技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及從植物中分離的金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體基因，尤其涉及從玉米中分離的與鋅鐵的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)或儲(chǔ)存有關(guān)的調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIP2基因，本發(fā)明進(jìn)一步涉及調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIP2基因在調(diào)控植物吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)或儲(chǔ)存鋅或鐵能力，促進(jìn)胚和胚乳的發(fā)育或成熟以及增加糧食作物種子鋅鐵含量中的應(yīng)用，屬于植物金屬離子調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的分離和應(yīng)用領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

鋅和鐵是生物體所必需的微量元素，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中有著重要作用(Wintz H,Fox T,Wu YY,et al.Expression profiles of Arabidopsis thaliana in mineral deficiencies reveal novel transporters involved in metal homeostasis.The Journal of biological chemistry 2003,278(48):47644-47653.)。鋅是生物體300多種酶和重要蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)輔助因子(Haydon MJ,Cobbett CS.A novel major facilitator superfamily protein at the tonoplast influences zinc tolerance and accumulation in Arabidopsis.Plant physiology 2007,143(4):1705-1719.)。鋅不僅參與機(jī)體的各種代謝，在生物膜穩(wěn)定和基因表達(dá)調(diào)控等生理機(jī)能中也擔(dān)負(fù)著重要的角色(Mathews WR,Wang F,Eide DJ,et al.Drosophila fear of intimacy encodes a Zrt/IRT-like protein(ZIP)family zinc transporter functionally related to mammalian ZIP proteins.The Journal of biological chemistry 2005,280(1):787-795.)。適量增加植物體內(nèi)鋅的含量可提高作物產(chǎn)量，而鋅的缺乏會(huì)導(dǎo)致葉綠素、脂質(zhì)、蛋白、質(zhì)膜的氧化破壞，植物體內(nèi)鋅離子的過(guò)度積累又會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害。

鐵在細(xì)胞呼吸、光合作用和金屬蛋白的催化反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是重要的電子傳遞體，因此，鐵元素在原核和真核生物的生命活動(dòng)中具有不可替代的功能。另外，細(xì)胞內(nèi)過(guò)高的Fe³⁺/Fe²⁺氧化還原勢(shì)會(huì)導(dǎo)致超氧化合物的產(chǎn)生，對(duì)細(xì)胞造成傷害(Briat JF,Lebrun M.Plant responses to metal toxicity.Comptes rendus de l'Academie des sciences Serie III,Sciences de la vie 1999,322(1):43-54.)。因此，嚴(yán)格控制植物體內(nèi)金屬離子的平衡是至關(guān)重要的。

參與鋅鐵吸收的蛋白主要有三類(lèi)，都是以蛋白家族形式存在的，包括：ZIP，即鋅調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體(Zinc-regulated transporter，ZRT)和鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體(Iron-regulated transporter，IRT)。酵母功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)顯示ZIP家族基因能夠轉(zhuǎn)運(yùn)包括Zn²⁺、Fe²⁺、Cu²⁺、Cd²⁺在內(nèi)的多種金屬離子(Colangelo EP,Guerinot ML.Put the metal to the petal:metal uptake and transport throughout plants.Current opinion in plant biology 2006,9(3):322-330.)。ZIP一般由309-476個(gè)氨基酸殘基組成，有8個(gè)潛在的跨膜結(jié)構(gòu)域和相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，第3和第4跨膜區(qū)之間有一長(zhǎng)的可變區(qū)，可變區(qū)位于胞內(nèi)，其C、N末端位于胞外，該區(qū)富含組氨酸殘基，可能與金屬的結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)(Guerinot ML.The ZIP family of metal transporters.Biochim Biophys Acta 2000,1465(1-2):190-198.)。

目前在擬南芥、水稻、蒺藜、苜蓿、大豆、野生型二粒小麥、葡萄等植物中鑒定出ZIP基因并對(duì)其功能進(jìn)行了研究。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)16個(gè)ZIP家族基因，AtIRT1是通過(guò)酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)分離得到的第一個(gè)ZIP功能基因，其主要在根部表達(dá)，且該基因的過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致鎳的過(guò)度積累(Eide D,Broderius M,Fett J,et al.A novel iron-regulated metal transporter from plants identified by functional expression in yeast.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1996,93(11):5624-5628；Henriques R,Jasik J,Klein M,et al.Knock-out of Arabidopsis metal transporter gene IRT1results in iron deficiency accompanied by cell differentiation defects.Plant molecular biology 2002,50(4-5):587-597；Varotto C,Maiwald D,Pesaresi P,et al.The metal ion transporter IRT1is necessary for iron homeostasis and efficient photosynthesis in Arabidopsis thaliana.The Plant journal:for cell and molecular biology 2002,31(5):589-599；Vert G,Grotz N,Dedaldechamp F,et al.IRT1,an Arabidopsis transporter essential for iron uptake from the soil and for plant growth.Plant Cell 2002,14(6):1223-1233；Nishida S,Tsuzuki C,Kato A,et al.AtIRT1,the primary iron uptake transporter in the root,mediates excess nickel accumulation in Arabidopsis thaliana.Plant&cell physiology 2011,52(8):1433-1442.)。AtIRT2主要在根部表達(dá)，定位在囊泡，推測(cè)具有細(xì)胞內(nèi)過(guò)量金屬元素的解毒功能(Vert G,Briat JF,Curie C.Arabidopsis IRT2gene encodes a root-periphery iron transporter.The Plant journal:for cell and molecular biology 2001,26(2):181-189；Vert G,Barberon M,Zelazny E,et al.Arabidopsis IRT2cooperates with the high-affinity iron uptake system to maintain iron homeostasis in root epidermal cells.Planta 2009,229(6):1171-1179.14,15)。AtIRT3能互補(bǔ)鋅、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)雙突變體，過(guò)表達(dá)AtIRT3會(huì)使鋅在地上部以及鐵在地下部積累(Lin YF,Liang HM,Yang SY,et al.Arabidopsis IRT3is a zinc-regulated and plasma membrane localized zinc/iron transporter.The New phytologist 2009,182(2):392-404.)。表達(dá)分析顯示，AtZIP1、AtZIP5、AtZIP9、AtZIP12和AtIRT3受缺鋅誘導(dǎo)，由此推測(cè)，這些基因在缺鋅條件下可能增強(qiáng)鋅的吸收能力(Kramer U,Talke IN,Hanikenne M.Transition metal transport.FEBS Lett 2007,581(12):2263-2272.)。

玉米(Zea mays)是中國(guó)重要的糧食、飼料和經(jīng)濟(jì)作物，增加玉米籽粒中鋅、鐵等微量元素的含量，對(duì)提高飲食或飼料利用效率、促進(jìn)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展及人體健康尤為重要。目前，已知許多轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與了植物體內(nèi)鋅鐵離子平衡網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，其中ZIP(Zinc-regulated transporters，Iron-regulated transporter-like proteins，ZIP)基因家族對(duì)鋅、鐵等二價(jià)金屬離子的吸收、運(yùn)輸和儲(chǔ)存起著重要作用，在擬南芥、水稻、大麥、大豆上，已報(bào)道了一些有關(guān)ZIP家族基因的研究，但對(duì)ZIP家族基因在植物體內(nèi)具體的作用機(jī)制尚未完全了解，而關(guān)于玉米的ZIP家族基因的研究報(bào)道較少。了解Zn²⁺、Fe²⁺在玉米中的吸收、運(yùn)輸方式，分布規(guī)律和調(diào)節(jié)機(jī)制，將有助于改善玉米在鋅、鐵缺乏的環(huán)境中的生長(zhǎng)發(fā)育，為進(jìn)一步揭示玉米中ZIP家族基因的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)，為玉米鋅、鐵高效轉(zhuǎn)基因育種提供候選基因，也為人類(lèi)鋅鐵營(yíng)養(yǎng)提供良好的基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供從玉米(Zea mays)中分離的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體基因；

本發(fā)明的目的之二是提供鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體基因所編碼的蛋白質(zhì)；

本發(fā)明的目的之三是將所述的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體基因應(yīng)用于調(diào)控植物對(duì)鋅鐵等金屬離子的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)或儲(chǔ)存，促進(jìn)胚根和胚芽發(fā)育以及胚成熟或者增加糧食作物籽粒中鋅鐵含量。

本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

從玉米(Zea mays)中分離的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIP1基因，其cDNA序列為(a)、(b)或(c)所示:

(a)、SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

(b)、編碼SEQ ID No.2所示氨基酸的核苷酸序列；

(c)、與SEQ ID No.1所示核苷酸的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的核苷酸，該核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)具有鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能。

從玉米(Zea mays)中分離的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIP2基因，其cDNA序列為(a)、(b)或(c)所示:

(a)、SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；

(b)、編碼SEQ ID No.4所示氨基酸的核苷酸序列；

(c)、與SEQ ID No.3所示核苷酸的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的核苷酸，該核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)具有鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能。

從玉米(Zea mays)中分離的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIP3基因，其cDNA序列為(a)、(b)或(c)所示:

(a)、SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；

(b)、編碼SEQ ID No.6所示氨基酸的核苷酸序列；

(c)、與SEQ ID No.5所示核苷酸的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的核苷酸，該核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)具有鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能。

從玉米(Zea mays)中分離的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIP7基因，其cDNA序列為(a)、(b)或(c)所示:

(a)、SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；

(b)、編碼SEQ ID No.8所示氨基酸的核苷酸序列；

(c)、與SEQ ID No.7所示核苷酸的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的核苷酸，該核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)具有鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能。

從玉米(Zea mays)中分離的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIP8基因，其cDNA序列為(a)、(b)或(c)所示:

(a)、SEQ ID No.9所示的核苷酸序列；

(b)、編碼SEQ ID No.10所示氨基酸的核苷酸序列；

(c)、與SEQ ID No.9所示核苷酸的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的核苷酸，該核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)具有鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能。

所述“嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件”意指在所屬領(lǐng)域中已知的低離子強(qiáng)度和高溫的條件。通常，在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，探針與其靶序列雜交的可檢測(cè)程度比與其它序列雜交的可檢測(cè)程度更高(例如超過(guò)本底至少2倍。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是序列依賴(lài)性的，在不同的環(huán)境條件下將會(huì)不同，較長(zhǎng)的序列在較高溫度下特異性雜交。通過(guò)控制雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性或洗滌條件可鑒定與探針100％互補(bǔ)的靶序列。對(duì)于核酸雜交的詳盡指導(dǎo)可參考有關(guān)文獻(xiàn)(Tijssen,Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays.1993)。更具體的，所述嚴(yán)謹(jǐn)條件通常被選擇為低于特異序列在規(guī)定離子強(qiáng)度pH下的熱熔點(diǎn)(Tm)約5-10℃。Tm為在平衡狀態(tài)下50％與目標(biāo)互補(bǔ)的探針雜交到目標(biāo)序列時(shí)所處的溫度(在指定離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)(因?yàn)槟繕?biāo)序列過(guò)量存在，所以在Tm下在平衡狀態(tài)下50％的探針被占據(jù))。嚴(yán)謹(jǐn)條件可為以下條件：其中在pH 7.0到8.3下鹽濃度低于約1.0M鈉離子濃度，通常為約0.01到1.0M鈉離子濃度(或其它鹽)，并且溫度對(duì)于短探針(包括(但不限于)10到50個(gè)核苷酸)而言為至少約30℃，而對(duì)于長(zhǎng)探針(包括(但不限于)大于50個(gè)核苷酸)而言為至少約60℃。嚴(yán)謹(jǐn)條件也可通過(guò)加入諸如甲酰胺的去穩(wěn)定劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。對(duì)于選擇性或特異性雜交而言，正信號(hào)可為至少兩倍的背景雜交，視情況為10倍背景雜交。例示性嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培養(yǎng)；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培養(yǎng)，在0.2×SSC中洗滌和在65℃下于0.1％SDS中洗滌。所述洗滌可進(jìn)行5、15、30、60、120min或更長(zhǎng)時(shí)間。

優(yōu)選的，本發(fā)明從玉米中所分離的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIP1、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7或ZmZIP8基因的cDNA序列分別為SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7或SEQ ID No.9所示的核苷酸序列。

本發(fā)明目的之二是提供由上述鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIPs基因(ZmZIP1、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7或ZmZIP8)所編碼的能夠吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)或儲(chǔ)存鋅鐵的蛋白質(zhì)；

本發(fā)明目的之二是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

ZmZIPs基因所編碼的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體，其氨基酸序列為(a)或(b)所示:

(a)、SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8或SEQ ID No.10所示的氨基酸序列；

(b)、將SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8或SEQ ID No.10所示的氨基酸序列通過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替換、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的蛋白變體。

所述的“多個(gè)”通常意味著2-8個(gè)，優(yōu)選為2-4個(gè)，這取決于鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體三維結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的位置或氨基酸的種類(lèi)；所述的“替換”是指分別用不同的氨基酸殘基取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；所述的“缺失”是指氨基酸殘基數(shù)量的減少，也即是分別缺少其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；所述的“插入”是指氨基酸殘基序列的改變，相對(duì)天然分子而言，所述改變導(dǎo)致添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。

本發(fā)明所述的蛋白變體可由遺傳多態(tài)性或人為操作產(chǎn)生，這些操作方法通常為本領(lǐng)域所了解。例如，可通過(guò)DNA的突變來(lái)制備鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體的氨基酸序列變體或片段，其中由于誘變或改變多核苷酸的方法為本領(lǐng)域所習(xí)知。其中，保守的取代是將一種氨基酸殘基替換成具有相似性質(zhì)的另一種氨基酸。因此，本發(fā)明所述的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體及其編碼基因包括天然存在的序列和變體兩種形式?！白凅w”意指基本相似的序列，對(duì)于多核苷酸，變體包含天然多核苷酸中一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失、插入或/和替換。對(duì)于多核苷酸，保守的變體包括由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而不改變編碼的氨基酸序列的那些變體。諸如此類(lèi)天然存在的變體可通過(guò)現(xiàn)有的分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)鑒定。變體多核苷酸還包括合成來(lái)源的多核苷酸，例如，采用定點(diǎn)誘變所得到的仍編碼SEQ ID No.2所示的氨基酸的多核苷酸變體，或者是通過(guò)重組的方法(例如DNA重排等)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過(guò)以下分子生物技術(shù)手段來(lái)篩選或評(píng)價(jià)變體多核苷酸所編碼蛋白的功能或活性：DNA結(jié)合活性，蛋白之間的相互作用，瞬時(shí)研究中基因表達(dá)的激活情況或轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的效應(yīng)等。

從亞細(xì)胞定位結(jié)果可知，本發(fā)明分離的5個(gè)ZmZIPs基因(ZmZIP1、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7或ZmZIP8基因)所編碼的蛋白定位在質(zhì)膜與細(xì)胞內(nèi)膜上。為進(jìn)一步確定細(xì)胞內(nèi)膜的具體定位，本發(fā)明選用ER marker與5個(gè)ZmZIPs基因共定位進(jìn)行擬南芥葉肉原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化，結(jié)果證明這5個(gè)ZmZIPs基因均定位在細(xì)胞質(zhì)膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。在亞細(xì)胞定位的基礎(chǔ)上，通過(guò)real-time RT-PCR表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，正常營(yíng)養(yǎng)條件下，5個(gè)ZmZIPs基因主要在地上部表達(dá)，其中，缺鋅條件下，ZmZIP8在96h地上部表達(dá)上調(diào)，ZmZIP3在6h時(shí)地上部和地下部表達(dá)量都有所升高；在高鋅條件ZmZIP7和ZmZIP8在地上部的表達(dá)量是逐漸降低的，ZmZIP3在地下部的表達(dá)量明顯的降低。這些結(jié)果表明，ZmZIP3、ZmZIP7和ZmZIP8在幼苗時(shí)期對(duì)鋅的濃度比較敏感。缺鐵條件下，ZmZIP7和ZmZIP8在地上與地下的表達(dá)量是逐漸增高的，說(shuō)明ZmZIP7和ZmZIP 8對(duì)鐵的濃度比較敏感。缺銅、缺錳條件下，5個(gè)ZmZIPs基因的表達(dá)量都沒(méi)有明顯的變化。

酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所分離的5個(gè)ZmZIPs不論在低鋅還是在低鐵條件下都表現(xiàn)出不同程度的轉(zhuǎn)運(yùn)鋅或鐵活性，說(shuō)明本發(fā)明所分離的5個(gè)ZmZIPs均具有轉(zhuǎn)運(yùn)鋅鐵的功能。

目前，已知許多轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與了植物體內(nèi)鋅鐵離子平衡網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，一些蛋白也被應(yīng)用到植物的轉(zhuǎn)基因研究中，比如在大麥中過(guò)表達(dá)AtZIP1基因能夠增加鋅和鐵在種子中的含量(Ramesh SA,Choimes S,Schachtman DP.Over-expression of an Arabidopsis zinc transporter in hordeum vulgare increases short-term zinc uptake after zinc deprivation and seed zinc content.Plant molecular biology 2004,54(3):373-385.)，同樣，過(guò)表達(dá)OsIRT1基因，水稻中鋅和鐵的含量在地上部、地下部和種子中都有所提高(Lee S,An G.Over-expression of OsIRT1leads to increased iron and zinc accumulations in rice.Plant,cell&environment 2009,32(4):408-416.)。然而，在水稻中過(guò)表達(dá)OsZIP4、OsZIP5、OsZIP8，OsZIP9結(jié)果導(dǎo)致過(guò)量的鋅聚集于根部，降低了植株地上部分的鋅含量(Lee S,Kim SA,Lee J,et al.Zinc deficiency-inducible OsZIP8encodes a plasma membrane-localized zinc transporter in rice.Molecules and cells 2010,29(6):551-558；Lee S,Jeong HJ,Kim SA,et al.OsZIP5is a plasma membrane zinc transporter in rice.Plant molecular biology2010,73(4-5):507-517；Ishimaru Y,Masuda H,Suzuki M,et al.Overexpression of the OsZIP4zinc transporter confers disarrangement of zinc distribution in rice plants.Journal of experimental botany2007,58(11):2909-2915.)沒(méi)有達(dá)到在籽粒中增加鋅含量的目的，因此，這些基因的過(guò)表達(dá)對(duì)水稻籽粒中鋅的富集是不利的。這些結(jié)果表明，異位過(guò)表達(dá)對(duì)于鋅鐵的積累與分布可能會(huì)起到一定的作用。然而，有關(guān)鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在籽粒中的研究還很少。

因此，本發(fā)明提供了一種調(diào)控植物吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)或儲(chǔ)存鋅鐵的能力的方法，包括：將本發(fā)明ZmZIPs基因可操作的與表達(dá)調(diào)控元件相連接得到重組植物表達(dá)載體；將重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物中，在植物體中過(guò)表達(dá)ZmZIPs基因，能夠有效調(diào)控或改善目標(biāo)植物對(duì)鋅鐵的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)或儲(chǔ)存的能力。

本發(fā)明提供了一種解除過(guò)量的鋅鐵對(duì)植物體毒害的方法，該方法包括：將本發(fā)明ZmZIPs基因可操作的與表達(dá)調(diào)控元件相連接得到重組植物表達(dá)載體；將重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物中，在植物體中過(guò)表達(dá)ZmZIPs基因。

本發(fā)明還提供了一種調(diào)控或促進(jìn)植物種子胚發(fā)育的方法，該方法包括：將本發(fā)明ZmZIPs基因可操作的與表達(dá)調(diào)控元件相連接得到重組植物表達(dá)載體；將重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物中，在植物體中過(guò)表達(dá)ZmZIPs基因；其中，所述的表達(dá)調(diào)控元件中啟動(dòng)子優(yōu)選為種子特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種調(diào)控或促進(jìn)種子胚成熟的方法，該方法包括：將本發(fā)明ZmZIPs基因可操作的與表達(dá)調(diào)控元件相連接得到重組植物表達(dá)載體；將重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物中，在植物體中過(guò)表達(dá)ZmZIPs基因；其中，所述的表達(dá)調(diào)控元件中的啟動(dòng)子優(yōu)選為種子特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有所述鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIPs基因的重組植物表達(dá)載體以及含有該重組植物表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。

將本發(fā)明所述鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIPs基因可操作的與表達(dá)調(diào)控元件相連接，得到可以在植物中表達(dá)該鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的重組植物表達(dá)載體?！翱刹僮鞯倪B接”指兩個(gè)或更多個(gè)元件之間功能性的連接，可操作的連接的元件可為鄰接或非鄰接的。例如，該重組植物表達(dá)載體可以由5′端非編碼區(qū)，SEQ ID No.1(或者是SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7或SEQ ID No.9中的任一序列)所示的核苷酸和3′非編碼區(qū)組成，其中，所述的5′端非編碼區(qū)可以包括啟動(dòng)子序列、增強(qiáng)子序列或/和翻譯增強(qiáng)序列；所述的啟動(dòng)子可以是組成性啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織或器官特異性啟動(dòng)子；所述的3′非編碼區(qū)可以包含終止子序列、mRNA切割序列等。合適的終止子序列可取自根癌農(nóng)桿菌的Ti-質(zhì)粒，例如章魚(yú)堿合成酶或胭脂堿合成酶終止區(qū)。例如，為了使本發(fā)明的鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體基因在糧食作物種子進(jìn)行特異性表達(dá)，可以將鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體基因連接在種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子的下方構(gòu)建得到重組植物表達(dá)載體，將該重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化受體植物后，鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體基因可以在受體植物的種子里進(jìn)行特異性表達(dá)，達(dá)到促進(jìn)胚根和胚芽發(fā)育、促進(jìn)胚成熟或增加種子鋅鐵含量或調(diào)控胚發(fā)育的效果。

另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將ZmZIPs的核苷酸序列進(jìn)行優(yōu)化以增強(qiáng)其在植物中的表達(dá)。例如?？刹捎媚繕?biāo)植物的偏愛(ài)密碼子進(jìn)行優(yōu)化來(lái)合成多核苷酸以增強(qiáng)該基因在目標(biāo)植物中的表達(dá)水平，這些方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所習(xí)知。

此外，該重組植物表達(dá)載體還可含有用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇性標(biāo)記基因。選擇性標(biāo)記基因用于選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織。所述的選擇性標(biāo)記基因包括：編碼抗生素抗性的基因以及賦予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的標(biāo)記基因還包括表型標(biāo)記，例如β-半乳糖苷酶和熒光蛋白等。

所述的“轉(zhuǎn)化”指將基因?qū)氲街参锛?xì)胞內(nèi)部這樣的方式將多核苷酸或多肽遺傳轉(zhuǎn)化到植物中。將所述多核苷酸或多肽引入到植物中的方法為本領(lǐng)域所習(xí)知，包括但不限于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化法、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法和病毒介導(dǎo)法等?！胺€(wěn)定轉(zhuǎn)化”指被引入的多核苷酸構(gòu)建體整合至植物細(xì)胞的基因組中并能通過(guò)其子代遺傳；“瞬時(shí)轉(zhuǎn)化”指多核苷酸被引入到植物中但只能在植物中暫時(shí)性表達(dá)或存在。

轉(zhuǎn)化方案以及將所述多核苷酸引入植物的方案可視用于轉(zhuǎn)化的植物(單子葉植物或雙子葉植物)或植物細(xì)胞的類(lèi)型而變化。將所述多核苷酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的合適方法包括：顯微注射、電穿孔、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、直接基因轉(zhuǎn)移以及高速?gòu)椀擂Z擊等。在特定的實(shí)施方案中，可利用多種瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法將本發(fā)明的ZmZIPs基因提供給植物。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的ZmZIPs基因可通過(guò)將植物與病毒或病毒核酸接觸來(lái)引入到植物中，通常，這樣的方法涉及將本發(fā)明的ZmZIPs基因構(gòu)建體引入病毒DNA或RNA分子中。

利用常規(guī)方法可使已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植株(McCormick et al.Plant Cell Reports.1986.5:81-84)。本發(fā)明可用于轉(zhuǎn)化任何植物種類(lèi)，包括但不限于：?jiǎn)巫尤~植物或雙子葉植物；優(yōu)選的，所述的目標(biāo)植物包括糧食作物、蔬菜或果樹(shù)等，更優(yōu)選為糧食作物，例如，可以是玉米、水稻、大麥小麥、高粱、大豆、馬鈴薯等糧食作物。

本發(fā)明所涉及到的術(shù)語(yǔ)定義

除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。雖然在本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中可使用與本文所述者類(lèi)似或等效的任何方法、裝置和材料，但現(xiàn)在描述優(yōu)選方法、裝置和材料。

術(shù)語(yǔ)“重組宿主細(xì)胞株”或“宿主細(xì)胞”意指包含本發(fā)明多核苷酸的細(xì)胞，而不管使用何種方法進(jìn)行插入以產(chǎn)生重組宿主細(xì)胞，例如直接攝取、轉(zhuǎn)導(dǎo)、f配對(duì)或所屬領(lǐng)域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持為例如質(zhì)粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組中。宿主細(xì)胞可為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，宿主細(xì)胞還可為單子葉或雙子葉植物細(xì)胞。

術(shù)語(yǔ)“核苷酸”意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術(shù)語(yǔ)涵蓋含有天然核苷酸的已知類(lèi)似物的核酸，所述類(lèi)似物具有類(lèi)似于參考核酸的結(jié)合特性并以類(lèi)似于天然產(chǎn)生的核苷酸的方式進(jìn)行代謝。除非另外特定限制，否則所述術(shù)語(yǔ)也意指寡核苷酸類(lèi)似物，其包括PNA(肽核酸)、在反義技術(shù)中所用的DNA類(lèi)似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體(包括(但不限于)簡(jiǎn)并密碼子取代)和互補(bǔ)序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過(guò)產(chǎn)生其中一個(gè)或一個(gè)以上所選(或所有)密碼子的第3位經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來(lái)實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)并密碼子取代。

術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中互換使用以意指氨基酸殘基的聚合物。即，針對(duì)多肽的描述同樣適用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述術(shù)語(yǔ)適用于天然產(chǎn)生氨基酸聚合物以及其中一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸殘基為非天然編碼氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述術(shù)語(yǔ)涵蓋任何長(zhǎng)度的氨基酸鏈，其包括全長(zhǎng)蛋白(即抗原)，其中氨基酸殘基經(jīng)由共價(jià)肽鍵連接。

附圖說(shuō)明

圖1酵母表達(dá)載體pFL61的示意圖。

圖2標(biāo)準(zhǔn)Hoagland培養(yǎng)基條件下ZmZIPs的表達(dá)模式；S(shoot)，R(root)。

圖3 ZmZIPs基因在各種處理?xiàng)l件下的表達(dá)模式。

圖4 ZmZIPs基因在玉米胚和胚乳發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式。

圖5 pRTL2NGFP-ZmZIPs重組載體酶切鑒定；M為1Kb的Marker；1-5分別為pRTL2NGFP-ZmZIP1、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7、ZmZIP8雙酶切的結(jié)果

圖6 ZmZIPs洋蔥表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位；GFP為pRTL2NGFP空載體定位情況；ZmZIP1、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7、ZmZIP8為pRTL2NGFP-ZmZIP1、2、3、7、8的亞細(xì)胞定位情況。

圖7 ZmZIPs擬南芥葉肉原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位；GFP為pRTL2NGFP空載體定位情況；GFP為pRTL2NGFP空載體定位情況；ZmZIP1、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7、ZmZIP8分別為pRTL2NGFP-ZmZIP1、2、3、7、8的亞細(xì)胞定位情況。

圖8 pFL61-ZmZIPs及pFL61-OsZIP5、pFL61-OsZIP8、pFL61-OsIRT1正向連接重組載體酶切鑒定；M為1Kb的Marker；1-8依次為pFL61-ZmZIP1、pFL61-ZmZIP2、pFL61-ZmZIP3、pFL61-ZmZIP7、pFL61-ZmZIP8、pFL61-OsZIP5、pFL61-OsZIP8、pFL61-OsIRT1雙酶切結(jié)果。

圖9 ZmZIPs酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖10 ZmZIP1、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7和ZmZIP8的植物表達(dá)載體示意圖。

圖11 ZmZIPs基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)提高擬南芥中鋅含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；ZmZIP2為轉(zhuǎn)ZmZIP2基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)提高擬南芥中鐵或鋅含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；ZmZIP3為轉(zhuǎn)ZmZIP3基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)提高擬南芥中鐵或鋅含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；ZmZIP7為轉(zhuǎn)ZmZIP7基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)提高擬南芥中鐵或鋅含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；ZmZIP8為轉(zhuǎn)ZmZIP8基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)提高擬南芥中鐵或鋅含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；WT為野生型哥倫比亞種子中鐵和鋅含量測(cè)定的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

實(shí)驗(yàn)材料

1.1植物材料

玉米自交系X178由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/國(guó)家玉米改良中心河北分中心實(shí)驗(yàn)室提供，水稻自交系日本晴由北京師范大學(xué)生命科學(xué)院惠贈(zèng)。

1.2菌株與載體

大腸桿菌(E.coli)菌株Mach1-T1和農(nóng)桿菌(A.tumefacterium)菌株EHA105、GV3101均由本實(shí)驗(yàn)室保存。pGEM-Teasy載體購(gòu)自Promega公司。酵母表達(dá)載體pFL61(示意圖見(jiàn)圖1)、酵母菌株zrt1zrt2ZHY3(MATαade6can1his3leu2trp1ura3zrt1::LEU2zrt2::HIS3),fet3fet4 DEY1453(MATa/MATa ade2/+can1/can1his3/his3leu2/leu2trp1/trp1ura3/ura3 fet3-2::HIS3/fet3-2::HIS3fet4-1::LEU2/fet4-1::LEU2),DY1455(MATa ade6 can1 his3 leu2 trp1 ura3)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)張紅生教授友情惠贈(zèng)。

實(shí)施例1玉米鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIPs基因的克隆

1、植物材料的處理

先把蛭石用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液浸透，將玉米自交系X178種子點(diǎn)播于育苗盤(pán)中，上面覆蓋上一層干蛭石，在溫室(16h光照/8h黑暗，26℃)中培養(yǎng)，12天幼苗長(zhǎng)至2葉一心時(shí)移入標(biāo)準(zhǔn)Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中生長(zhǎng)6天至3葉一心(每3天換一次營(yíng)養(yǎng)液)，3葉一心的玉米幼苗在標(biāo)準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)液和不加鋅、鐵、銅、錳、高鋅、鐵的條件下處理0、6、12、24、48、96h后，分別收取幼苗地上部和根，液氮速凍后于-80℃保存用于總RNA提取。

2、玉米總RNA的提取

采用Trizol法提取玉米總RNA。

3、cDNA的合成

(1)去除DNA，按下述配制反應(yīng)體系：總RNA(1μg/μL)1.0μL，DNAse I(10U/μL)

1.0μL，10×DNAse I buffer 1.0μL，DEPC H₂O 7.0μL，總計(jì)10.0μL；37℃30min，加入1μL 25mM EDTA，65℃5min終止反應(yīng)。

(2)、加入1μL oligo(dT18)，65℃5min；

(3)、以上共12μL，再加入以下組分得到反轉(zhuǎn)錄體系：5×反應(yīng)緩沖液4.0μL，Ri RT(20U/μL)

1.0μL，Re RT(200U/μL)1.0μL，10mM dNTP mix 2.0μL，總計(jì)：20.0μL；42℃60min，70℃5min，終止反應(yīng)。

4、目的基因的克隆

(1)、根據(jù)目的基因的ORF框設(shè)計(jì)引物：

ZmZIP1F 5'-GCGGCCGCATGCGCCGCCAAAGCCT-3'NotI

ZmZIP1R 5'-GCGGCCGCTTATTCTACCAGAGAAATGCCTAGAGCG-3'NotI

ZmZIP2F 5'-TACGTAATGGCCCGCGCCAC-3'SnaBI

ZmZIP2R 5'-TACGTATCAGGTGTCCCATATCATGACG-3'SnaBI

ZmZIP3F 5'-CCCGGGATGGGAGCTGTGAAGCATACATTG-3'SmaI

ZmZIP3R 5'-GGTACCCTATGCCCATATAGCAAGCATGGAC-3'KpnI

ZmZIP7F 5'-TCTAGAATGGTTCTCGCCGGCCTC-3'XbaI

ZmZIP7R 5'-GAGCTCTCAAGCCCATATTGCAAGTGATGACATAG-3'SacI

ZmZIP8F 5'-CCCGGGATGGCCATGAGGCCACG-3'SmaI

ZmZIP8R 5'-GAGCTCCTAGGCCCACTTGGCCAGC-3'SacI

以上述步驟3的cDNA為模板，選用ExTaq酶，2×GCI buffer進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性4min；94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，33個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；

(2)、將克隆得到的片段克隆到pGEM-T載體中，轉(zhuǎn)化Mach1-T1菌株；

(3)、經(jīng)酶切鑒定獲得陽(yáng)性的重組質(zhì)粒，測(cè)序得到正確克隆，所克隆的第1個(gè)基因命名為ZmZIP1，該基因的cDNA序列為SEQ ID No.1所示，所推導(dǎo)的氨基酸序列為SEQ ID No.2所示；所克隆的第2個(gè)基因命名為ZmZIP2，該基因的cDNA序列為SEQ ID No.3所示，所推導(dǎo)的氨基酸序列為SEQ ID No.4所示；所克隆的第3個(gè)基因命名為ZmZIP3，該基因的cDNA序列為SEQ ID No.5所示，所推導(dǎo)的氨基酸序列為SEQ ID No.6所示；所克隆的第4個(gè)基因命名為ZmZIP7，該基因的cDNA序列為SEQ ID No.7所示，所推導(dǎo)的氨基酸序列為SEQ ID No.8所示；所克隆的第5個(gè)基因命名為ZmZIP8，該基因的cDNA序列為SEQ ID No.9所示，所推導(dǎo)的氨基酸序列為SEQ ID No.10所示。

實(shí)施例2 ZmZIPs在幼苗、胚和胚乳中的表達(dá)模式

將實(shí)施例1步驟3中反轉(zhuǎn)錄的cDNA稀釋10倍作為PCR反應(yīng)的模板，PCR反應(yīng)體系如下：

cDNA 2.0μL，ExTaq 0.1μL，2×GCI緩沖液10.0μL，10mM dNTP mix 0.8μL，上游引物RTZmZIP1F/RTZmZIP2F/RTZmZIP3F/RTZmZIP7F/RTZmZIP8F(10μM/μL)1.0μL，下游引物RTZmZIP1R/RTZmZIP2R/RTZmZIP3R/RTZmZIP7R/RTZmZIP8R(10μM/μL)1.0μL，ddH₂O 5.1μL，總計(jì)20.0μL；

RTZmZIP1F 5'-CCTCTCTGCGTTGGTTGCTCT-3'

RTZmZIP1R 5'-TTGATGGTTGTTTTCTGGTCGT-3'

RTZmZIP2F 5'-CCACAAATGGCACGAGGTCT-3'

RTZmZIP2R 5'-CGAAGACGGAGTGGAAGCAAA-3'

RTZmZIP3F 5'-GCCTCTTGTTGGTGCCCTTA-3'

RTZmZIP3R 5'-TCAACAATGAACGCTGTAGTGCT-3'

RTZmZIP7F 5'-ACTAGGTGGGTGCATTGCTCAG-3'

RTZmZIP7R 5'-TGCCAGCAGATACCGAGTCAA-3'

RTZmZIP8F 5'-CGTGTCATCGCTCAGGTTCTTG-3'

RTZmZIP8R 5'-CCCTCGAACATTTGGTGGAAG-3'

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min；30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94℃變性45秒，60℃退火1min，72℃延伸1min；最后再延伸72℃10min，降溫至16℃，取出PCR產(chǎn)物放入4℃保存。

目的基因表達(dá)量的檢測(cè)：實(shí)施例1步驟3中反轉(zhuǎn)錄的cDNA稀釋20倍作為Real-time PCR反應(yīng)的模板，Actin為內(nèi)參照，反應(yīng)體系如下：cDNA 5.0μL，SYBR Green I 10.0μL，Rox 0.4μL，上游引物ZmActin1F(10μM/μL)0.4μL，下游引物ZmActin1R(10μM/μL)0.4μL，ddH₂O3.8μL，總計(jì)10.0μL；

ZmActin1F 5'-ATGTTTCCTGGGATTGCCGAT-3'

ZmActin1R 5'-CCAGTTTCGTCATACTCTCCCTTG-3'

所用程序：95℃2min，95℃15sec，60℃34sec，40個(gè)循環(huán)，通過(guò)ΔΔCt法計(jì)算表達(dá)量。

通過(guò)real-time RT-PCR表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，正常營(yíng)養(yǎng)條件下，5個(gè)ZmZIPs基因主要在地上部表達(dá)，其中，缺鋅條件下，ZmZIP8在96h地上部表達(dá)上調(diào)，ZmZIP3在6h時(shí)地上部和地下部表達(dá)量都有所升高；在高鋅條件ZmZIP7和ZmZIP8在地上部的表達(dá)量是逐漸降低的，ZmZIP3在地下部的表達(dá)量明顯的降低。這些結(jié)果表明，ZmZIP3、ZmZIP7和ZmZIP8在幼苗時(shí)期對(duì)鋅的濃度比較敏感。缺鐵條件下，ZmZIP7和ZmZIP8在地上與地下的表達(dá)量是逐漸增高的，說(shuō)明ZmZIP7和ZmZIP8對(duì)鐵的濃度比較敏感。缺銅、缺錳條件下，5個(gè)ZmZIPs基因的表達(dá)量都沒(méi)有明顯的變化。5個(gè)ZmZIPs基因可能參與胚和胚乳的發(fā)育(圖2、圖3和圖4)。

實(shí)施例3 ZmZIPs的生物信息學(xué)分析

ZmZIPs由367-483個(gè)氨基酸組成，含有6-9個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，在第3與第4跨膜區(qū)之間有一富含組氨酸的可變區(qū)，可能和金屬離子的結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。進(jìn)化樹(shù)分析顯示，ZmZIP1與AtIAR1、OsIAR1進(jìn)化關(guān)系較近。另外，ZmZIP3和ZmZIP4與OsZIP3和OsZIP4形成一個(gè)基因簇，ZmZIP2與OsZIP2鄰近，和鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體OsZIP1，AtZIP2和AtZIP11在一個(gè)分支上，ZmZIP5與ZmZIP7在一個(gè)分支上，ZmZIP8與OsZIP8，ZmZIP6與OsZIP6進(jìn)化關(guān)系較近，這些結(jié)果顯示，本發(fā)明所分離的5個(gè)ZmZIPs可能是鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體。

實(shí)施例4ZmZIPs的亞細(xì)胞定位

1、融合表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)ZmZIPs基因的序列設(shè)計(jì)引物，引物序列如下：

ZmZIP1GF 5'-GAATTCATGCGCCGCCAAAGCCT-3'EcoRI

ZmZIP1GR 5'-TCTAGATTCTACCAGAGAAATGCCTAGAGCG-3'XbaI

ZmZIP2GF 5'-GAATTCATGGCCCGCGCCACCAA-3'EcoRI

ZmZIP2GR 5'-TCTAGAGGTGTCCCATATCATGACGACGG-3'XbaI

ZmZIP3GF5'-GAATTCATGGGAGCTGTGAAGCATAC-3'EcoRI

ZmZIP3GR5'-TCTAGATGCCCATATAGCAAGCATGGACAT-3'XbaI

ZmZIP7GF 5'-GAATTCATGGTTCTCGCCGGCCTC-3'EcoRI

ZmZIP7GR 5'-TCTAGAAGCCCATATTGCAAGTGATGACATAG-3'XbaI

ZmZIP8GF 5'-GAATTCATGGCCATGAGGCCACGC-3'EcoRI

ZmZIP8GR 5'-TCTAGAGGCCCACTTGGCCAGCAT-3'XbaI

加入合適的酶切位點(diǎn)，并且基因3’端去除終止密碼子，以克隆基因時(shí)連接到pGEM-T載體上測(cè)序正確的質(zhì)粒為模板，選用ExTaq酶與2×GCI buffer進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性4min；94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，33個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。擴(kuò)增片段經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳回收后克隆到pGEM-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株Mach1-T1，經(jīng)LB培養(yǎng)基(IPTG、X-gal、Amp)得到陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒、酶切和測(cè)序驗(yàn)證；以克隆基因時(shí)連接到pGEM-T載體上測(cè)序正確的質(zhì)粒為模板，選用ExTaq酶與2×GCI buffer進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳回收后克隆到pGEM-T載體中，測(cè)序正確的質(zhì)粒酶切后，將目的片段構(gòu)建到pRTL2NGFP載體上，分別命名為pRTL2NGFP-ZmZIP1、pRTL2NGFP-ZmZIP2、pRTL2NGFP-ZmZIP3、pRTL2NGFP-ZmZIP7、pRTL2NGFP-ZmZIP8，圖5為酶切鑒定圖。

2、用相應(yīng)的酶切pRTL2NGFP載體與不同的酶切后的基因片段，經(jīng)T₄DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化Mach1-T1菌株，提質(zhì)粒酶切鑒定篩選出正確重組體大提質(zhì)粒用于基因槍轉(zhuǎn)化洋蔥表皮。

3、基因槍微彈的制備

4、用基因槍進(jìn)行洋蔥表皮轉(zhuǎn)化

從定位結(jié)果可知5個(gè)ZmZIPs(ZmZIP1、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7或ZmZIP8)均定位在質(zhì)膜與細(xì)胞內(nèi)膜上(圖6)。為進(jìn)一步確定細(xì)胞內(nèi)膜的具體定位，選用ER marker與ZmZIPs共定位進(jìn)行擬南芥葉肉原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化，結(jié)果證明5個(gè)ZmZIPs均定位在細(xì)胞質(zhì)膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上(圖7)。

實(shí)施例五酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)

1、酵母表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)目的基因序列加入合適的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物：

ZmZIP1YF 5'-GCGGCCGCATGCGCCGCCAAAGCCT-3'NotI

ZmZIP1YR 5'-GCGGCCGCTTATTCTACCAGAGAAATGCCTAGAGCG-3'NotI

ZmZIP2YF 5'-TACGTAATGGCCCGCGCCAC-3'SnaBI

ZmZIP2YR 5'-TACGTATCAGGTGTCCCATATCATGACG-3'SnaBI

ZmZIP3YF5'-CCCGGGATGGGAGCTGTGAAGCATACATTG-3'SmaI

ZmZIP3YR5'-GGTACCCTATGCCCATATAGCAAGCATGGAC-3'KpnI

ZmZIP7YF 5'-TACGTAATGGTTCTCGCCGGCCTC-3'SnaBI

ZmZIP7YR 5'-TACGTATCAAGCCCATATTGCAAGTGATGACATAG-3'SnaBI

ZmZIP8YF 5'-TGCCATGGCCATGAGGCCAC-3'

ZmZIP8YR 5'-CTAGGCCCACTTGGCCAGCATG-3'

OsZIP5YF5'-CCCGGGGAGCCATCGGCGATGGCGA-3'SmaI

OsZIP5YR5'-GAGCTCGTGATGGTCACTCACTCATCACGCC-3'SacI

OsZIP8YF 5'-GCGGCCGCATGAGGACGAACACCACC-3'NotI

OsZIP8YR 5'-GCGGCCGCCCTCTACATTAGTCCCTGAG-3'NotI

OsIRT1YF 5'-GCGGCCGCCCCGGGATGGCGACGCCGCGGA-3'NotI,SmaI

OsIRT1YR 5'-GCGGCCGCCCCGGGTCACGCCCACTTGGCCATG-3'NotI,SmaI

以克隆基因時(shí)連接到pGEM-T載體上測(cè)序正確的質(zhì)粒為模板，選用ExTaq與2×GCI buffer進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性4min；94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，33個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。擴(kuò)增片段經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳回收后克隆到pGEM-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株Mach1-T1，經(jīng)LB培養(yǎng)基(IPTG、X-gal、Amp)得到陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒、酶切和測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序正確的質(zhì)粒酶切后，將目的片段構(gòu)建到pFL61載體上，命名為pFL61-ZmZIP1、pFL61-ZmZIP2、pFL61-ZmZIP3、pFL61-ZmZIP7、pFL61-ZmZIP8及pFL61-OsZIP5、pFL61-OsZIP8和pFL61-OsIRT1，圖8為酶切鑒定圖。

用NotI酶切pFL61載體與酶切后的ZmZIPs片段經(jīng)T₄DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化Mach1-T1菌株，提質(zhì)粒酶切鑒定篩選出正確重組體大提質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化釀酒酵母。

2、電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化酵母

(1)、從YPD平板上挑取zrt1zrt2ZHY3、fet3fet4DEY1453和DY1455的單菌落于20mL的YPD液體培養(yǎng)基中，28℃搖床培養(yǎng)約24h；

(2)、吸取以上2％體積的菌液轉(zhuǎn)接到100mL的YPD培養(yǎng)基中繼續(xù)擴(kuò)繁約4-5h,待菌液OD₆₀₀為1.2-1.5時(shí)即可制備感受態(tài)；

(3)、將菌液收集到50mL的離心管中，4℃，5,000rpm，離心5min，倒掉上清；

(4)、加入等體積的去離子水，冰上重懸菌體，4℃，5,000rpm，5min離心，倒掉上清；

(5)、加入1/2體積的去離子水,冰上重懸菌體，4℃，5,000rpm，5min離心，倒掉上清；

(6)、加入10mL的1M山梨醇溶液，冰上重懸菌體，4℃，5,000rpm，5min離心，倒掉上清；

(7)、加入450-600μL的山梨醇溶液，用去頭的槍頭輕吸，重懸菌體；

(8)、按照每個(gè)1.5mL的離心管里加入約100μL的感受態(tài)為準(zhǔn)，分裝；

(9)、在每管感受態(tài)中加入適量的DNA(10μL左右，c≥200ng/μL)，冰上放置1-2min,之后吸到預(yù)冷的電擊杯中，不要有氣泡；

(10)、電擊轉(zhuǎn)化，立即加入約800μL，1M的預(yù)冷的山梨醇溶液，重懸菌體；

(11)、從電擊杯中吸出菌體，涂布SD/Ura-平板；

(12)、SD平板上28℃培養(yǎng)約6天可長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的菌斑。

3、酵母陽(yáng)性克隆的鑒定

(1)、取1.5mL酵母培養(yǎng)物，9,000rpm離心30秒，盡可能的吸棄上清，收集酵母細(xì)胞；

(2)、加入600μL Sorbitol buffer，輕柔吹打充分重懸細(xì)胞，加入80U的Lyticase，充分顛倒混勻，37℃溫育30min消化細(xì)胞壁，中間顛倒數(shù)次；

(3)、13,000rpm離心1min，盡可能吸棄上清，加入250μL溶液YP1重懸菌體沉淀，渦旋震蕩至徹底懸??；

(4)、加入250μL YP2溶液，輕柔地翻轉(zhuǎn)，使菌體充分裂解，室溫放置4min；

(5)、加入350μL YP3溶液，輕柔地翻轉(zhuǎn)，充分混勻時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀，冰上靜置3-5min，13,000rpm離心5min，小心吸取上清液。

(6)、將上一步所得上清液加入吸附柱AC中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液；

(7)、加入500μL去蛋白液PD，12,000rpm離心30-60秒，棄廢液；

(8)、加入500μL漂洗液WB(已加無(wú)水乙醇)，12,000rpm離心30-60秒，棄廢液；

(9)、加入500μL漂洗液WB，12,000rpm離心30-60秒，棄廢液；

(10)、將吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm離心2min，除去漂洗液；

(11)、取出吸附柱AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加50μL洗脫緩沖液EB(65-70℃水浴)，室溫放置2min，13,000rpm離心1min。

(12)、以抽提的1μL DNA為模板，基因的兩端引物為PCR擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證目的基因，驗(yàn)證正確的菌液，加入25％的甘油于-80℃保存。

4、酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將pFL61、pFL61-ZmZIP1、pFL61-ZmZIP2、pFL61-ZmZIP3、pFL61-ZmZIP7、pFL61-ZmZIP8、pFL61-OsZIP5、pFL61-OsZIP8、pFL61-OsIRT1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到酵母突變株zrt1zrt2ZHY3和fet3fet4DEY1453中，pFL61為陰性對(duì)照，OsZIP5、OsZIP8(Lee S,Kim SA,Lee J,et al.Zinc deficiency-inducible OsZIP8encodes a plasma membrane-localized zinc transporter in rice.Molecules and cells 2010,29(6):551-558；Lee S,Jeong HJ,Kim SA,et al.OsZIP5is a plasma membrane zinc transporter in rice.Plant molecular biology 2010,73(4-5):507-517；Ishimaru Y,Masuda H,Suzuki M,et al.Overexpression of the OsZIP4zinc transporter confers disarrangement of zinc distribution in rice plants.Journal of experimental botany 2007,58(11):2909-2915.)為鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體的陽(yáng)性對(duì)照，OsIRT1(Lee S,An G.Over-expression of OsIRT1leads to increased iron and zinc accumulations in rice.Plant,cell&environment 2009,32(4):408-416.)為鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體的陽(yáng)性對(duì)照，pFL61轉(zhuǎn)化野生型菌株DY1455作為另一陽(yáng)性對(duì)照，轉(zhuǎn)化后鑒定為陽(yáng)性的酵母菌在SD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，酵母菌液分別稀釋4個(gè)濃度(OD₆₀₀＝1、0.1、0.01、0.001)，然后取5μL點(diǎn)在低鋅、低鐵和正常SD的培養(yǎng)基中，低鋅培養(yǎng)基(SD培養(yǎng)基加入0.4mM EDTA、0.4mM EDTA和250μM ZnSO₄、0.4mM EDTA和300μM ZnSO₄)，低鐵培養(yǎng)基(SD培養(yǎng)基加入50mM MES、50mM MES和50μM FeCl₃、50mM MES和100μM FeCl₃)酵母互補(bǔ)參照Lin,Y.F的試驗(yàn)(Lin YF,Liang HM,Yang SY,et al.Arabidopsis IRT3is a zinc-regulated and plasma membrane localized zinc/iron transporter.The New phytologist 2009,182(2):392-404.)方法進(jìn)行，28℃培養(yǎng)，6天觀察試驗(yàn)結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在低鋅條件下，加有250μM ZnSO₄的培養(yǎng)基中能明顯觀察到DY-pFL61(野生型)、Z-ZmZIP1、Z-ZmZIP2、Z-ZmZIP3、Z-ZmZIP7、Z-ZmZIP8、Z-OsZIP5、Z-OsZIP8、Z-OsIRT1比空載體Z-pFL61長(zhǎng)勢(shì)好，并且，Z-ZmZIP1、Z-ZmZIP2、Z-ZmZIP3、Z-ZmZIP7、Z-ZmZIP8與已經(jīng)報(bào)道的水稻OsZIP長(zhǎng)勢(shì)相當(dāng)。在低鐵條件下，D-ZmZIP1、D-ZmZIP2、D-ZmZIP3、D-ZmZIP7、D-ZmZIP8比空載體D-pFL61長(zhǎng)勢(shì)好，但是沒(méi)有已經(jīng)報(bào)道的D-OsIRT1的轉(zhuǎn)運(yùn)活性強(qiáng)(圖9)；ZmZIP1、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7或ZmZIP8不論在低鋅還是在低鐵條件下都表現(xiàn)出不同程度的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，說(shuō)明ZmZIP1、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7或ZmZIP8具有轉(zhuǎn)運(yùn)鋅鐵的功能。

實(shí)驗(yàn)例1 ZmZIPs基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)提高擬南芥種子中鐵和鋅含量的實(shí)驗(yàn)

將ZmZIP1、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7以及ZmZIP8基因分別與組成型35S啟動(dòng)子控制的植物表達(dá)載體pBI121相連接構(gòu)建得到ZmZIP1、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7和ZmZIP8基因重組植物表達(dá)載體(圖10)；將構(gòu)建的重組植物表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化到擬南芥中，鑒定獲得陽(yáng)性的轉(zhuǎn)ZmZIP1、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7和ZmZIP8基因擬南芥；將陽(yáng)性的轉(zhuǎn)ZmZIPs基因擬南芥與野生型哥倫比亞在相同的載培條件下培養(yǎng)，收獲轉(zhuǎn)ZmZIPs基因擬南芥種子和野生型種子，分別測(cè)定轉(zhuǎn)ZmZIPs基因擬南芥種子和野生型擬南芥種子中鐵或鋅的含量；稱(chēng)取一定量的種子材料經(jīng)微波消解，定容，用ICP-MS方法進(jìn)行鋅鐵含量的測(cè)定；每批測(cè)定200mg種子，測(cè)定三批，取三批數(shù)據(jù)的平均值。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖11。從圖11的結(jié)果可見(jiàn)，在擬南芥中過(guò)表達(dá)ZmZIP1、ZmZIP2、ZmZIP3、ZmZIP7或ZmZIP8基因均能夠不同程度的提高種子中鐵或鋅含量。

<110> 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 玉米鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmZIP2基因及其應(yīng)用

<130> XLB--0030

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1473

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 1

atgcgccgcc aaagcctcgc caccgtactg ctgctcctgg tggccgccgc ggccctggcc 60

gcccccgccg ctgggcactc tgagtcctcc tgccccttct acgaccacgg cggccacggc 120

gaaccacacg aacgccacga ccatggccac agctgcggcg gcggcgcgga ccatgagcac 180

caccatcacc atcaccacgg ccatggacac ggcgagatcc agcggctgct cccggaggag 240

atggcggagg aggcggatct cgagctcgag tccttcggtt acgaagacca tgaccatgac 300

cacggccacc accaccacca ccaccatcac cacagccacg gcgacatgga gacatcgccc 360

atgggcgtgt ggctgagcgc gatggggtgc tcgctgctgg tcagtatggc gtcccttgtc 420

tgcctcgtcc tcttgccggt catcttcttt aaggggaaac cgtctaaggc catagtggat 480

tcgcttgcag tgtttggggc aggagctatg cttggagatt catttcttca tcagctgcca 540

catgcttttg gtggaggaca ttctcactcg catgatcatg agggtcatga tcatgctcat 600

gctcatgagc atgcacatgc acactcactg caagatctat ctgtgggttt gtctgtacta 660

tttggcattg tactgttttt tattgtcgag aagattgtga ggtatgttga agacaattct 720

caaaatgggg ctcatagcat gggtcatggg caccatcatc ataatcataa acggcacgat 780

tctagcgata aagccaaatt gaattaccaa aagagtgata ctgatggtaa agacattgat 840

catgctgaag aggaaccttc ggttaatgat accactggaa aaataagtga tggccatgaa 900

tcagaagcta ctatacgcaa gaggagctca tccaaagcca ctgatggaga agccaccaat 960

tctggaaggg atcctgcccc tgaaaaagca ccatcaaatg aaggttcatc aatttcaaac 1020

tctaacttag tgtttggcta cctcaacctt ttctcagatg gtgttcataa cttcactgat 1080

gggatggctc ttgggagtgc ctttctgctg catggtcctg ttggtggctg gtctaggact 1140

ttatttctgc ttgcacatga acttccccaa gaggtaggag attttggtat ccttgtgcgg 1200

tcaggcttca cggtatctaa ggccttattc ttcaatttcc tctctgcgtt ggttgctctt 1260

gctggaacag cactagcatt gtctttgggt aaagatccgg gacattcctc cctgattgag 1320

ggtttcaccg ccggtggttt catttacatt gctgtcgcgg gagtcctacc acagatgaac 1380

gaccagaaaa caaccatcaa gagctcagta gctcagctga tctccctggc aatggggatg 1440

ctggtcgctc taggcatttc tctggtagaa taa 1473

<210> 2

<211> 490

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 2

Met Arg Arg Gln Ser Leu Ala Thr Val Leu Leu Leu Leu Val Ala Ala

1 5 10 15

Ala Ala Leu Ala Ala Pro Ala Ala Gly His Ser Glu Ser Ser Cys Pro

20 25 30

Phe Tyr Asp His Gly Gly His Gly Glu Pro His Glu Arg His Asp His

35 40 45

Gly His Ser Cys Gly Gly Gly Ala Asp His Glu His His His His His

50 55 60

His His Gly His Gly His Gly Glu Ile Gln Arg Leu Leu Pro Glu Glu

65 70 75 80

Met Ala Glu Glu Ala Asp Leu Glu Leu Glu Ser Phe Gly Tyr Glu Asp

85 90 95

His Asp His Asp His Gly His His His His His His His His His Ser

100 105 110

His Gly Asp Met Glu Thr Ser Pro Met Gly Val Trp Leu Ser Ala Met

115 120 125

Gly Cys Ser Leu Leu Val Ser Met Ala Ser Leu Val Cys Leu Val Leu

130 135 140

Leu Pro Val Ile Phe Phe Lys Gly Lys Pro Ser Lys Ala Ile Val Asp

145 150 155 160

Ser Leu Ala Val Phe Gly Ala Gly Ala Met Leu Gly Asp Ser Phe Leu

165 170 175

His Gln Leu Pro His Ala Phe Gly Gly Gly His Ser His Ser His Asp

180 185 190

His Glu Gly His Asp His Ala His Ala His Glu His Ala His Ala His

195 200 205

Ser Leu Gln Asp Leu Ser Val Gly Leu Ser Val Leu Phe Gly Ile Val

210 215 220

Leu Phe Phe Ile Val Glu Lys Ile Val Arg Tyr Val Glu Asp Asn Ser

225 230 235 240

Gln Asn Gly Ala His Ser Met Gly His Gly His His His His Asn His

245 250 255

Lys Arg His Asp Ser Ser Asp Lys Ala Lys Leu Asn Tyr Gln Lys Ser

260 265 270

Asp Thr Asp Gly Lys Asp Ile Asp His Ala Glu Glu Glu Pro Ser Val

275 280 285

Asn Asp Thr Thr Gly Lys Ile Ser Asp Gly His Glu Ser Glu Ala Thr

290 295 300

Ile Arg Lys Arg Ser Ser Ser Lys Ala Thr Asp Gly Glu Ala Thr Asn

305 310 315 320

Ser Gly Arg Asp Pro Ala Pro Glu Lys Ala Pro Ser Asn Glu Gly Ser

325 330 335

Ser Ile Ser Asn Ser Asn Leu Val Phe Gly Tyr Leu Asn Leu Phe Ser

340 345 350

Asp Gly Val His Asn Phe Thr Asp Gly Met Ala Leu Gly Ser Ala Phe

355 360 365

Leu Leu His Gly Pro Val Gly Gly Trp Ser Arg Thr Leu Phe Leu Leu

370 375 380

Ala His Glu Leu Pro Gln Glu Val Gly Asp Phe Gly Ile Leu Val Arg

385 390 395 400

Ser Gly Phe Thr Val Ser Lys Ala Leu Phe Phe Asn Phe Leu Ser Ala

405 410 415

Leu Val Ala Leu Ala Gly Thr Ala Leu Ala Leu Ser Leu Gly Lys Asp

420 425 430

Pro Gly His Ser Ser Leu Ile Glu Gly Phe Thr Ala Gly Gly Phe Ile

435 440 445

Tyr Ile Ala Val Ala Gly Val Leu Pro Gln Met Asn Asp Gln Lys Thr

450 455 460

Thr Ile Lys Ser Ser Val Ala Gln Leu Ile Ser Leu Ala Met Gly Met

465 470 475 480

Leu Val Ala Leu Gly Ile Ser Leu Val Glu

485 490

<210> 3

<211> 1080

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 3

atggcccgcg ccaccaacgc ccaccaccac cgcctccgcc tcctcctctg cctctccctc 60

gcggccgccg cgtgggcgca cggcggaggc ggggactccg acgccgacgc cgacgcggat 120

gggggcgccg ccgccaggcc ggacctgcgc gcgcgcagcc tggtggaggc caagctgtgg 180

tgcctggcgg tggtgttcgt cggcacgctg ctgggcgggg tgtcccccta cttcatgcgc 240

tggaacgagg cgttcctcgc gctgggcacg cagttcgcgg gcggcgtctt cctcggcacg 300

gcgctcatgc acttcctcag cgacgccaac gagacgttcg gggacctgct ccccgacagc 360

gggtacccct gggcgttcat gctcgcctgc gccggttacg tcgtcaccat gctcgccgac 420

gtcgccatct cctacgtcgt ctcacggtca caggggcgca gcaccggcac cgccgctacc 480

ggcggttctg atgcagggct ggaggagggc aagatgagaa ccacaaatgg cacgaggtct 540

gagcccacac cagctgatgc acacggatct gatcactcgg ccgcatccat tctgcgcaac 600

gcgagcacga tcggtgacag cgtgctgctc atagtagccc tttgcttcca ctccgtcttc 660

gagggcatcg ccatcgggat cgccgagacc aaggccgacg catggaaggc gctgtggacc 720

ataagcctgc acaagatctt cgcggccatc gccatgggca tcgcgctgct ccggatgctg 780

cccaaccggc ccctcctctc ctgcttcgcc tacgccttcg cgttcgccat ctccagcccc 840

gtcggcgtcg gcatcggcat catcatcgat gccaccacgc agggccgggt ggccgactgg 900

atcttcgccg tctccatggg cctcgccacg ggcatcttcg tctacgtctc catcaaccac 960

ctcctctcca aagggtaccg gccccagagg cccgtcgccg tcgacacgcc ggtcgggagg 1020

tggctcgccg tcgtgttcgg cgtggctgtc atcgccgtcg tcatgatatg ggacacctga 1080

<210> 4

<211> 359

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 4

Met Ala Arg Ala Thr Asn Ala His His His Arg Leu Arg Leu Leu Leu

1 5 10 15

Cys Leu Ser Leu Ala Ala Ala Ala Trp Ala His Gly Gly Gly Gly Asp

20 25 30

Ser Asp Ala Asp Ala Asp Ala Asp Gly Gly Ala Ala Ala Arg Pro Asp

35 40 45

Leu Arg Ala Arg Ser Leu Val Glu Ala Lys Leu Trp Cys Leu Ala Val

50 55 60

Val Phe Val Gly Thr Leu Leu Gly Gly Val Ser Pro Tyr Phe Met Arg

65 70 75 80

Trp Asn Glu Ala Phe Leu Ala Leu Gly Thr Gln Phe Ala Gly Gly Val

85 90 95

Phe Leu Gly Thr Ala Leu Met His Phe Leu Ser Asp Ala Asn Glu Thr

100 105 110

Phe Gly Asp Leu Leu Pro Asp Ser Gly Tyr Pro Trp Ala Phe Met Leu

115 120 125

Ala Cys Ala Gly Tyr Val Val Thr Met Leu Ala Asp Val Ala Ile Ser

130 135 140

Tyr Val Val Ser Arg Ser Gln Gly Arg Ser Thr Gly Thr Ala Ala Thr

145 150 155 160

Gly Gly Ser Asp Ala Gly Leu Glu Glu Gly Lys Met Arg Thr Thr Asn

165 170 175

Gly Thr Arg Ser Glu Pro Thr Pro Ala Asp Ala His Gly Ser Asp His

180 185 190

Ser Ala Ala Ser Ile Leu Arg Asn Ala Ser Thr Ile Gly Asp Ser Val

195 200 205

Leu Leu Ile Val Ala Leu Cys Phe His Ser Val Phe Glu Gly Ile Ala

210 215 220

Ile Gly Ile Ala Glu Thr Lys Ala Asp Ala Trp Lys Ala Leu Trp Thr

225 230 235 240

Ile Ser Leu His Lys Ile Phe Ala Ala Ile Ala Met Gly Ile Ala Leu

245 250 255

Leu Arg Met Leu Pro Asn Arg Pro Leu Leu Ser Cys Phe Ala Tyr Ala

260 265 270

Phe Ala Phe Ala Ile Ser Ser Pro Val Gly Val Gly Ile Gly Ile Ile

275 280 285

Ile Asp Ala Thr Thr Gln Gly Arg Val Ala Asp Trp Ile Phe Ala Val

290 295 300

Ser Met Gly Leu Ala Thr Gly Ile Phe Val Tyr Val Ser Ile Asn His

305 310 315 320

Leu Leu Ser Lys Gly Tyr Arg Pro Gln Arg Pro Val Ala Val Asp Thr

325 330 335

Pro Val Gly Arg Trp Leu Ala Val Val Phe Gly Val Ala Val Ile Ala

340 345 350

Val Val Met Ile Trp Asp Thr

355

<210> 5

<211> 1104

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 5

atgggagctg tgaagcatac attgaaaatg ctttcatggc tcctactctt cgcacaattg 60

gctgcggcca ccacctccaa gtgcacaaat gccacaaatg ggactgagac tgacagcctg 120

ggtgcaatga aactgaagct gattgccatt gcatccatcc tcacagctgg agcagctggt 180

gtgctagtgc cagtacttgg ccgctccatg gccacgctac atcctgatgg tgacatcttt 240

ttcgctgtca aggcatttgc agccggtgtc atcctggcca cgggcatggt ccacattctg 300

ccagcagcat ttgatgggct gacatcccca tgcctctaca aaggtggcag tggtgggaac 360

attttcccct ttgcaggact cattgcaatg tctgctgcaa tggccactat ggtgatagac 420

tcactagctg ctgggtacta ccgccggtct cacttcaaga aggcacggcc aatcgacatc 480

ctagagatcc atgaacaacc aggagatgag gaaaggtccg ggcatgcaca acatgtgcat 540

gtgcacaccc atgcaacaca tgggcattca cacggagagg tggatgtcat cagttcaccg 600

gaggaggctt caatagctga cacgatccgg cacagggtgg tatctcaggt ccttgagctc 660

ggaattttgg tgcattcagt gataattggg gtgtccttag gtgcatctgt gaggtcatcg 720

accataaggc ctcttgttgg tgcccttagc ttccatcaat tctttgaagg cattggcctg 780

ggtggttgca ttgtgcaggc aaatttcaag ttgagggcta ccgtcatgat ggcaattttt 840

ttctccctga ctgcacccat tggcattgca ttagggattg gaatttcatc aagctacaat 900

ggccatagca ctacagcgtt cattgttgaa ggagtgttca actcagcctc agcaggaatt 960

ttgatctaca tgtcattagt cgatcttctg gccacagatt tcaataagcc caaactgcag 1020

acgaatacaa agcttcagct gatgacatat cttgcacttt tcttaggtgc agggatgatg 1080

tccatgcttg ctatatgggc atag 1104

<210> 6

<211> 367

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 6

Met Gly Ala Val Lys His Thr Leu Lys Met Leu Ser Trp Leu Leu Leu

1 5 10 15

Phe Ala Gln Leu Ala Ala Ala Thr Thr Ser Lys Cys Thr Asn Ala Thr

20 25 30

Asn Gly Thr Glu Thr Asp Ser Leu Gly Ala Met Lys Leu Lys Leu Ile

35 40 45

Ala Ile Ala Ser Ile Leu Thr Ala Gly Ala Ala Gly Val Leu Val Pro

50 55 60

Val Leu Gly Arg Ser Met Ala Thr Leu His Pro Asp Gly Asp Ile Phe

65 70 75 80

Phe Ala Val Lys Ala Phe Ala Ala Gly Val Ile Leu Ala Thr Gly Met

85 90 95

Val His Ile Leu Pro Ala Ala Phe Asp Gly Leu Thr Ser Pro Cys Leu

100 105 110

Tyr Lys Gly Gly Ser Gly Gly Asn Ile Phe Pro Phe Ala Gly Leu Ile

115 120 125

Ala Met Ser Ala Ala Met Ala Thr Met Val Ile Asp Ser Leu Ala Ala

130 135 140

Gly Tyr Tyr Arg Arg Ser His Phe Lys Lys Ala Arg Pro Ile Asp Ile

145 150 155 160

Leu Glu Ile His Glu Gln Pro Gly Asp Glu Glu Arg Ser Gly His Ala

165 170 175

Gln His Val His Val His Thr His Ala Thr His Gly His Ser His Gly

180 185 190

Glu Val Asp Val Ile Ser Ser Pro Glu Glu Ala Ser Ile Ala Asp Thr

195 200 205

Ile Arg His Arg Val Val Ser Gln Val Leu Glu Leu Gly Ile Leu Val

210 215 220

His Ser Val Ile Ile Gly Val Ser Leu Gly Ala Ser Val Arg Ser Ser

225 230 235 240

Thr Ile Arg Pro Leu Val Gly Ala Leu Ser Phe His Gln Phe Phe Glu

245 250 255

Gly Ile Gly Leu Gly Gly Cys Ile Val Gln Ala Asn Phe Lys Leu Arg

260 265 270

Ala Thr Val Met Met Ala Ile Phe Phe Ser Leu Thr Ala Pro Ile Gly

275 280 285

Ile Ala Leu Gly Ile Gly Ile Ser Ser Ser Tyr Asn Gly His Ser Thr

290 295 300

Thr Ala Phe Ile Val Glu Gly Val Phe Asn Ser Ala Ser Ala Gly Ile

305 310 315 320

Leu Ile Tyr Met Ser Leu Val Asp Leu Leu Ala Thr Asp Phe Asn Lys

325 330 335

Pro Lys Leu Gln Thr Asn Thr Lys Leu Gln Leu Met Thr Tyr Leu Ala

340 345 350

Leu Phe Leu Gly Ala Gly Met Met Ser Met Leu Ala Ile Trp Ala

355 360 365

<210> 7

<211> 1164

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 7

atggttctcg ccggcctccg ccggcacgtc ggccagttct tgaccagcag taatgagctt 60

atggcggcgt cgctctcggc cgtgagctgc gcggacgagg tgcagaaggc ggagggagcg 120

gggtgccgtg acgacgccgc ggcgctgcgg ctcaagaagg tggccatggc ggcgatactg 180

gtggccgggg tgctcggggt ggtcctgccg ctcgcggggc ggaagcggcg cgcgctgcgc 240

acggacagcg ccgcgttcct ggcggccaag gcgttcgccg ccggggtcat cctggccacg 300

gggttcgtcc acatgcttca cgacgccgag cacgcgctgt ccagcccgtg cctccccgcc 360

gcgccgtggc gacggttccc agtccccggg ttcgtcgcca tggccgccgc gctagccacg 420

ctggtgctcg acttccttgc caccaggttc tacgaggcca agcatcgcga cgaggccgcg 480

cgcgtcaagg cggccgccgc cgccgcactg gttgcgacct cctctgggag cgacgaggac 540

atcaccgtgg tcaccgtcga tgaggacgag cgcaaggccc cgctgttgca aacgcactgc 600

catggacacg gtcacagcca cagccacagc catgtgcatg agccggtgca ggtagagggt 660

agcgaggcgg aggtgtcggc acatgtgcgc tccattgtcg tgtcacagat actggagatg 720

gggattgtgt cacactctgt gatcatcgga ttgtcactgg gagtgtcgcg gagcccatgc 780

acaatcaggc cacttgttgc agcacttgca ttccaccagt tcttcgaggg gtttgcacta 840

ggtgggtgca ttgctcaggc acaattcaag aacctttcag cagttctaat ggcatctttc 900

ttcgccatca caacaccggc aggaatagct gctggggcag gcatgaccac attctacaat 960

cccaatagcc caagggccct tgtggtcgag ggcattcttg actcggtatc tgctggcatt 1020

ctcatataca tgtcactagt ggatctcatt gctgtagatt tcttgggtgg aaagatgaca 1080

gggaccctgc gacaacaagt gatggcatac atcgcattgt tcctcggtgc gctctctatg 1140

tcatcacttg caatatgggc ttga 1164

<210> 8

<211> 387

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 8

Met Val Leu Ala Gly Leu Arg Arg His Val Gly Gln Phe Leu Thr Ser

1 5 10 15

Ser Asn Glu Leu Met Ala Ala Ser Leu Ser Ala Val Ser Cys Ala Asp

20 25 30

Glu Val Gln Lys Ala Glu Gly Ala Gly Cys Arg Asp Asp Ala Ala Ala

35 40 45

Leu Arg Leu Lys Lys Val Ala Met Ala Ala Ile Leu Val Ala Gly Val

50 55 60

Leu Gly Val Val Leu Pro Leu Ala Gly Arg Lys Arg Arg Ala Leu Arg

65 70 75 80

Thr Asp Ser Ala Ala Phe Leu Ala Ala Lys Ala Phe Ala Ala Gly Val

85 90 95

Ile Leu Ala Thr Gly Phe Val His Met Leu His Asp Ala Glu His Ala

100 105 110

Leu Ser Ser Pro Cys Leu Pro Ala Ala Pro Trp Arg Arg Phe Pro Val

115 120 125

Pro Gly Phe Val Ala Met Ala Ala Ala Leu Ala Thr Leu Val Leu Asp

130 135 140

Phe Leu Ala Thr Arg Phe Tyr Glu Ala Lys His Arg Asp Glu Ala Ala

145 150 155 160

Arg Val Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Val Ala Thr Ser Ser Gly

165 170 175

Ser Asp Glu Asp Ile Thr Val Val Thr Val Asp Glu Asp Glu Arg Lys

180 185 190

Ala Pro Leu Leu Gln Thr His Cys His Gly His Gly His Ser His Ser

195 200 205

His Ser His Val His Glu Pro Val Gln Val Glu Gly Ser Glu Ala Glu

210 215 220

Val Ser Ala His Val Arg Ser Ile Val Val Ser Gln Ile Leu Glu Met

225 230 235 240

Gly Ile Val Ser His Ser Val Ile Ile Gly Leu Ser Leu Gly Val Ser

245 250 255

Arg Ser Pro Cys Thr Ile Arg Pro Leu Val Ala Ala Leu Ala Phe His

260 265 270

Gln Phe Phe Glu Gly Phe Ala Leu Gly Gly Cys Ile Ala Gln Ala Gln

275 280 285

Phe Lys Asn Leu Ser Ala Val Leu Met Ala Ser Phe Phe Ala Ile Thr

290 295 300

Thr Pro Ala Gly Ile Ala Ala Gly Ala Gly Met Thr Thr Phe Tyr Asn

305 310 315 320

Pro Asn Ser Pro Arg Ala Leu Val Val Glu Gly Ile Leu Asp Ser Val

325 330 335

Ser Ala Gly Ile Leu Ile Tyr Met Ser Leu Val Asp Leu Ile Ala Val

340 345 350

Asp Phe Leu Gly Gly Lys Met Thr Gly Thr Leu Arg Gln Gln Val Met

355 360 365

Ala Tyr Ile Ala Leu Phe Leu Gly Ala Leu Ser Met Ser Ser Leu Ala

370 375 380

Ile Trp Ala

385

<210> 9

<211> 1191

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 9

atggccatga ggccacgcgc cgcgctcgcc ctcgccctgg cagccggcgt cccgctggtc 60

ctcctcctcc tcctcgcgcc cggcgcgcgc gccgacgacg gcagcggcgg gtgcggggcg 120

gcgggcggcg gcgaggcggc gccgggcgac cgcgcgcggg ccagggcgct gaagatcgcg 180

gccttcttct ccatcctcgt gtgcggggcg ctgggctgct gcctgcccgt gctggggcgg 240

cgcgtgccgg cgctgcgccc cgacagggac gtgttcttcc tgatcaaggc gttcgcggcg 300

ggggtcatcc tggccacggg gttcatccac atcctccccg acgcgttcga gaagctcacg 360

tccgattgcc tctccgacgg gccgtggcag gacttcccct tcgcggggct cggcgccatg 420

gtcggcgcca tcggcacgct cgtcgtcgac accgtcgcca cgggctactt cacgcgcgtc 480

cacttcaagg acagcgccgc cgccgccgtg ggcgccgccg ccgtcggcga cgaggagaag 540

cagcagcagc aggcggcgtc ggcgccgcac gtcgacgacg gagcagacgg cgacggccac 600

ggccacggcg ggcacgtgca catgcacacg cacgcgacgc acgggcactc gcacggcgcc 660

tcggcgctcg tggccgccgt cggcggcgcc gagggcgaca aggagcacgc gctgcgccac 720

cgtgtcatcg ctcaggttct tgagcttggg attgtggtgc actcggtgat catcggcatc 780

tccctcggcg cgtctcaaga ccccagcacc atcaagcctc ttgtggtcgc cctcagcttc 840

caccaaatgt tcgagggcat gggtcttggc ggctgcatcg ttcaggccaa gttcaagctg 900

cggtcgatcg tgacgatggt gctcttcttc tgcctgacga cgccggtggg catcgtggtg 960

ggcgtcggga tctcgtcggt gtacgacgag gacagcccca cggcgctggt cgtggagggc 1020

gtgctcaact cggtggcggc ggggatcctg gtgtacatgg cgctggtgga cctgctcgcc 1080

gaggacttca tgaaccctag ggtgcagagc cggggcaagc tgcagctcgg catcaacgcc 1140

tccatgctcg tcggcgccgg cctcatgtcc atgctggcca agtgggccta g 1191

<210> 10

<211> 396

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 10

Met Ala Met Arg Pro Arg Ala Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Val Pro Leu Val Leu Leu Leu Leu Leu Ala Pro Gly Ala Arg Ala Asp

20 25 30

Asp Gly Ser Gly Gly Cys Gly Ala Ala Gly Gly Gly Glu Ala Ala Pro

35 40 45

Gly Asp Arg Ala Arg Ala Arg Ala Leu Lys Ile Ala Ala Phe Phe Ser

50 55 60

Ile Leu Val Cys Gly Ala Leu Gly Cys Cys Leu Pro Val Leu Gly Arg

65 70 75 80

Arg Val Pro Ala Leu Arg Pro Asp Arg Asp Val Phe Phe Leu Ile Lys

85 90 95

Ala Phe Ala Ala Gly Val Ile Leu Ala Thr Gly Phe Ile His Ile Leu

100 105 110

Pro Asp Ala Phe Glu Lys Leu Thr Ser Asp Cys Leu Ser Asp Gly Pro

115 120 125

Trp Gln Asp Phe Pro Phe Ala Gly Leu Gly Ala Met Val Gly Ala Ile

130 135 140

Gly Thr Leu Val Val Asp Thr Val Ala Thr Gly Tyr Phe Thr Arg Val

145 150 155 160

His Phe Lys Asp Ser Ala Ala Ala Ala Val Gly Ala Ala Ala Val Gly

165 170 175

Asp Glu Glu Lys Gln Gln Gln Gln Ala Ala Ser Ala Pro His Val Asp

180 185 190

Asp Gly Ala Asp Gly Asp Gly His Gly His Gly Gly His Val His Met

195 200 205

His Thr His Ala Thr His Gly His Ser His Gly Ala Ser Ala Leu Val

210 215 220

Ala Ala Val Gly Gly Ala Glu Gly Asp Lys Glu His Ala Leu Arg His

225 230 235 240

Arg Val Ile Ala Gln Val Leu Glu Leu Gly Ile Val Val His Ser Val

245 250 255

Ile Ile Gly Ile Ser Leu Gly Ala Ser Gln Asp Pro Ser Thr Ile Lys

260 265 270

Pro Leu Val Val Ala Leu Ser Phe His Gln Met Phe Glu Gly Met Gly

275 280 285

Leu Gly Gly Cys Ile Val Gln Ala Lys Phe Lys Leu Arg Ser Ile Val

290 295 300

Thr Met Val Leu Phe Phe Cys Leu Thr Thr Pro Val Gly Ile Val Val

305 310 315 320

Gly Val Gly Ile Ser Ser Val Tyr Asp Glu Asp Ser Pro Thr Ala Leu

325 330 335

Val Val Glu Gly Val Leu Asn Ser Val Ala Ala Gly Ile Leu Val Tyr

340 345 350

Met Ala Leu Val Asp Leu Leu Ala Glu Asp Phe Met Asn Pro Arg Val

355 360 365

Gln Ser Arg Gly Lys Leu Gln Leu Gly Ile Asn Ala Ser Met Leu Val

370 375 380

Gly Ala Gly Leu Met Ser Met Leu Ala Lys Trp Ala

385 390 395