本發(fā)明涉及葛根黃酮，尤其涉及一種通過酶對葛根黃酮進(jìn)行改性的方法。

背景技術(shù)：

黃酮類化合物是植物多酚的一個亞群，是植物重要的一類次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于水果、蔬菜、豆類、茶葉等許多食源性植物中。由于其結(jié)構(gòu)千差萬別，生理活性也多種多樣，可以用作醫(yī)療藥物、抗菌劑、抗氧化劑，能夠治療多種疾病和抑制醫(yī)學(xué)上的機(jī)能紊亂。但天然黃酮類化合物多以糖苷類形式存在，即通過O-糖苷鍵或C-糖苷鍵與糖基相連，由于糖的種類、數(shù)量、連接位置及連接方式的不同，可以組成各種各樣的黃酮苷，黃酮苷類脂溶性較差，限制了其生物活性的發(fā)揮，而且部分黃酮苷類沒有其苷元的特性。因此，可通過定向修飾黃酮類化合物的分子結(jié)構(gòu)以發(fā)揮其特定功能。化學(xué)法選擇性差，反應(yīng)不易控制，加之需要高溫高壓，反應(yīng)產(chǎn)物為多種物質(zhì)的混合物，給后續(xù)分離帶來極大的困難，同時排出大量的廢液，給環(huán)境造成極大的污染，并且其使用的試劑不適合添加到食品中，其溶劑殘留問題將阻礙改性產(chǎn)物在食品等行業(yè)中的應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種葛根黃酮改性的方法，采用柚皮苷酶對葛根黃酮進(jìn)行水解處理，將葛根黃酮苷水解為具有更高抗氧化活性以及更好脂溶性的苷元，以拓展葛根黃酮在食品等行業(yè)的應(yīng)用。

技術(shù)方案：本發(fā)明所述的葛根黃酮改性的方法，包括：將葛根黃酮分散于緩沖液中，加入柚皮苷酶進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫度為45-65℃；反應(yīng)結(jié)束后過濾，濾液用乙酸乙酯萃取，再對萃取液進(jìn)行減壓蒸餾和干燥，得葛根黃酮粉改性產(chǎn)物。

所述緩沖液的pH為3.5-5.5，優(yōu)選的，pH為4.0-5.0，更優(yōu)選的，pH為4.5。所述的緩沖液為檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液。本領(lǐng)域人員知曉，所述的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液通常根據(jù)pH要求由0.2M磷酸氫二鈉與0.1M檸檬酸按照不同比例混合而得。

將葛根黃酮分散于緩沖液中，料液比為1:5-1:25，優(yōu)選的，料液比為1:15-1:25，更優(yōu)選的，料液比為1:20。

所述柚皮苷酶的添加量為：每克葛根黃酮中添加40-200IU柚皮苷酶，優(yōu)選的，每克葛根黃酮中添加80-160IU柚皮苷酶，更優(yōu)選的，每克葛根黃酮中添加120IU柚皮苷酶。

為使反應(yīng)進(jìn)行完全，所述反應(yīng)的時間為0.5-2.5h，優(yōu)選的，反應(yīng)時間為1-1.5h，反應(yīng)溫度為45-65℃。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

葛根黃酮中蘆丁含量較高，而蘆丁的糖苷部位由一分子葡萄糖和一分子鼠李糖相連。柚皮苷酶由β-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶組成，可降解黃酮苷上的葡萄糖和鼠李糖形成相應(yīng)的苷元，提高抗氧化活性和脂溶性。

與傳統(tǒng)的化學(xué)法相比，采用柚皮苷酶對葛根黃酮粉進(jìn)行處理，反應(yīng)條件溫和，無污染，除了使用食品級乙酸乙酯外，無任何有機(jī)溶劑的加入，無有毒溶劑殘留。

采用柚皮苷酶對葛根黃酮粉進(jìn)行處理，有效提高了其抗氧化活性和脂溶性，拓展了其在食品等行業(yè)的應(yīng)用。與未經(jīng)處理相比，DPPH自由基清除率由25.89％提高到84.72％，總還原力由0.139提高到0.421，羥基自由基清除率由3.19％提高到45.65％，三種抗氧化性能分別達(dá)到同濃度維生素C的89.77％、62.46％以及80.19％。衡量脂溶性的透光率從0.108提高到1.000。

附圖說明

圖1為pH對改性產(chǎn)物抗氧化活性的影響；

圖2為料液比對改性產(chǎn)物抗氧化活性的影響；

圖3為酶添加量對改性產(chǎn)物抗氧化活性的影響；

圖4為溫度對改性產(chǎn)物抗氧化活性的影響；

圖5為水解時間對改性產(chǎn)物抗氧化活性的影響。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明的各種等價形式的修改均落于本申請所附權(quán)利要求所限定的范圍。

本發(fā)明實施例中所用的柚皮苷酶的酶活為20000IU/g，購自上海伊卡生物技術(shù)有限公司，貨號NO102-25MG。

本發(fā)明實施例中的參數(shù)測定方法如下：

1、羥基自由基清除率測定：

將樣品用乙醇配成5g/L溶液。取1.0mL，分別加入9.0mmol/L FeSO₄、9.0mmol/L水楊酸-乙醇各1.0mL，對照組以蒸餾水1.0mL代替樣品溶液。最后加8.8mmol/L H₂O₂啟動反應(yīng)，37℃水浴反應(yīng)0.5h后，以蒸餾水調(diào)零，在波長510nm下測定吸光度。以Vc作陽性對照品，臨用前用蒸餾水配制成與樣品溶液相同的質(zhì)量濃度。同法操作，進(jìn)行對照試驗。

清除率(％)＝([A₀-Ax-Ax₀)/A₀]×100計算清除率。

式中：A₀用蒸餾水代替水楊酸時測得的不同提取物濃度本底吸光度；

Ax為樣品吸光度值；

Ax₀為用水代替樣品測定的吸光度值。

2、DPPH自由基清除率測定：

將待測樣品用無水乙醇配成5g/L。用乙醇做溶劑將DPPH配制成濃度為1.183g/L乙醇溶液作為儲備液，臨用前用無水乙醇溶液稀釋成0.1183g/L。

測定：樣品溶液+溶液各2ml為Ai(為樣品抑制吸收值)；樣品溶液+無水乙醇2ml為Ac(為樣品對照)；DPPH溶液+無水乙醇各2ml為Aj(為無抑制吸收值)；4ml無水乙醇為無抑制吸收值對照。分別充分振蕩混勻，室溫靜止30min后在517nm處測定吸收值(每個值同時測定兩管)。

抑制率＝(Aj-Ai)*100％/Aj，結(jié)果以Vc作陽性對照。

3、總還原力測定：

將樣品用無水乙醇配成5g/L。取2.5mL樣品液，加入2.5mL 2.5mol/LpH6.6磷酸鹽緩沖液，再加入2.5mL 1％六氰合鐵酸鉀和0.2mL 1％蔗糖酯溶液；充分振蕩混勻；蓋上塞子將該試管置于50℃水浴鍋中保溫20min；取出試管進(jìn)行快速冷卻,然后加入2.5mL 10％TCA，充分振蕩混勻后4 000r/min離心10min；取離心后的上清液2.5mL，加入2.5mL濃度25％甲醇和0.5mL 0.1％三氯化鐵,充分振蕩混勻，靜置10min后測定其在700nm處的吸光度值，用去離子水代替樣品的混合液進(jìn)行還原力參比測定試驗?；旌弦旱奈舛仍綇?qiáng)，表明還原力越強(qiáng)。

4、脂溶性測定：

稱取10mg干燥后的產(chǎn)品，溶于10mL氯仿中，超聲10min使其溶解，配成濃度為1g/L的溶液或懸液，在測之前再在震蕩器上震蕩混勻后用紫外分光光度計測定溶液或懸液在800nm下的透光率。

實施例1

稱取5g葛根黃酮粉，按料液比(g/mL)1:20加入pH5.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，加入0.02g柚皮苷酶，在60℃下水解1h。反應(yīng)結(jié)束后，抽濾，濾液用50mL食品級乙酸乙酯萃取二次。將萃取液40℃減壓蒸餾去除乙酸乙酯，40℃真空干燥。

將真空干燥后的樣品用乙醇溶解，配成5g/L濃度，測定其羥基自由基清除率為23.23％，DPPH自由基清除率為49.17％，總還原力0.215。

實施例2

稱取5g葛根黃酮粉，按料液比(g/mL)1:20加入pH4.5檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，加入0.02g柚皮苷酶，在60℃下水解1.5h。反應(yīng)結(jié)束后，抽濾，濾液用50mL食品級乙酸乙酯萃取二次。將萃取液40℃減壓蒸餾去除乙酸乙酯，40℃真空干燥。

將真空干燥后的樣品用乙醇溶解，配成5g/L濃度，測定其羥基自由基清除率為27.16％，DPPH自由基清除率為64.45％，總還原力0.287。

實施例3

稱取5g葛根黃酮粉，按料液比(g/mL)1:20加入pH4.5檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，加入0.04g柚皮苷酶，在55℃下水解1.5h。反應(yīng)結(jié)束后，抽濾，濾液用50mL食品級乙酸乙酯萃取二次。將萃取液40℃減壓蒸餾去除乙酸乙酯，40℃真空干燥。

將真空干燥后的樣品用乙醇溶解，配成5g/L濃度，測定其羥基自由基清除率為36.57％，DPPH自由基清除率為77.23％，總還原力0.379。

實施例4

稱取5g葛根黃酮粉，按料液比(g/mL)1:20加入pH4.5檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，加入0.03g柚皮苷酶，在55℃下水解1.5h。反應(yīng)結(jié)束后，抽濾，濾液用50mL食品級乙酸乙酯萃取二次。將萃取液40℃減壓蒸餾去除乙酸乙酯，40℃真空干燥。

將真空干燥后的樣品用乙醇溶解，配成5g/L濃度，測定其羥基自由基清除率為45.65％，DPPH自由基清除率為84.72％，總還原力0.421。

空白組：指未經(jīng)酶處理的原料樣品。

對照組1：指除不加酶外，其他操作參照實施例4。

對照組2：指以維生素C為對照品，用水配成5g/L濃度，按法測定DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率以及總還原力。

實驗結(jié)果見表1。

表1

實施例5

稱取5g葛根黃酮粉，按料液比(g/mL)1:20加入不同pH的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，加入0.02g柚皮苷酶，在60℃下水解1h。反應(yīng)結(jié)束后，抽濾，濾液用50mL食品級乙酸乙酯萃取二次。將萃取液40℃減壓蒸餾去除乙酸乙酯，40℃真空干燥，得改性產(chǎn)物。

pH分別設(shè)置為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，考察不同pH對改性產(chǎn)物抗氧化性能的影響，結(jié)果見圖1，pH為4.5時產(chǎn)物抗氧化性能最佳。

實施例6

緩沖液的pH為5.0，料液比分別設(shè)置為1:5,1:10,1:15,1:20,1:25，考察不同料液比對改性產(chǎn)物抗氧化性能的影響，其余實驗步驟同實施例5。

結(jié)果見圖2，料液比為1:20時產(chǎn)物抗氧化性能最佳。

實施例7

緩沖液的pH為4.5，在55℃下水解1.5h，調(diào)整柚皮苷酶的添加量，每克葛根黃酮中分別添加40、80、120、160、200IU柚皮苷酶，考察不同酶量對改性產(chǎn)物抗氧化性能的影響，其余實驗步驟同實施例5。

結(jié)果見圖3，柚皮苷酶的添加量為120IU/g時產(chǎn)物抗氧化性能最佳。

實施例8

緩沖液的pH為4.5，柚皮苷酶的添加量為0.02g，水解1.5h，調(diào)整反應(yīng)溫度分別設(shè)置為45、50、55、60以及65℃，考察不同反應(yīng)溫度對改性產(chǎn)物抗氧化性能的影響，其余實驗步驟同實施例5。

結(jié)果見圖4，溫度為55℃時產(chǎn)物抗氧化性能最佳。

實施例9

緩沖液的pH為4.5，柚皮苷酶的添加量為0.02g，在60℃分別反應(yīng)0.5、1、1.5、2、2.5h，考察不同反應(yīng)時間對改性產(chǎn)物抗氧化性能的影響，其余實驗步驟同實施例5。

結(jié)果見圖5，反應(yīng)1.5h時產(chǎn)物抗氧化性能最佳。