本發(fā)明涉及一種細(xì)菌纖維素的改進(jìn)發(fā)酵方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

細(xì)菌纖維素(BC)是細(xì)菌分泌物，由單純的葡萄糖縮聚而成，其纖維含量和聚合度都較高。目前合成的生物纖維素結(jié)構(gòu)較單一，孔隙尺寸相對(duì)較少，其應(yīng)用受到限制，一般通過后期在纖維素表面負(fù)載具有特定化學(xué)性質(zhì)的化合物對(duì)其進(jìn)行改性，但存在復(fù)合程度不夠，負(fù)載后容易脫附的問題。文獻(xiàn)1(羅成成,纖維素的改性及應(yīng)用研究進(jìn)展.2015:767-773)總結(jié)了三大類對(duì)纖維素進(jìn)行改性的方法，即物理改性、化學(xué)改性和生物改性，上述方法均為先獲得纖維素成品，再對(duì)其進(jìn)行后期改性，此類改性容易造成纖維素晶體形貌的改變，使其喪失纖維素原有的高結(jié)晶度、高強(qiáng)度等優(yōu)良特性。文獻(xiàn)2(Keshk S,etc..Influence of lignosulfonate on crystal structure and productivity of bacterial cellulose in a static culture,2006,40(1):4-8)報(bào)道了一種通過向發(fā)酵液中添加木素磺酸鹽的方法對(duì)細(xì)菌纖維素進(jìn)行改性，該方法在提高纖維素纖維之間結(jié)合力的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生一定的纖維素?cái)鄬蝇F(xiàn)象，使得最終的改性產(chǎn)物尺寸受到影響，應(yīng)用受到限制。文獻(xiàn)3(趙艷鋒.纖維素的改性技術(shù)及進(jìn)展.2006,20(2):11-14)利用纖維素酶處理細(xì)菌纖維素，雖提高了纖維素間的結(jié)合力，但是纖維素酶會(huì)降解纖維素鏈。

綜上所述，改性條件以及改性方法的選取對(duì)于纖維素的改性效果起到至關(guān)重要的影響，利用合理的改性方法在不破壞原有纖維的同時(shí)進(jìn)行相關(guān)改性，對(duì)于纖維素的后期應(yīng)用范圍的拓寬具有深遠(yuǎn)影響。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明提供了一種細(xì)菌纖維素的改進(jìn)發(fā)酵方法，該方法通過在木醋桿菌發(fā)酵過程中，加入不同的干擾因子對(duì)其發(fā)酵過程進(jìn)行調(diào)控，在保證纖維素原有晶型的同時(shí)，改變最終產(chǎn)物細(xì)菌纖維素的微觀結(jié)構(gòu)以及持水量。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種細(xì)菌纖維素的改進(jìn)發(fā)酵方法，具體步驟如下：

將木醋桿菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期后，在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入干擾因子，發(fā)酵結(jié)束后收集得到原位改性的細(xì)菌纖維素，所述的干擾因子選自二硫蘇糖醇、氯霉素、吐溫-80、乳化劑OP-10、石英砂或納米二氧化硅。

所述的干擾因子為二硫蘇糖醇時(shí)，添加量為0.1-0.2mg/mL發(fā)酵液。

所述的干擾因子為氯霉素時(shí)，添加量為0.05-0.15mg/mL發(fā)酵液。

所述的干擾因子為吐溫-80時(shí)，添加量為4-6mg/mL發(fā)酵液。

所述的干擾因子為乳化劑OP-10時(shí)，添加量為4-6mg/mL發(fā)酵液。

所述的干擾因子為石英砂時(shí)，添加量為15-25mg/mL發(fā)酵液。

所述的干擾因子為納米二氧化硅時(shí)，添加量為3-5mg/mL發(fā)酵液。

本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，成本低，有效避免了現(xiàn)有的細(xì)菌纖維素后期改性的方法易引起的纖維斷裂、結(jié)合程度低、改性效果不明顯的問題。二硫蘇糖醇干擾發(fā)酵得到的纖維素直徑分布范圍較大；氯霉素干擾發(fā)酵得到的纖維素更加容易結(jié)團(tuán)；吐溫-80會(huì)讓原本均勻的纖維素變得粗細(xì)不一失去三維立體輪廓；乳化劑OP-10干擾之后略微增大了纖維素的尺寸；石英砂的加入讓整個(gè)纖維素網(wǎng)絡(luò)顯得更加致密，同時(shí)纖維素尺寸增大；納米二氧化硅和石英砂類似，都增加了整個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)的擾動(dòng)程度，干擾過后的纖維素都顯得比較修長(zhǎng)。此外，原始纖維素是一種非常好的持水材料，吐溫-80干擾發(fā)酵得到的纖維素的持水量明顯升高，乳化劑OP、二硫蘇糖醇干擾發(fā)酵得到的纖維素的持水量較未加入干擾因子之前變化不大，氯霉素干擾發(fā)酵得到的纖維素的持水量大大降低。

綜上，本發(fā)明能夠根據(jù)實(shí)際應(yīng)用需要，在細(xì)菌纖維素的發(fā)酵過程中，通過加入不同的干擾因子，在保證纖維素原有晶型的同時(shí)，調(diào)控最終產(chǎn)物細(xì)菌纖維素的微觀結(jié)構(gòu)以及持水量，滿足實(shí)際需求。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1發(fā)酵過程中，添加不同干擾劑進(jìn)行發(fā)酵過程干擾之后，得到的產(chǎn)物和未添加干擾劑發(fā)酵獲得產(chǎn)物的SEM圖。

圖2是實(shí)施例2發(fā)酵過程中，添加不同干擾劑進(jìn)行發(fā)酵過程干擾之后，得到的產(chǎn)物和未添加干擾劑發(fā)酵獲得產(chǎn)物的XRD圖。

圖3是實(shí)施例3發(fā)酵過程中，添加不同干擾劑進(jìn)行發(fā)酵過程干擾之后，得到的產(chǎn)物和未添加干擾劑發(fā)酵獲得產(chǎn)物的持水量對(duì)比圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述。

本發(fā)明中種子液的制備以及參數(shù)監(jiān)測(cè)可參考現(xiàn)有方法，其中種子液可通過以下步驟制得：

將4℃低溫保藏的菌種于30℃條件下靜置20min，用接種環(huán)挑取一環(huán)菌種劃線于固體平板培養(yǎng)基中，將平板培養(yǎng)基于30℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)36h。將已活化種子用接種環(huán)挑取2～3環(huán)，接種到裝有100mL種子液的500mL錐形瓶中，然后放入搖床中以120-160rpm往復(fù)搖晃培養(yǎng)48h。

固體培養(yǎng)基組成(g/100mL)：葡萄糖2.0，蔗糖1.0，硫酸鎂0.04，檸檬酸0.11，磷酸二氫鈉0.25，蛋白胨1.0，瓊脂1.8，酵母浸粉0.1。pH＝6.0。121℃滅菌30min。

種子液組成(g/100mL)：葡萄糖2.0，硫酸銨0.6，磷酸二氫鉀0.1，硫酸鎂0.04，蛋白胨0.3，酵母浸粉0.225，羧甲基纖維素鈉0.04。121℃滅菌30min。

除干擾劑外，發(fā)酵液的基本組成(g/100mL)：葡萄糖2.25；蔗糖2.75；硫酸銨0.1；磷酸二氫鉀0.5；硫酸鎂0.07；乳酸鈣0.02；蛋白胨1.0；酵母浸粉0.75；醋酸0.15；檸檬酸0.06；羧甲基纖維素鈉0.04。121℃滅菌30min。

微觀結(jié)構(gòu)形態(tài)的表征：掃描電鏡觀察細(xì)菌纖維素的微觀表面形態(tài)。將樣品進(jìn)行冷凍干燥，剪取一塊5mm×5mm的樣品，用導(dǎo)電膠將其固定于樣品臺(tái)，在真空的條件下對(duì)其進(jìn)行噴金操作處理，將倍率調(diào)節(jié)至10000倍，進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)的觀察。

結(jié)晶狀態(tài)表征：將原位修飾的細(xì)菌纖維素進(jìn)行X射線衍射分析，得到改性材料的晶體結(jié)構(gòu)。把凍干之后的細(xì)菌纖維素，貼上雙面膠然后固定在樣品臺(tái)中央，利用銅靶發(fā)出的Kα射線，將波長(zhǎng)設(shè)置為以0.05°/0.1s、40kV、40mA、2θ為10-40°條件下進(jìn)行掃描。

纖維素結(jié)晶度可用下式求得：

Cr I^XRD＝(Ⅰ₍₂₀₀₎–Ⅰ_(am))/Ⅰ₍₂₀₀₎×100％

Cr I表示結(jié)晶指數(shù)，Ⅰ₍₂₀₀₎：(200)晶面峰強(qiáng)，Ⅰ_(am)：無(wú)定形區(qū)峰強(qiáng)。

持水量表征：為了去除不必要的水分，將含有較多水分的改性纖維素常溫常壓靜置5分鐘，然后再用濾紙將殘余的水分全部吸收干凈。濾紙吸收過后的纖維素重量記為W_wet。將稱完的細(xì)菌纖維素利用凍干機(jī)進(jìn)行凍干，得到絕干重量并記為W_dry。按照公式(1-1)計(jì)算即可得到纖維素持水量(water holding capacity)：

持水量(％)＝(W_wet-W_dry)/W_dry×100％

實(shí)施例1

把種子液接種到含有裝有100mL發(fā)酵液的500mL錐形瓶中，160轉(zhuǎn)每分鐘，30℃條件下進(jìn)行72h動(dòng)態(tài)培養(yǎng)。發(fā)酵進(jìn)行到20h，加入不同的干擾因子，對(duì)整個(gè)細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)發(fā)酵過程進(jìn)行干擾。不同干擾因子的量為：二硫蘇糖醇10mg、氯霉素5mg、吐溫-80 400mg、乳化劑OP-10 400mg、石英砂1500mg、納米二氧化硅300mg，相應(yīng)改性發(fā)酵得到的產(chǎn)物細(xì)菌纖維素為BC-A、BC-B、BC-C、BC-D、BC-E和BC-F。

圖1為添加干擾因子改性過后的和未添加干擾因子的產(chǎn)物細(xì)菌纖維素的掃描電鏡圖，a為二硫蘇糖醇，b為氯霉素，c為吐溫-80，d為乳化劑OP-10，e為石英砂，f為納米二氧化硅，g為未添加干擾因子發(fā)酵得到的細(xì)菌纖維素。由圖1可以看出，不添加任何干擾因子的細(xì)菌纖維素網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)清晰、相對(duì)較為疏松，纖維直徑變化較為均勻。添加干擾因子的細(xì)菌纖維素相對(duì)未添加的微觀結(jié)構(gòu)上發(fā)生了較大的變化。其中二硫蘇糖醇修飾的纖維直徑區(qū)別較大；氯霉素干擾的纖維素更加容易結(jié)團(tuán)；吐溫-80會(huì)讓原本均勻的纖維素變得粗細(xì)不一失去三維立體輪廓；乳化劑OP-10干擾之后略微增大了纖維素的尺寸；石英砂的加入讓整個(gè)纖維素網(wǎng)絡(luò)顯得更加致密，并伴隨著纖維素尺寸的增加；納米二氧化硅和石英砂類似，都增加了整個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)的擾動(dòng)程度，因此干擾過后的纖維素都顯得比較修長(zhǎng)。

實(shí)施例2

把種子液接種到含有裝有100mL發(fā)酵液的500mL錐形瓶中，160轉(zhuǎn)每分鐘，30℃條件下進(jìn)行72h動(dòng)態(tài)培養(yǎng)。發(fā)酵進(jìn)行到35h，加入不同的干擾因子，對(duì)整個(gè)細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)發(fā)酵過程進(jìn)行干擾。不同干擾因子的量為：二硫蘇糖醇15mg、氯霉素10mg、吐溫-80 500mg、乳化劑OP-10 500mg、石英砂2000mg、納米二氧化硅400mg，相應(yīng)改性發(fā)酵得到的產(chǎn)物細(xì)菌纖維素為BC-A、BC-B、BC-C、BC-D、BC-E和BC-F。

圖2為添加干擾因子改性過后的和未添加干擾因子的產(chǎn)物細(xì)菌纖維素的XRD圖。通過圖2，計(jì)算不同干擾因子干擾的纖維素的結(jié)晶指數(shù)，結(jié)果見表1。由表1可見，除了表面活性劑OP-10使得纖維素結(jié)晶度降低的明顯之外，其余的幾種干擾因子對(duì)于結(jié)晶度影響不大。

表1不同干擾因子干擾的纖維素的結(jié)晶指數(shù)

實(shí)施例3

把種子液接種到含有裝有100mL發(fā)酵液的500mL錐形瓶中，160轉(zhuǎn)每分鐘，30℃條件下進(jìn)行72h動(dòng)態(tài)培養(yǎng)。發(fā)酵進(jìn)行到50h，加入不同的干擾因子，對(duì)整個(gè)細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)發(fā)酵過程進(jìn)行干擾。不同干擾因子的量為：二硫蘇糖醇20mg、氯霉素15mg、吐溫-80 600mg、乳化劑OP-10 600mg、石英砂2500mg、納米二氧化硅500mg，相應(yīng)改性發(fā)酵得到的產(chǎn)物細(xì)菌纖維素為BC-A、BC-B、BC-C、BC-D、BC-E和BC-F。

對(duì)上述的干擾過后的纖維素進(jìn)行持水量表征，得到結(jié)果如圖3所示。原始纖維素是一種非常好的持水材料，改性之后，吐溫-80可以將細(xì)菌纖維素持水量從原有的90倍提高到105倍自身重量，二硫蘇糖醇和OP-10會(huì)稍微降低細(xì)菌纖維素的持水量，氯霉素和納米二氧化硅會(huì)將持水能力將至70倍自身重量。