一個育性調控基因OsRPLP0及其應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一個育性調控基因OsRPLP0及其應用，屬于植物生物技術領域，具體涉及一個水稻酸性核糖體磷酸化蛋白OsRPLP0，編碼所述蛋白的基因突變后可以導致植株雄性不育。本發(fā)明提供的育性基因以及基于該基因突變所產生的雄性不育系，該不育系的育性穩(wěn)定、不受環(huán)境條件影響、能夠被野生型轉基因恢復。該基因以及該基因突變產生的不育系為構建新型雜交育種體系提供了必要的元件，在生產實踐中具有重要的意義。
【專利說明】
-個育性調控基因 OsRPLPO及其應用
技術領域
[0001]本發(fā)明屬于植物生物技術領域，具體涉及一個水稻酸性核糖體磷酸化蛋白 OsRPLPO,編碼所述蛋白的基因突變后可以導致植株雄性不育，本發(fā)明還公開了 OsRPLPO基 因及其突變體在雜交育種中的應用。 技術背景
[0002] 原核生物和真核生物的核糖體大亞基上都存在著一類與蛋白質翻譯密切相關的 酸性核糖體磷酸化蛋白。在真核生物它們是酸性核糖體磷酸化蛋白P〇，P1，P2 (acidicribosomal phosphoproteins ΡΟ,ΡΙ and P2)，而在原核生物如Escherichia coli 體內，它們分別為L10和L7/L12蛋白，其中與P0蛋白相對應的蛋白為L10，與PI、P2蛋白相對 應的蛋白為L7/L12。原核生物和真核生物的酸性核糖體磷酸化蛋白在結構和功能上具有高 度的同源性，所不同的是在原核生物，L7/L12蛋白是由同一基因編碼的，只是在翻譯過程 中，相比于L12蛋白，L7蛋白的N末端被顯著的乙?；?，而在真核生物，這三種酸性核糖體 磷酸化蛋白則都是由獨立基因編碼的。目前，對于原核生物的L10和L7/L12蛋白研究得比較 廣泛，但對真核生物的酸性核糖體磷酸化蛋白P0、P1、P2的研究則大多是基于在原核生物的 L10和L7/L12蛋白研究上同源推測，其參與翻譯延伸的機制仍未完全明了。已有研究證實真 核生物的酸性核糖體磷酸化蛋白還與細胞凋亡、腫瘤的發(fā)生侵襲及免疫性疾病有關。
[0003] 本發(fā)明公開了一個水稻酸性核糖體磷酸化蛋白0sRPLP0(60S acidic ribosomal protein P0)基因，所述基因突變后植株出現(xiàn)無花粉型的雄性不育表型。為了解決目前水稻 雜交種育種方法中存在的缺陷，如不育系的穩(wěn)定性、雜交品種資源的局限性、制種技術復 雜、制種成本高等技術瓶頸，人們正在嘗試新的雜交育種技術，新型的雜交育種技術將充分 利用隱性純合后導致雄性不育的核基因，構建育性穩(wěn)定不受環(huán)境影響的不育系，解除環(huán)境 因素對雜交育種的制約，消除生產上的潛在風險；同時，所利用的隱性核不育基因應該適用 于絕大多數(shù)品種，使雜種優(yōu)勢資源利用大幅提高，解決雜種優(yōu)勢的資源利用問題;本發(fā)明即 提供了一種作物育性基因以及基于該基因突變所產生的雄性不育系，該不育系的育性穩(wěn) 定、不受環(huán)境條件影響、能夠被野生型轉基因恢復。該基因以及該基因突變產生的不育系為 構建新型雜交育種體系提供了必要的元件。
[0004] 發(fā)明簡述
[0005] 本發(fā)明提供了一個OsRPLPO基因及其DNA序列，所述OsRPLPO基因具有調控植物育 性的功能，其DNA序列如SEQ ID NO: 1或5所示，本發(fā)明所述的OsRPLPO基因的核苷酸序列也 包括在嚴格條件下能夠與序列SEQ ID N0:1或5的DNA雜交的DNA序列，或與序列SEQ ID N0: 1或5互補的DNA序列。
[0006] 本發(fā)明還提供了一個育性調控基因 OsRPLPO的氨基酸序列，所述氨基酸序列如SEQ ID N0:2或6所示。
[0007] 本發(fā)明還提供了一種表達盒，其特征在于所述表達盒包含如SEQ ID NO: 1或5所示 的DNA序列。
[0008] 本發(fā)明還提供了 一種表達載體，其特征在于所述表達載體包含上述的表達盒。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種工程菌，其特征在于所述工程菌包含上述的表達載體。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種基因在植物育性調控中的應用，其特征在于，所述育性調控 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1或5所示。
[0011]本發(fā)明還包括一種通過突變育性調控基因 SEQ ID NO: 1或5獲得雄性不育材料的 方法。
[0012] 本發(fā)明中所述的"突變"包括在育性調控基因的核苷酸序列上進行取代、插入或缺 失一個或多個核苷酸。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種恢復由相應的SEQ ID NO: 1或5所示基因突變所導致的雄性 不育，使雄性不育突變體恢復成可育的方法。
[0014] 本發(fā)明還包括一種突變體材料的應用，其特征在于所述突變材料是由核苷酸序列 的突變所造成，所述核苷酸序列如SEQ ID NO: 1或5所示。
[0015] 上述"突變"可以是點突變，也可以是DNA缺失或插入突變。所述"突變"可以通過化 學誘變或基因定點突變的方式獲得，化學誘變的方法包括用EMS等誘變劑處理所導致的誘 變；基因定點突變的方法包括但不限于ZFN定點突變方法、TALEN定點突變方法、和/或 CRISPR/Cas9等定點突變方法。
[0016] 本發(fā)明還提供了將上述材料和DNA序列應用于育種中的方法，更具體地所述應用 是指將突變體植株作為不育系母本，與恢復系雜交，生產雜交種子。
[0017] 本發(fā)明還包括上述DNA序列在以下(a)至(d)中任一項中的應用：
[0018] (a)培育植物品種或品系；
[0019] (b)培育授粉受精能力增強的植物品種或品系；
[0020] (c)培育授粉受精能力消弱的植物品種或品系；
[0021 ] (d)培育雄性不育植物品種或品系。
[0022]本發(fā)明還提供了一種用于保持雄性不育植株的純合隱性狀態(tài)的方法，所述方法包 括：
[0023] a)提供第一植株，其包含OsRPLPO基因的純合隱性突變，并且其是雄性不育的； [0024] b)向第一植株中引入下述構建體，形成第二植株，所述第二植株包含OsRPLPO基因 的純合隱性突變等位基因和所述構建體，且構建體在第二植株中為雜合狀態(tài)，所述構建體 包含：
[0025] i)第一核苷酸序列，其包含正常OsRPLPO核苷酸序列，當在第一植株中表達時，其 將恢復該植株的雄性生育力；
[0026] ii)第二核苷酸序列，當其表達時，會抑制所述第二植株中可育雄性配子的形成或 功能，具體為花粉失活基因 ZM-PA;和
[0027] c)用所述第二植株的雄性配子使所述第一植株受精，以產生保持了所述第一植株 純合隱性狀態(tài)的后代。
【附圖說明】
[0028]圖1是植株形態(tài)，左為野生型HHZ，右為突變體osrplpO。
[0029]圖2是花藥形態(tài)，其中左為野生型HHZ(黃華占）的花藥形態(tài)，右為突變體osrplpO的 花藥形態(tài)。
[0030]圖3是花粉I2-KI染色，其中左為野生型HHZ的花粉染色結果，右為突變體osrplpO 的花粉染色結果。
[0031 ] 圖4是OsRPLPO基因的cDNA編碼區(qū)在粳稻日本晴(Nip)、野生型黃華占（HHZ)和突變 體osrp ΙρΟ材料中的核苷酸比對結果。
[0032] 圖5是粳稻日本晴(Nip)、野生型黃華占（HHZ)和突變體osrplpO材料中的OsRPLPO 蛋白的氨基酸序列比對結果。
[0033] 圖6是OsRPLPO基因在水稻中的時空表達模式，其中Root為根，Stem為莖，Leaf為 葉，Glume為外稃，Lemma是內稃，Pal ea是穎片，Pistil是雌蕊，an_st6是幼穗穎花原基分化 期（stage6)，an_st7是幼穗花粉母細胞減數(shù)分裂時期（stage7)，an_st8是四分體形成階段 (8七&868)，311_8七9是小孢子早期（8七3869)，311_81：10是小孢子中晚期（8七38610)，311_81：11是 二胞花粉期，an_stl2是成熟花粉期（stagel2)。
[0034]圖7是OsRPLPO基因在野生型與突變體材料中的表達變化情況，其中st7是幼穗花 粉母細胞減數(shù)分裂時期（stage7)，st8是四分體形成階段（stage8)，St9是小孢子早期 (stage9)，st 10是小孢子中晚期（stage 10)，st 11是二胞花粉期，st 12是成熟花粉期 (stagel2)〇
[0035] 發(fā)明詳述
[0036] 本文提到的所有參考文獻都通過引用并入本文。
[0037] 除非有相反指明，本文所用的所有技術和科學術語都具有與本發(fā)明所屬領域普通 技術人員通常所理解的相同的含義。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技術是本領 域普通技術人員公知的標準技術。材料、方法和例子僅作闡述用，而非加以限制。
[0038] 本發(fā)明包括一種育性相關基因及其核苷酸和蛋白序列，還包括通過操作該基因在 調控植株雄性生育力中的應用。非限制性地舉例而言，下文描述的任何方法都可與本發(fā)明 所提供的相應核苷酸序列一起使用，例如，將所述育性基因的突變體序列引入植株以導致 植株雄性不育、使植株內源序列突變、向植株中引入該序列的反義序列、使用發(fā)卡形式、或 將其與其它核苷酸序列連接起來調控植株的表型，或者是本領域技術人員已知的可用于影 響植株的雄性生育力的多種方法中的任一方法。
[0039]本發(fā)明所提供的育性基因 OsRPLPO,是一個花粉發(fā)育相關的基因。在水稻中該育性 基因位于第8號染色體上，其在秈稻中的核苷酸編碼序列如SEQ ID N0:1或7所示，氨基酸序 列如SEQ ID N0: 2所示；在粳稻中其核苷酸序列如SEQ ID N0: 5所示，其氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。
[0040] 本發(fā)明還包括下列組的序列之一:a)與上述OsRPLPO基因序列具有至少90% (優(yōu)選 為至少95%)序列相似性，且具有相同功能的DNA序列;b)在嚴格條件下能夠與(a)所述序列 的DNA雜交的DNA序列；c)與上述任一所述序列互補的DNA序列。
[0041] 上述所述育性基因，可從各種植物中分離獲得。本領域技術人員應該知曉，本發(fā)明 所述的育性恢復基因包括與OsRPLPO基因高度同源，并且具有同樣的育性調控功能的高度 同源的功能等價體序列。所述高度同源的功能等價體序列包括在嚴謹條件下能夠與本發(fā)明 所公開的RPLP0基因的核苷酸序列雜交的DNA序列。本發(fā)明中所使用的"嚴謹條件"是公知 的，包括諸如在含400mM NaCl、40mM PIPES(pH6.4)和ImM EDTA的雜交液中于60°C雜交12- 16小時，然后在65°C下用含0.1SDS、和0.1 % SSC的洗滌液洗滌15-60分鐘。
[0042] 功能等價體序列還包括與本發(fā)明所公開的OsRPLPO基因所示的序列有至少90%、 95%、96%、97%、98%、或99%序列相似性，且具有育性調控功能的0祖序列，可以從任何植 物中分離獲得。其中，序列相似性的百分比可以通過公知的生物信息學算法來獲得，包括 Myers和Miller算法（Bioinformatics，4( 1): 11-17，1988)、Needleman_Wunsch全局比對法 (了.]?〇1.81〇1.，48(3):443-53，1970)、511^讓-?^^6^^11局部比對法（了.]\1〇1.81〇1.，147 :195-197，1981)、Pearson和Lipman相似性搜索法（PNAS，85(8) :2444-2448，1988)、Karl in和 Altschul的算法（Altschul等，J.Mol.Biol.，215(3) :403-410，1990;PNAS，90:5873-5877， 1993)。這對于本領域技術人員來說是熟悉的。
[0043]本發(fā)明所述的基因序列可以從任何植物中分離獲得，包括但不限于蕓苔屬、玉米、 小麥、高粱、兩節(jié)#屬、白芥、蓖麻子、芝麻、棉籽、亞麻子、大豆、擬南芥屬、菜豆屬、花生、苜 蓿、燕麥、油菜籽、大麥、燕麥、黑麥（Rye)、粟、蜀黍、小黑麥、單粒小麥、斯佩爾特小麥 (Spelt)、雙粒小麥、亞麻、格蘭馬草(Gramma grass)、摩擦禾、假蜀黍、羊茅、多年生麥草、甘 蔗、紅莓苔子、番木瓜、香蕉、紅花、油棕、香瓜、蘋果、黃瓜、石斛、劍蘭、菊花、百合科、棉花、 桉、向日葵、蕓苔、甜菜、咖啡、觀賞植物和松類等。優(yōu)選地，植物包括玉米、大豆、紅花、芥菜、 小麥、大麥、黑麥、稻、棉花和高粱。
[0044] 本發(fā)明還提供了通過影響OsRPLPO的核苷酸序列或者通過調控OsRPLPO基因的轉 錄表達從而影響植株育性的方法。所述影響植株育性是指通過調控OsRPLPO基因的表達，從 而使所述植株的育性發(fā)生改變，如導致植株雄性不育。具體地，取決于具體應用需求，可以 通過多種方法來影響OsRPLPO基因在植物體內的表達，從而達到調控植株雄性育性的效果。 更具體地，調控OsRPLPO基因的表達可以使用許多本領域普通技術人員可獲得的工具進行， 例如，通過突變、誘變、反義基因的轉入、共抑制或發(fā)夾結構的引入等，都可以用于破壞 OsRPLPO基因的正常表達，從而獲得雄性不育的植株。另一方面，本發(fā)明還包括通過將野生 型OsRPLPO的核苷酸序列引入植株來恢復OsRPLPO表達被破壞的植株的雄性生育力。
[0045]本發(fā)明還提供了一種OsRPLPO基因的不育突變體序列及其雄性不育突變體材料。 更具體地，所述雄性不育突變體材料是通過突變水稻內源的OsRPLPO基因，或突變與其高度 同源的基因的核苷酸序列，使該植物體喪失雄性育性的過程。所述"突變"包括但不限于以 下方法，如用物理或化學的方法導致的基因突變，化學方法包括用EMS等誘變劑處理所導致 的誘變，所述突變還可以是點突變，也可以是DNA缺失或插入突變，還可以是通過RNAi、基因 定點突變等基因沉默手段產生?；蚨c突變的方法包括但不限于ZFN定點突變方法、 TALEN定點突變方法、和/或CRISPR/Cas9等定點突變方法。
[0046]具體地，本發(fā)明還提供了一種水稻雄性不育突變體，其控制雄性育性的基因發(fā)生 突變，所述基因突變后的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示，氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。 與野生型相比，該基因 cDNA第379個堿基C突變?yōu)門，導致基因編碼的氨基酸發(fā)生替換，由脯 氨酸Pro(CCC)突變?yōu)榻z氨酸Ser(TCC)。本領域技術人員應該知曉，可以將所述核苷酸序列 SEQ ID N0:3構建到植物表達載體，進行植物轉化，從而獲得新的轉基因的雄性不育突變體 材料?；蛘咄ㄟ^構建OsRPLPO基因的TALLEN或CRISPR/Cas9體系，轉化植株，從而獲得該植株 中OsRPLPO基因發(fā)生突變的雄性不育突變體。
[0047]本發(fā)明還包括含有OsRPLPO基因的構建體，所述構建體包括通常所說的載體或表 達盒。所述構建體中的啟動子可以是天然啟動子或被取代的啟動子，其將驅動所連核苷酸 序列在植株中的表達。構建體中的啟動子可以是誘導型啟動子。當將OsRPLPO基因的核苷酸 序列與另一個啟動子相連，優(yōu)選的是，該啟動子在花粉發(fā)育早期充分驅動該序列的表達，例 如可以在花粉發(fā)育的P9期特異性表達。具體地，可使用的啟動子的種類包括組成型病毒啟 動子，例如花椰菜花葉病毒(CaMV)19S和35S啟動子，或玄參花葉病毒35S啟動子，或泛素啟 動子。
[0048] 組織特異表達啟動子可用于靶向特定的植物組織中增強轉錄和/或表達。啟動子 可在目標組織中表達也在其它植物組織中表達，可在目標組織中強烈表達以及比其它組織 程度低得多的表達，或者可高度優(yōu)選在目標組織中表達。在一種實施方式中，啟動子是偏好 在植物的雄性或雌性組織中特異表達的類型。本發(fā)明不必須在方法中使用任何特定的雄性 組織優(yōu)先型啟動子，本領域技術人員已知的很多此類啟動子中的任何都可以使用。本文描 述的天然的RPLP0啟動子是可使用的啟動子的一個例子。另一種此類啟動子是5126啟動子、 MS45啟動子、MS26啟動子、BS92-7啟動子、SGB6調控元件和TA29啟動子等，其偏好于指導其 連接的基因在植物雄性組織中的表達。某些構建體中還可以包括配子組織優(yōu)先表達啟動 子。雄性配子優(yōu)先表達啟動子包括PG47啟動子以及ZM13啟動子。
[0049] 上述構建體中還可包括其它組分，這主要取決于載體構建的目的和用途，例如可 進一步包括選擇標記基因、靶向或調控序列、穩(wěn)定序列或引導序列、內含子等。表達盒還將 在目標異源核苷酸序列的3'端包括在植物中具有功能的轉錄和翻譯終止子。終止子可以是 本發(fā)明所提供基因的終止子，也可以是來自外源的終止子。更具體地，上述終止子可以是胭 脂氨酸合酶或章魚堿合酶終止區(qū)域。
[0050] 在希望將異源核苷酸序列的表達產物引向特定細胞器，例如質體、造粉體，或者引 向內質網，或在細胞表面或細胞外分泌的情況下，表達盒還可包含用于編碼轉運肽的核苷 酸序列。此類轉運肽是本領域所公知的，其包括但不限于Rubisco的小亞基、植物EPSP合酶、 玉米Britt le-Ι葉綠體轉運肽等。
[0051] 在制備表達盒的過程中，可對多種DNA片段加以操作，以提供處于合適方向，或是 處于正確讀碼框中的DNA序列。為達到此目的，可使用銜接子或接頭，將DNA片段連起來，或 者進一步包括其它操作，以提供方便的限制性酶切位點等。
[0052] 進一步地，本發(fā)明所提供的構建體中還可包括選擇標記基因，用于選擇經轉化的 細胞或組織。所述選擇標記基因包括賦予抗生素抗性或對除草劑抗性的基因。合適的選擇 標記基因包括但不限于:氯霉素抗性基因，潮霉素抗性基因，鏈霉素抗性基因，奇霉素抗性 基因，磺胺類抗性基因，草甘磷抗性基因，草丁嶙抗性基因。所述選擇標記基因還可以是紅 色熒光基因、青色熒光蛋白基因、黃色熒光蛋白基因、熒光素酶基因、綠色熒光蛋白基因、花 青甙pl等基因。
[0053] 本發(fā)明所提供的表達盒或載體可被插入質粒、粘粒、酵母人工染色體、細菌人工染 色體或其他適合轉化進宿主細胞中的任何載體中。優(yōu)選的宿主細胞是細菌細胞，尤其是用 于克隆或儲存多核苷酸、或用于轉化植物細胞的細菌細胞，例如大腸桿菌、根瘤土壤桿菌和 毛根土壤桿菌。當宿主細胞是植物細胞時，表達盒或載體可被插入被轉化的植物細胞的基 因組中。插入可以是定位的或隨機的插入。優(yōu)選地，插入通過諸如同源重組來實現(xiàn)。另外，表 達盒或載體可保持在染色體外。本發(fā)明的表達盒或載體可存在于植物細胞的核、葉綠體、線 粒體和/或質體中。優(yōu)選地，本發(fā)明的表達盒或載體被插入植物細胞核的染色體DNA中。 [0054]本發(fā)明還包括所公開的OsRPLPO基因及其啟動子的應用，在某些應用的實施方式 中，可以應用本發(fā)明所提供的OsRPLPO基因或其啟動子來實現(xiàn)RPLP0或其他類似育性相關基 因突變所獲得的雄性不育系的繁殖和保持。
[0055]具體地，上述雄性不育系的繁殖和保持，是指以純合隱性核雄性不育突變體為轉 化受體材料，將緊密連鎖的3個目標基因轉化至該不育突變體受體植株中。所述3個目標基 因分別是育性恢復基因、花粉失活基因和顏色標記篩選基因。其中，育性恢復基因可使不育 的轉化受體育性恢復，花粉失活基因可使含有轉化的外源基因的花粉失活，即失去授精能 力，篩選基因可以用于轉基因種子和非轉基因種子的分揀，分揀出的非轉基因種子用作不 育系生產雜交種，轉基因種子用作保持系來源源不斷地、穩(wěn)定地生產不育系。
[0056]更具體地，根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，可以以水稻核隱性不育osrplpO/osrplpO突 變體為轉化受體材料，將緊密連鎖的3個目標基因轉化至該不育系：其中，育性恢復基因 OsRPLPO可使轉化受體育性恢復;花粉失活基因 Zm-PA可使含有外源基因的花粉失活，即失 去授精能力；熒光色選基因 RFP(r)用于轉基因種子和非轉基因種子的分揀，分揀出的非轉 基因種子用作不育系生產雜交種，轉基因種子用作保持系來源源不斷地穩(wěn)定地生產不育 系。由于該技術利用生物技術生產非轉基因產品，解決了水稻雜交制種過程中面臨的瓶頸 問題，即三系法資源利用率低而兩系法中不育系育性不穩(wěn)定的問題(詳細方法可參閱PCT專 利PCT/CN2013/086657)。
[0057] 本發(fā)明的所提供的花粉特異表達啟動子可用于外源基因在花粉中的特異性表達， 從而避免該外源基因在植物其他組織中持續(xù)表達所帶來的不利影響，還可以用于植物花粉 生長發(fā)育相關基因的功能分析和鑒定；可用于雄性不育系和恢復系的創(chuàng)建;并可應用于花 粉敗育實驗中，從而避免由植物轉基因漂移或花粉逃逸所帶來的生物安全問題，對植物雄 性不育系和恢復系的創(chuàng)造具有重要意義。
[0058] 本發(fā)明還提供了 一種植物的生產方法，其包括：
[0059] (1)構建本發(fā)明第二方面或第五方面所提供的表達盒；
[0060] (2)將步驟(1)獲得的表達盒導入植物細胞；
[0061] (3)再生出轉基因植物;和
[0062] (4)選擇出轉基因植物;并且
[0063] (5)任選地，增殖步驟(4)獲得的植物以獲得后代。
[0064] 本發(fā)明的轉基因植物使用植物生物技術領域技術人員已知的轉化方法制備。任何 方法可被用于將重組表達載體轉化進植物細胞中，以產生本發(fā)明的轉基因植物。轉化方法 可包括直接和間接的轉化方法。合適的直接方法包括聚乙二醇誘導的DNA攝入、脂質體介導 的轉化、使用基因槍導入、電穿孔、以及顯微注射等。在本發(fā)明的【具體實施方式】中，本發(fā)明使 用了基于土壤桿菌的轉化技術(可參見Horsch RB等（1985)Science 225:1229;White FF， Vectors for Gene Transfer in Higher PI ants,Transgenic Plants，第1卷， Engineering and Utilization,Academic Press，1993，pp·15-38;Jenes B等.Techniques for Gene Transfer,Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization , Academic Press，1993，pp. 128-143,等）。土壤桿菌菌株(例如根瘤土壤桿菌或毛根土壤桿 菌)包含質粒(Ti或Ri質粒)和T-DNA元件，所述質粒和元件在用土壤桿菌轉染后被轉移至植 物，而T-DNA被整合進植物細胞的基因組中。T-DNA可位于Ri-質?；騎i-質粒上，或獨立地包 含在所謂的雙元載體中。土壤桿菌介導的轉化方法描述于例如中。土壤桿菌介導的轉化最 適合雙子葉植物，但是也適合單子葉植物。土壤桿菌對植物的轉化描述于例如中。轉化可導 致瞬時或穩(wěn)定的轉化和表達。盡管本發(fā)明的核苷酸序列可被插入落入這些廣泛種類中的任 何植物和植物細胞中，但是其尤其適用于作物植物細胞。
[0065] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下的有益效果:本發(fā)明提供了一種水稻花粉發(fā)育 基因以及基于該基因突變所產生的雄性不育系，該不育系的育性穩(wěn)定、不受環(huán)境條件影響、 能夠被野生型轉基因恢復。該基因以及該基因突變產生的不育系為構建第三代雜交育種體 系提供了必要的元件，該基因突變產生的雄性不育系，用來生產雜交種子，對于突破并改良 現(xiàn)有的"三系"和"兩系"雜交技術有重要意義。
【具體實施方式】
[0066] 下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施 例。
[0067] 實施例1、水稻雄性不育突變體(osrplpO)篩選
[0068] 該突變體的獲得是通過EMS誘變秈稻黃華占種子（M0)，EMS誘變濃度和時間是 0.7 %，12小時，來自M0代種子植株結實后混收，獲得突變體庫(Ml)。來自Ml代種子的植株在 種子成熟期用于篩選，通過表型觀察，獲得不育株。不育株割稻粧再生，再生株在生殖期用 I2-KI染色檢測花粉發(fā)育和染色反應。其中一個突變體表現(xiàn)為無花粉型不育(no pollen)， 命名為osrplpO。
[0069]實施例2、水稻雄性不育突變體(osrplpO)遺傳分析
[0070] osrplpO突變體不育株與野生型黃華占雜交，三個雜交群體F1代植株全部表現(xiàn)為 可育。再將F1代進行自交，F(xiàn)2代植株中不育與可育植株的分離比接近1:3(表1)，顯示該突變 是由隱性單基因控制。
[0071] 表1:水稻雄性不育突變體(osrplpO)雜交F2代分離比
[0072]
[0073] 實施例3、水稻雄性不育突變體(osrplpO)生殖器官表型分析
[0074] 與野生型相比，突變體植株生長發(fā)育正常，不育株比可育株開花晚2-3天（圖1)。突 變體花藥瘦小，呈白色（圖2 )，花藥不開裂，沒有花粉，進一步用12-KI溶液對突變體的花粉 進行染色檢測，結果如圖3所示，野生型的花粉染色正常，而突變體沒有花粉。突變體柱頭外 露率達61 %以上，而野生型黃華占柱頭很少外露。
[0075] 實施例4、水稻雄性不育突變體基因的克隆
[0076] 突變體基因克隆采取Mutmap方法，即利用突變體與原野生親本雜交構建F2群體， 通過重測序進行基因定位的方法。將不育株與野生型黃華占雜交，選取30棵F2代不育植株， 取葉片提取基因組DNA，等量混合后用于高通量基因組測序，共獲得約18.5Gb基因組序列數(shù) 據(jù)，相當于43x水稻基因組(表2)。與野生型黃華占基因組序列比較顯示突變基因可能是第8 染色體上的0s08g03640等位基因，命名為OsRPLPO。
[0077] 表2水稻雄性不育突變體重測序數(shù)據(jù)
[0078]
[0079] 在野生型黃華占中該基因的編碼區(qū)全長960bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所 示。SEQ ID NO: 1所編碼的蛋白含319個氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。在不育 突變體中，該基因 cDNA第379個堿基C突變?yōu)門，導致基因編碼的氨基酸發(fā)生替換，由脯氨酸 Pro(CCC)突變?yōu)榻z氨酸Ser(TCC)。采用最新的SNP(單核苷酸多態(tài)性）研究工具HRM(High Resolution Melt，即高分辨率恪解)分析，進一步驗證所有的無花粉植株均攜帶純合突變 型位點，而可育植株攜帶純合野生型或雜合型位點（表3)。該位點為純和野生型的植株自交 后代全部可育，該位點為雜合型的植株自交后代表現(xiàn)不育:可育1:3分離。
[0080] 表3突變基因（0s08g03640)HRM分型結果
[0081]
[0082] OsRPLPO基因 cDNA編碼區(qū)在粳稻日本晴和野生型黃華占之間存在核苷酸序列多態(tài) 性（圖4)，與黃華占相比，具體為粳稻日本晴在該基因的核苷酸序列的第770位的A突變?yōu)镚， 并導致氨基酸發(fā)生替換，具體由谷氨酸(Glu)替換為甘氨酸(Gly);第819位的A突變?yōu)镚，氨 基酸無變化（圖5)，具體的在粳稻日本晴中，該基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示，其編 碼的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。進一步分析，該基因在秈稻品種9311和野生型黃華占 之間沒有多態(tài)性。
[0083]進一步進行互補實驗分析，發(fā)現(xiàn)轉入OsRPLPO基因的突變體植株均表現(xiàn)為可育。這 些分析進一步證明基因 OsRPLPO參與花粉發(fā)育調控，該基因突變導致水稻雄性不育。
[0084]實施例5、0sRPLP0基因在水稻各器官中的表達分析
[0085]根據(jù)OsRPLPO的cDNA序列設計引物，上游引物為F15 ' CCTGCTCGTGTTGGTCTTG 3 ' (SEQIDN0:24)，下游引物為R15'GGAGGAGCCCACCTTGTCA3'（SEQIDN0:25)，同時以水稻 Actin基因作為內參對照設計引物，上游引物為5'GCTATGTACGTCGCCATCCA'（SEQ ID N0: 26)，下游引物為5 ' GGACAGTGTGGCTGACACCAT '（SEQ ID NO: 27)。用黃華占水稻材料提取總 RNA并合成cDNA模板。采取實時定量PCR方法，分析OsRPLPO基因在水稻根、莖、葉、外稃、內 稃、穎片、雌蕊和幼穗穎花原基分化期（stage6)、幼穗花粉母細胞減數(shù)分裂時期（stage7)及 四分體形成階段（8七3868)、小孢子早期（8七3869)、小孢子中晚期（8七38610)及成熟花粉期 (stagel2)的表達譜，其結果如圖6所示，該基因在小孢子早期（stage9)特異表達且表達量 很高，在小孢子中晚期（stagelO)表達量開始降低，而在根、莖、葉、種子及其它幼穗發(fā)育時 期表達水平相對較低。該基因在突變體中幼穗花粉母細胞減數(shù)分裂時期(stage7)及四分體 形成階段(stage8)、小孢子早期（stage9)及小孢子中晚期（stagelO)的表達與野生型表達 水平較為一致，從小孢子中晚期（stagelO)開始至成熟花粉期（stage 12)突變體中OsRPLPO 表達水平較明顯高于野生型（圖7)。
【主權項】
1. 一種DNA序列，具有調控植物育性的功能，其特征在于，所述DNA序列選自下列組的序 列之一： a) 具有SEQ ID NO: 1、5或7所示的核苷酸序列； b) 在嚴格條件下能夠與(a)之任一所述序列的DNA雜交的DNA序列;或 c) 與(a)-(b)之任一所述序列互補的DNA序列。2. 權利要求1所述的DNA序列，其特征在于所述DNA序列編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2或6所示。3. -種表達盒，其特征在于所述表達盒包含權利要求1所述的DNA序列。4. 一種表達載體，其特征在于所述表達載體包含權利要求3所述的表達盒。5. -種工程菌，其特征在于所述工程菌含有權利要求4所述的表達載體。6. -種基因在植物育性調控中的應用，其特征在于，所述育性調控基因的核苷酸序列 選自下列組的序列之一： a) 具有SEQ ID NO: 1、5或7所示的核苷酸序列； b) 在嚴格條件下能夠與(a)之任一所述序列的DNA雜交的DNA序列;或 c) 與(a)-(b)之任一所述序列互補的DNA序列。7. 權利要求6所述的應用，其中所述的核苷酸序列其編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0:2 或6所示。8. 權利要求6或7所述的應用，其特征在于，通過突變育性調控基因 SEQ ID NO: 1、5、或7 獲得雄性不育材料。9. 權利要求8所述的應用，其中所述的突變包括在育性調控基因的核苷酸序列上進行 取代、插入或缺失一個或多個核苷酸。10. 權利要求6或7所述的應用，其特征在于用權利要求1所述的DNA序列恢復由相應的 SEQ ID NO: 1、5或7所示基因突變所導致的雄性不育，使雄性不育突變體恢復成可育。11. 一種突變體材料的應用，其特征在于所述突變材料是由核苷酸序列的突變所造成， 具有雄性不育的表現(xiàn)，其特征在于所述核苷酸序列如SEQ ID NO: 1、5或7所示。12. 權利要求11所述的應用，其中所述的突變可以是點突變，也可以是DNA缺失或插入 突變，也可以是通過RNAi、基因定點突變等基因沉默手段產生，所述基因定點突變的方法包 括但不限于ZFN定點突變方法、TALEN定點突變方法、和/或CRISPR/Cas9等定點突變方法。13. 權利要求11或12所述的應用，包括在育種中的應用。14. 權利要求13所述的應用，其中所述的育種是指將突變體植株作為不育系母本，與恢 復系雜交，生產雜交種子。15. -種方法，用于保持雄性不育植株的純合隱性狀態(tài)，所述方法包括： (a) 提供第一植株，其包含OsRPLPO基因的純合隱性等位基因，并且其是雄性不育的； (b) 向第一植株中引入下述構建體，形成第二植株，所述第二植株包含OsRPLPO基因的 純合隱性等位基因和所述構建體，且構建體在第二植株中為雜合狀態(tài)，所述構建體包含： i) 第一核苷酸序列，其包含OsRPLPO基因的核苷酸序列，當在第一植株中表達時其將恢 復雄性生育力； ii) 第二核苷酸序列，當其表達時，會抑制所述第二植株中可育雄性配子的形成或功 能，具體為花粉失活基因 ZM-PA;以及 (C)用所述第二植株的雄性配子使所述第一植株受精，以產生保持了所述第一植株純 合隱性狀態(tài)的后代。
【文檔編號】C12N15/29GK105886516SQ201610066392
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年1月29日
【發(fā)明人】魏寧, 陳浩東, 梁中成
【申請人】北京思創(chuàng)達科技有限公司