(FBS)+1％雙抗(青霉素和鏈霉素的混合液))按照0.1g/mL的比例浸提醫(yī)用水凝膠，得到水凝膠的浸提液。

實驗組：采用完全培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基+10％胎牛血清(FBS)+1％雙抗(青霉素和鏈霉素的混合液)，添加水凝膠的浸提液，加入細胞懸液，進行細胞培養(yǎng)。

對照組：采用完全培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基+10％胎牛血清(FBS)+1％雙抗(青霉素和鏈霉素的混合液))加入細胞懸液，進行細胞培養(yǎng)。對照組中不添加水凝膠的浸提液，其余細胞培養(yǎng)條件與實驗組相同。

空白組：采用完全培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基+10％胎牛血清(FBS)+1％雙抗(青霉素和鏈霉素的混合液)，空白組中不添加水凝膠的浸提液和細胞懸液，于相同的時間放置于與實驗組和對照組相同的環(huán)境中，以作為實驗組和對照組測量吸光度值時的參照。

采用實施例2的醫(yī)用水凝膠II進行浸提液的配制，浸提溫度為(37±1)℃，浸提時間為(24±2)h。采用完全培養(yǎng)基重懸L929細胞，制得濃度為4×10⁴個細胞/mL的細胞懸液。以96孔平板為培養(yǎng)板，其中實驗組和對照組為在培養(yǎng)板中加入上述細胞懸液，每孔加入100μL；空白組為在培養(yǎng)板中每孔加入100μL的完全培養(yǎng)基，不加入細胞懸液。

將實驗組、對照組和空白組的培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)24小時(在37℃，5％CO₂的條件下)。然后在實驗組中加入水凝膠的浸提液，每孔加入100μL，對照組和空白組不加水凝膠的浸提液，之后將各培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(在37℃，5％CO₂條件下)。然后小心吸出孔內(nèi)的培養(yǎng)液，再向每孔內(nèi)加入100μL的CCK-8混合液(由90μL的完全培養(yǎng)基+10μL的CCK-8混合制成)，再將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中孵育2小時。然后用酶標儀測定在450nm處的吸光度。

圖3為細胞毒實驗中，實驗組、對照組分別減去空白組后(即以空白為參照)的吸光度值(OD值)。由圖3可以得出，實驗組細胞的相對增殖率為RGR＝94.92％。

其中實驗組細胞的相對增殖率RGR的計算方法為：RGR＝(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100％。因此，本申請的醫(yī)用水凝膠具有良好的安全性，對細胞生長無毒副作用。

負載細胞的生物3D打印實驗

將實施例3的氨基封端的山梨糖醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物(1mmol，2.5610g)溶于2.5mL磷酸二氫鈉與碳酸鈉混合的緩沖溶液(pH＝7.97±0.02)中；將實施例3的N-羥基琥珀酰亞胺基封端的山梨糖醇-環(huán)氧丙烷-環(huán)氧乙烷星形嵌段共聚物(1mmol，3.6650g)溶于2.5mL磷酸鈉緩沖溶液(pH＝5.64±0.02)中，并加入骨髓間質(zhì)干細胞，細胞濃度為5×10⁶個/mL。將兩組分材料分別灌裝在與打印機相連的注射器中，兩只注射器在擠出口位置連通混合，然后導入打印機噴頭進行負載骨髓間質(zhì)干細胞的生物3D打印實驗。

圖4為采用實施例3的醫(yī)用水凝膠前體經(jīng)生物3D打印后的支架材料的光學照片，圖5為負載骨髓間質(zhì)干細胞的生物支架的顯微鏡照片。由圖4和圖5可以清晰地看到其網(wǎng)格支架結(jié)構(gòu)及骨髓間質(zhì)干細胞。圖6為負載骨髓間質(zhì)干細胞的生物支架的場發(fā)射電子掃描顯微鏡照片，由圖6可以清晰地看到生物支架的支撐的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。因此，通過采用本申請的醫(yī)用水凝膠前體制備得到的可負載細胞的生物支架，可以為細胞的分裂增殖提供一個良好的生長環(huán)境和三維空間，浸潤在培養(yǎng)基中可使細胞在生物支架存在的環(huán)境中分裂增殖。