專利名稱：核殼型水凝膠膠體晶體微球及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種核殼型膠體晶體水凝膠的制備方法，該種微球可應(yīng)用于生物分子的多元檢測(cè)，如核酸，蛋白質(zhì)還可應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞的多元檢測(cè)中。
背景技術(shù)：
隨著人類基因組計(jì)劃的完成，人類進(jìn)入了后基因組時(shí)代。后基因組時(shí)代的一個(gè)顯著特點(diǎn)就是要研究大量的蛋白與核酸之間，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間，蛋白質(zhì)和藥物之間的相互作用。除此之外，人們也逐漸將研究轉(zhuǎn)入到了細(xì)胞領(lǐng)域，細(xì)胞是生物分子有機(jī)的組合體，研究細(xì)胞可以發(fā)現(xiàn)一些單純生物分子研究所無(wú)法解釋的科學(xué)問(wèn)題，細(xì)胞毒性或者一些復(fù)雜的細(xì)胞生物學(xué)。然而這一系列復(fù)雜的問(wèn)題光靠采用傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法幾乎是不可能的，因此需要一種高通量的試驗(yàn)平臺(tái)。高通量的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)則要求有高通量的分子載體，來(lái)標(biāo)識(shí)不同的分子或細(xì)胞之間發(fā)生的不同相互作用，即所謂的編碼過(guò)程。以膠體晶體微球?yàn)檩d體的液相芯片技術(shù)在生物分析以及蛋白質(zhì)、基因、藥物篩選中得到了越來(lái)越多的運(yùn)用。相對(duì)于其他形式的載體，膠體晶體微球具有顯著的優(yōu)勢(shì)第一，微球的比表面積大，能夠增加有效反應(yīng)表面積與體積之比，因此可以使表面的化學(xué)反應(yīng)在更小的體積內(nèi)進(jìn)行；第二，采用微球作為載體可以利用一些其他輔助手段如攪拌、液體沖刷等實(shí)現(xiàn)一種介于固-液反應(yīng)和液-液反應(yīng)之間的反應(yīng)體系，從而加快體系的反應(yīng)速度；第三，微球依靠光子晶體固有的反射峰作為其編碼方式，編碼方式簡(jiǎn)單，穩(wěn)定，并且便于解碼。第四，隨著微球表面功能化基團(tuán)的改變，可以擴(kuò)展微球的用途。例如將光子晶體和水凝膠結(jié)合起來(lái)作為載體進(jìn)行編碼成為高通量篩選以及組合化學(xué)等領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。在膠體晶體微球載體中擴(kuò)展水凝膠后，可以賦予微球新的優(yōu)勢(shì)第一，水凝膠的比表面積大，因此可以使表面的化學(xué)反應(yīng)更容易進(jìn)行；第二，可以控制水凝膠收縮和舒張來(lái)控制其體積，以擴(kuò)展其用途；第三，以水凝膠為載體可以保持蛋白的活性，提高檢測(cè)的穩(wěn)定性；第四，隨著水凝膠表面功能化基團(tuán)的改變，可以擴(kuò)展水凝膠的用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種制備核殼型膠體晶體水凝膠微球的方法，其制備簡(jiǎn)單，成本低廉，殼層厚度均勻且可控，可重復(fù)性好。為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的這些問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是—種核殼型水凝膠膠體晶體微球，其特征在于所述微球呈核殼結(jié)構(gòu)，核為含有水凝膠的膠體晶體微球，殼為反蛋白石結(jié)構(gòu)的水凝膠；所述核殼型水凝膠膠體晶體微球通過(guò)如下方法制備以膠體晶體微球?yàn)槟０?，將水凝膠前體填充至膠體晶體微球納米粒子之間的孔隙內(nèi)，當(dāng)水凝膠凝膠化之后剝離出微球，再利用溶劑從外向內(nèi)逐步腐蝕微球內(nèi)的膠體納米粒子獲得核殼型水凝膠膠體晶體微球。優(yōu)選的，所述膠體納米粒子選自二氧化硅膠體粒子、二氧化鈦膠體粒子、聚苯乙烯類聚合物膠體粒子中的一種或兩種以上的任意混合，所述膠體粒子的粒徑范圍在50nm-IOOOnm 之間。優(yōu)選的，所述水凝膠選自天然型水凝膠或合成水凝膠；所述天然型水凝膠選自海藻酸鈣、瓊脂糖、膠原、殼聚糖的一種或兩種以上的任意混合；所述合成水凝膠選自HEMA、PEG、丙烯酰胺、NIPAM的一種或兩種以上的任意混合。本發(fā)明的另一目的在于提供一種核殼型水凝膠膠體晶體微球的制備方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)制備膠體晶體微球模板單分散的膠體晶體納米粒子加去離子水稀釋，利用微流控裝置使膠體溶液在連續(xù)相中被剪切成單分散的液滴，固化液滴模板，清洗，煅燒之后，即可獲得膠體晶體微球；(2)將膠體晶體微球進(jìn)行親水處理后，氮?dú)獯蹈?，將微球投入水凝膠聚合前體溶液中，當(dāng)微球的顏色從白色變?yōu)橥该鲿r(shí)固化水凝膠，然后將水凝膠浸泡在去離子水中，根據(jù)微球內(nèi)外不同的膨脹程度從水凝膠中剝離膠體晶體微球；(3)將膠體晶體微球投至調(diào)配好的腐蝕劑中，部分除去膠體粒子模板；即獲得核殼型水凝膠膠體晶體微球。優(yōu)選的，所述方法中使用的微流控裝置選自協(xié)流式或匯聚式微流控裝置，微流控裝置的管道材料選用二氧化硅、特氟龍、PDMS的一種或兩種以上的任意組合。優(yōu)選的，所述方法中使用的膠體溶液選自二氧化硅膠體粒子溶液、二氧化鈦膠體粒子溶液、聚苯乙烯類聚合物膠體粒子溶液中的一種或兩種以上的任意混合，膠體粒子的粒徑控制在50nm-IOOOnm之間。優(yōu)選的，所述方法中步驟(3)中去除液滴模板的腐蝕劑選自氫氟酸、NaOH或焦硫酸鉀、四氫呋喃溶液的一種。本發(fā)明的又一目的在于提供一種核殼型水凝膠膠體晶體微球在細(xì)胞培養(yǎng)及蛋白質(zhì)、核酸及細(xì)胞的多元檢測(cè)方面的應(yīng)用。優(yōu)選的，進(jìn)行檢測(cè)應(yīng)用時(shí)，所述微球殼體的水凝膠結(jié)構(gòu)與生物分子結(jié)合或反應(yīng)，微球內(nèi)核的膠體晶體的反射峰可用于生物分子編碼。優(yōu)選的，進(jìn)行檢測(cè)應(yīng)用時(shí)，所述微球的殼體水凝膠固定待測(cè)的蛋白或核酸分子或所述微球的殼體水凝膠粘附待測(cè)的細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。本發(fā)明利用膠體晶體微球?yàn)槟０?，將水凝膠填充至膠體晶體微球內(nèi)納米粒子孔隙之間，部分地去除模板后，即可形成核殼型的水凝膠膠體晶體微球，是一種能符合細(xì)胞培養(yǎng)，蛋白質(zhì)，核酸，細(xì)胞多元檢測(cè)以及藥物篩選等載體要求的復(fù)合微球。本發(fā)明利用微流控技術(shù)制備液滴模板，經(jīng)過(guò)固化、清洗后可得到單分散較好的膠體晶體微球。以微球?yàn)槟０灏阉z填充至整個(gè)膠體晶體微球內(nèi)的納米粒子孔隙之間，并且去除部分模板，即可形成符合細(xì)胞培養(yǎng)以及蛋白質(zhì)、基因、細(xì)胞、藥物篩選等載體要求的聚合物微球。本發(fā)明進(jìn)行制備核殼型水凝膠膠體晶體微球的方法包括采用膠體晶體微球?yàn)槟０澹瑢⑺z前體填充至膠體晶體微球納米粒子之間的孔隙內(nèi)，待水凝膠凝膠化之后剝離出微球，再利用溶劑逐步腐蝕微球內(nèi)的膠體納米粒子，即可形成核殼型的水凝膠膠體晶體微球，該微球能符合細(xì)胞培養(yǎng)及蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞等多元檢測(cè)的要求。所述方法包括以下步驟
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1)單分散的膠體晶體納米粒子加去離子水稀釋，利用微流控裝置使膠體溶液在連續(xù)相中被剪切成單分散的液滴，固化液滴模板，清洗，煅燒之后，即可獲得膠體晶體微球。2)親水處理膠體晶體微球后，氮?dú)獯蹈?，將微球投入水凝膠聚合前體溶液中。當(dāng)微球從白色變?yōu)橥该鲿r(shí)固化水凝膠。接著將水凝膠浸泡在溶液中，根據(jù)微球內(nèi)外不同的膨脹程度，將微球從水凝膠中剝離出來(lái)。3)將膠體晶體微球投至一定濃度的腐蝕劑中，部分除去膠體粒子模板得到核殼型水凝膠膠體晶體微球。核殼型水凝膠膠體晶體微球的外層就是單純的反結(jié)構(gòu)水凝膠，內(nèi)核就是含有水凝膠的膠體晶體微球。該核殼型水凝膠膠體晶體微球具有生物學(xué)應(yīng)用。制備的核殼型水凝膠膠體晶體微球，其殼層的厚度均勻、可控，并且與試劑的濃度及腐蝕時(shí)間有關(guān)。核殼型水凝膠膠體晶體微球可用于細(xì)胞培養(yǎng)及蛋白質(zhì)、核酸及細(xì)胞的多元檢測(cè)中。核殼型水凝膠膠體晶體微球外層的水凝膠結(jié)構(gòu)可用來(lái)與生物分子結(jié)合或反應(yīng)，內(nèi)核的膠體晶體的反射峰可用于生物分子編碼。核殼型水凝膠膠體晶體微球進(jìn)行生物學(xué)應(yīng)用時(shí)，待測(cè)的蛋白或核酸分子可固定在外層的水凝膠中，待測(cè)的細(xì)胞可粘附生長(zhǎng)于水凝膠網(wǎng)格上。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中的方案，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明核殼型水凝膠膠體晶體微球利用內(nèi)核的光子晶體的反射峰位置作為編碼，隨著膠體粒子尺寸不同，反射峰的位置可以整個(gè)可見(jiàn)光區(qū)域，甚至可以是紅外或紫外區(qū)域。本發(fā)明核殼型水凝膠膠體晶體微球殼層水凝膠的折射率較大時(shí)，可以形成雙峰編碼。一個(gè)是內(nèi)核的光子晶體的反射峰，一個(gè)是殼層反結(jié)構(gòu)水凝膠的反射峰，可以增加編碼量。本發(fā)明核殼型水凝膠膠體晶體微球殼層由水凝膠組成，水凝膠的比表面積比較大，滿足適合高靈敏度載體的要求，能獲得高的檢測(cè)靈敏度。當(dāng)殼層水凝膠為天然性水凝膠時(shí)，由于其良好的生物相容性，不僅可適用于生物分析，還可用于細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞多元檢測(cè)等領(lǐng)域。由于光子晶體的反射結(jié)構(gòu)，載體表面對(duì)熒光標(biāo)記的熒光的吸收降低，所以能夠提高熒光的強(qiáng)度和檢測(cè)反應(yīng)的靈敏度。


下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述圖1為核殼型水凝膠膠體晶體微球制備方法流程圖。其中1為膠體晶體微球模板；2為水凝膠填充后的膠體晶體微球；3為腐蝕后形成的核殼型水凝膠膠體晶體微球。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)上述方案做進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中采用的實(shí)施條件可以根據(jù)具體廠家的條件做進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實(shí)施條件通常為常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的條件。實(shí)施例1核殼型海藻酸鈣S^2膠體晶體微球制備1.有序膠體晶體微球的制備將單分散的S^2納米粒子加去離子水調(diào)節(jié)濃度至20% -30% ；利用玻璃微流控裝置使膠體溶液在流動(dòng)相中剪切成單分散的液滴，將液滴模板置于烘箱60°C干燥固化，去除表面或內(nèi)部的雜質(zhì)后，置于馬弗爐中800°C煅燒池。2.海藻酸鈣水凝膠填充首先將制備好的S^2膠體晶體微球進(jìn)行親水處理，浸泡在體積比為70%和30%的濃硫酸和雙氧水的混合液中12h以使微球表面羥基化。在以超純水反復(fù)清洗并用氮?dú)獯蹈珊?，膠體晶體微球即可被浸泡在濃度為-3% (w/v)海藻酸鈉水凝膠聚合前體溶液中，至微球從白色變?yōu)椴噬龆嘤嗟暮Ｔ逅徕c溶液，加入足量的2% (w/v)的CaCl2溶液，幾分鐘后，海藻酸鈉溶液可凝膠化。然后將海藻酸鈣水凝膠浸泡至去離子水中，由于微球內(nèi)外不同的膨脹系數(shù)，在微球表面會(huì)形成縫隙，很容易就可以將微球從水凝膠中剝離出來(lái)。3.部分模板去除將完全剝離后的填充有海藻酸鈣的SiO2微球浸泡至HF溶液中，HF溶液可從外向內(nèi)均勻腐蝕SiO2S子，根據(jù)腐蝕時(shí)間的不同，可形成不同厚度的核殼型海
藻酸鈣二氧化硅微球。實(shí)施例2核殼型瓊脂糖聚苯乙烯膠體晶體微球的制備1.有序膠體晶體微球的制備將單分散的PS納米粒子加去離子水調(diào)節(jié)濃度至20% -30% ；利用玻璃微流控裝置使膠體溶液在流動(dòng)相中剪切成單分散的液滴，將液滴模板置于烘箱60°C干燥固化，去除表面或內(nèi)部的雜質(zhì)后，置于馬弗爐中800°C煅燒池。2.瓊脂糖水凝膠填充首先將制備好的PS膠體晶體微球進(jìn)行親水處理，浸泡在體積比為70%和30%的濃硫酸和雙氧水的混合液中12h以使微球表面羥基化。在以超純水反復(fù)清洗并用氮?dú)獯蹈珊?，PS微球即可被浸泡在濃度為-5% (w/v)瓊脂糖水凝膠聚合前體溶液中并保持70°C以上的水浴，至微球從白色變?yōu)椴噬?，吸出多余的瓊脂糖溶液，冷卻至瓊脂糖凝膠化。然后將瓊脂糖水凝膠浸泡至去離子水溶液中，由于微球內(nèi)外不同的膨脹系數(shù)，在微球表面會(huì)形成縫隙，可迅速將微球從水凝膠中剝離出來(lái)。3.部分模板去除將完全剝離后的填充有瓊脂糖的PS微球浸泡至四氫呋喃溶液中，HF溶液可從外向內(nèi)均勻腐蝕PS粒子，根據(jù)腐蝕時(shí)間的不同，可形成不同厚度的核殼型瓊脂糖聚苯乙烯微球。實(shí)施例3核殼型PEGDA的Si02膠體晶體微球的制備1.有序膠體晶體微球的制備類似實(shí)施例1。2. PEGDA水凝膠的填充首先將制備好的SW2膠體晶體微球進(jìn)行親水處理，浸泡在體積比為70%和30%的濃硫酸和雙氧水的混合液中12h以使微球表面羥基化。在以超純水反復(fù)清洗并用氮?dú)獯蹈珊?，膠體晶體微球即可被浸泡在一定濃度并摻有的光引發(fā)劑的PEGDA水凝膠聚合前體溶液中，至微球從白色變?yōu)椴噬?，吸出多余PEGDA溶液，待強(qiáng)紫外照射Ι-aiiin后，PEGDA溶液可凝膠化。然后將PEGDA水凝膠浸泡至去離子水溶液中，很方便將微球剝離出來(lái)。3.部分模板去除類似實(shí)施例1。實(shí)施例4核殼型海藻酸鈣二氧化硅微球用于細(xì)胞多元檢測(cè)1.核殼型海藻酸鈣二氧化硅微球制備及滅菌根據(jù)選取S^2的不同尺寸，制備6種不同反射峰的核殼型海藻酸鈣二氧化硅微球，并將其浸泡于75%酒精溶液中過(guò)夜，再用無(wú)菌的PBS (7. 4)反復(fù)清洗，并浸泡在PBS中。2.細(xì)胞接種將6種無(wú)菌的核殼型海藻酸鈣二氧化硅微球分別置于六孔板中，將6種已消化好的細(xì)胞分別接種至六孔板的六個(gè)孔中。將其置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37°C，5% CO2),培養(yǎng)Μ-4 ι。3.細(xì)胞混合經(jīng)過(guò)培養(yǎng)之后，當(dāng)觀察到細(xì)胞已粘附生長(zhǎng)于殼層海藻酸鈣表面時(shí)，將6個(gè)孔中的細(xì)胞混合至一個(gè)新孔中。4.加藥在新孔中加入藥物，繼續(xù)培養(yǎng)Mh。5.檢測(cè)將細(xì)胞進(jìn)行染色，根據(jù)熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱，可判斷細(xì)胞的存活率；根據(jù)反射光譜，可進(jìn)行解碼，最后可以同時(shí)得到藥物對(duì)不同細(xì)胞的不同作用。上述實(shí)例只為說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人是能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所做的等效變換或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種核殼型水凝膠膠體晶體微球，其特征在于所述微球呈核殼結(jié)構(gòu)，核為含有水凝膠的膠體晶體微球，殼為反蛋白石結(jié)構(gòu)的水凝膠；所述核殼型水凝膠膠體晶體微球通過(guò)如下方法制備以膠體晶體微球?yàn)槟０?，將水凝膠前體填充至膠體晶體微球納米粒子之間的孔隙內(nèi)，當(dāng)水凝膠凝膠化之后剝離出微球，再利用溶劑從外向內(nèi)逐步腐蝕微球內(nèi)的膠體納米粒子獲得核殼型水凝膠膠體晶體微球。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核殼型水凝膠膠體晶體微球，其特征在于所述膠體納米粒子選自二氧化硅膠體粒子、二氧化鈦膠體粒子、聚苯乙烯類聚合物膠體粒子中的一種或兩種以上的任意混合，所述膠體粒子的粒徑范圍在50nm-1000nm之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核殼型水凝膠膠體晶體微球，其特征在于所述水凝膠選自天然型水凝膠或合成水凝膠；所述天然型水凝膠選自海藻酸鈣、瓊脂糖、膠原、殼聚糖的一種或兩種以上的任意混合；所述合成水凝膠選自HEMA、PEG、丙烯酰胺、NIPAM的一種或兩種以上的任意混合。
4.一種權(quán)利要求1所述的核殼型水凝膠膠體晶體微球的制備方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)制備膠體晶體微球模板單分散的膠體晶體納米粒子加去離子水稀釋，利用微流控裝置使膠體溶液在連續(xù)相中被剪切成單分散的液滴，固化液滴模板，清洗，煅燒之后，即可獲得膠體晶體微球；(2)將膠體晶體微球進(jìn)行親水處理后，氮?dú)獯蹈?，將微球投入水凝膠聚合前體溶液中，當(dāng)微球的顏色從白色變?yōu)橥该鲿r(shí)固化水凝膠，然后將水凝膠浸泡在去離子水中，根據(jù)微球內(nèi)外不同的膨脹程度從水凝膠中剝離膠體晶體微球；(3)將膠體晶體微球投至調(diào)配好的腐蝕劑中，部分除去膠體粒子模板；即獲得核殼型水凝膠膠體晶體微球。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述方法中使用的微流控裝置選自協(xié)流式或匯聚式微流控裝置，微流控裝置的管道材料選用二氧化硅、特氟龍、PDMS的一種或兩種以上的任意組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述方法中使用的膠體溶液選自二氧化硅膠體粒子溶液、二氧化鈦膠體粒子溶液、聚苯乙烯類聚合物膠體粒子溶液中的一種或兩種以上的任意混合，膠體粒子的粒徑控制在50nm-1000nm之間。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述方法中步驟(3)中去除液滴模板的腐蝕劑選自氫氟酸、NaOH或焦硫酸鉀、四氫呋喃溶液的一種。
8.—種權(quán)利要求1所述的核殼型水凝膠膠體晶體微球在細(xì)胞培養(yǎng)及蛋白質(zhì)、核酸及細(xì)胞的多元檢測(cè)方面的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于進(jìn)行檢測(cè)應(yīng)用時(shí)，所述微球殼體的水凝膠結(jié)構(gòu)與生物分子結(jié)合或反應(yīng)，微球內(nèi)核的膠體晶體的反射峰可用于生物分子編碼。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于進(jìn)行檢測(cè)應(yīng)用時(shí)，所述微球的殼體水凝膠固定待測(cè)的蛋白或核酸分子或所述微球的殼體水凝膠粘附待測(cè)的細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種核殼型水凝膠膠體晶體微球，其特征在于所述微球呈核殼結(jié)構(gòu)，核為含有水凝膠的膠體晶體微球，殼為反蛋白石結(jié)構(gòu)的水凝膠；所述核殼型水凝膠膠體晶體微球通過(guò)如下方法制備以膠體晶體微球?yàn)槟０?，將水凝膠前體填充至膠體晶體微球納米粒子之間的孔隙內(nèi)，當(dāng)水凝膠凝膠化之后剝離出微球，再利用溶劑從外向內(nèi)逐步腐蝕微球內(nèi)的膠體納米粒子獲得核殼型水凝膠膠體晶體微球。該微球可以應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)及蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞等多元檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域中。
文檔編號(hào)C12M3/00GK102380335SQ201110272030
公開(kāi)日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2011年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月15日
發(fā)明者上官鳳棲, 程瑤, 趙遠(yuǎn)錦, 錢晶蓮, 顧忠澤 申請(qǐng)人:東南大學(xué)