本發(fā)明涉及利用基因工程培養(yǎng)植物領(lǐng)域，具體涉及是一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高大豆含硫氨基酸含量及降低過敏原蛋白的方法。

背景技術(shù)：

大豆(Glycine max)屬于豆科、蝶形花亞科、大豆屬的二倍體(2n＝40)植物，既是重要的糧食和油料作物，也是植物蛋白、脂類、維生素和礦物質(zhì)等的天然資源。大豆種子中含有35％～50％的蛋白，是蛋白含量最豐富的糧食作物。雖然大豆蛋白含量豐富，含必需氨基酸的種類齊全，數(shù)量充足，比例合適，可以維持成年人健康，并可促進(jìn)兒童的正常生長發(fā)育，是完全蛋白質(zhì)，但含硫氨基酸含量偏低，是大豆蛋白的限制性氨基酸。因此大豆品質(zhì)育種的一個重要方向是提高大豆蛋白中含硫氨基酸的水平。

大豆貯藏蛋白按照其在蔗糖密度梯度離心中的沉淀系數(shù)可分為2S、7S、11S與15S等4種蛋白，其中大豆2S蛋白含量約為8％，主要成分是清蛋白，含硫氨基酸的含量十分豐富。運用傳統(tǒng)育種方法，包括化學(xué)突變育種和輻射育種，提高含硫氨基酸的水平并不非常明顯(蔡一榮等.大豆品質(zhì)改良的基因工程育種概況.大豆科學(xué),2006,25(1):62-66.)，與飼料蛋白工業(yè)生產(chǎn)需求相差甚遠(yuǎn)。因此，必需采用傳統(tǒng)和現(xiàn)代生物技術(shù)相結(jié)合的手段，才有可能取得突破。

另外，大豆還是眾多食物過敏源中的一種，其過敏蛋白主要有“Gly m Bd 60K”、“Gly m Bd 30K(P34)”和“Gly m Bd 28K”。隨機(jī)從361位有食物過敏史的人中選出86位進(jìn)行不同食品的過敏檢測，發(fā)現(xiàn)65.2％的人對大豆“Gly m Bd 30K”過敏，目前還沒有發(fā)現(xiàn)“Gly m Bd 30K”缺失的材料(關(guān)榮霞等.栽培大豆蛋白亞基11S/7S組成及過敏蛋白缺失分析.作物學(xué)報,2004,30(11):1076-1079.)，因此，培育“Gly m Bd 30K”含量低的大豆材料，也是育種研究中的一個重要方向。

因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員致力于開發(fā)一種含硫氨基酸含量提高，并且過敏原蛋白含量降低的轉(zhuǎn)基因大豆的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種含硫氨基酸含量提高，并且過敏原蛋白含量降低的轉(zhuǎn)基因大豆的方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種提高大豆含硫氨基酸含量及降低過敏原蛋白的方法，在一個優(yōu)選地具體實施方式中，其過表達(dá)大豆2S清蛋白，并抑制大豆P34蛋白的表達(dá)。

進(jìn)一步地，通過RNAi的方法抑制大豆Gly m Bd 30K(P34)蛋白的表達(dá)。

進(jìn)一步地，該方法包括步驟：

1)將大豆2S清蛋白的核苷酸序列構(gòu)建到植物表達(dá)載體上，并將P34蛋白的核苷酸序列片段正向及反向插入到上述植物表達(dá)載體上，獲得目的植物表達(dá)載體；

2)將步驟1)獲得的目的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，使用該根癌農(nóng)桿菌侵染大豆外植體，篩選獲得大豆含硫氨基酸含量提高及過敏原蛋白降低的大豆植株。

進(jìn)一步地，大豆2S清蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；P34蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

進(jìn)一步地，擴(kuò)增大豆2S清蛋白的核苷酸序列使用的引物如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。

進(jìn)一步地，擴(kuò)增P34蛋白的核苷酸序列片段正向插入片段的引物如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；擴(kuò)增P34蛋白的核苷酸序列片段反向向插入片段的引物如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示。

優(yōu)選地，植物表達(dá)載體為pCAMBIA3300；根癌農(nóng)桿菌為根癌農(nóng)桿菌LBA4404。

優(yōu)選地，轉(zhuǎn)化采用冷激的方法包括：將目的植物表達(dá)載體加入根癌農(nóng)桿菌的菌液中，混勻后于冰上防止30分鐘；將菌液放入液氮中2-5分鐘后，迅速放入37℃水浴中融化5分鐘；向菌液中加入不含抗生素的培養(yǎng)基復(fù)蘇；并在含有抗生素的平板上篩選陽性克隆。

優(yōu)選地，侵染包括：將大豆種子接種在添加BA的MSB5培養(yǎng)基中培養(yǎng)5～7天后，切除部分下胚軸，留3～5mm，去除1/3的子葉，在兩片子葉之間縱切，去除上胚軸，得到外植體；利用含有目的植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌侵染外植體。

本發(fā)明的另一方面還提供了一種轉(zhuǎn)基因大豆，其使用上述方法制備獲得，該轉(zhuǎn)基因大豆的含硫氨基酸含量提高，過敏原蛋白含量降低。

采用本發(fā)明的方法，將大豆2S清蛋白的基因和P34蛋白基因的RNAi通過植物表達(dá)載體導(dǎo)入大豆，對F1代植株進(jìn)行人工篩選，可獲得穩(wěn)定過表達(dá)大豆2S清蛋白和干擾P34蛋白基因表達(dá)的大豆植株，其含硫氨基酸含量提高，且過敏原蛋白P34顯著降低。其中，蛋氨酸含量提高了65％～86％，半胱氨酸含量提高了41％～58％。

本發(fā)明的方法，可大幅度提高大豆中含硫氨基酸的含量，降低過敏原P34蛋白含量，提高其作為營養(yǎng)保健食品的作用。同時該方法對于培育高含硫氨基酸的大豆具有重要意義。本發(fā)明獲得的穩(wěn)定大豆植株可以廣泛種植，提高大豆品質(zhì)節(jié)約大豆種植成本，并有利于滿足飼料工業(yè)中的蛋白要求。

以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明的構(gòu)思、具體步驟及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進(jìn)一步說明，以充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的一個較佳實施例的質(zhì)粒pCAMBIA3300-2S-P34i載體構(gòu)建示意圖。

圖2是本發(fā)明的一個較佳實施例的候選轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定圖；其中，M為DL2000 Marker；-為未轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的陰性對照；+為質(zhì)粒pCAMBIA3300-2S-P34i陽性對照；1-3泳道為3株候選轉(zhuǎn)基因植株，即轉(zhuǎn)化2S及P34RNAi基因的植株。

圖3是本發(fā)明的一個較佳實施例的含硫氨基酸含量數(shù)據(jù)統(tǒng)計圖；其中，williams82為非轉(zhuǎn)基因大豆對照；質(zhì)粒為轉(zhuǎn)化有空載pCAMBIA3300質(zhì)粒的大豆對照；2S+P34i-1、2S+P34i-2、2S+P34i-3為三株陽性轉(zhuǎn)基因植株；Met代表蛋氨酸；Cys代表半胱氨酸。

具體實施方式

材料：采用栽培品種williams82。

菌株和質(zhì)粒：E.coli DH5α，pMD18-T載體，質(zhì)粒載體pHANNIBAL，質(zhì)粒載體pCAMBIA3300，根癌農(nóng)桿菌LBA4404，均可直接購買獲得。

酶和化學(xué)試劑：Taq酶，T₄-DNA連接酶，限制性內(nèi)切酶XhoI、KpnI、EcoR I、SalI、HindIII及BamHI，一步RT-PCR試劑盒、DL2000 Marker購自Takara公司，植物DNA提取試劑盒，植物RNA提取試劑盒，瓊脂糖回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生物技術(shù)公司，PCR引物由生工生物技術(shù)公司合成。

分子生物學(xué)技術(shù)：除另有說明，所有分子生物學(xué)技術(shù)均按《分子克隆實驗指南(第二版)》(J.莎姆布魯克著，黃培堂譯，科學(xué)出版社)中提供的方法進(jìn)行。

實施例：

1.RNA的提取

大豆RNA利用植物RNA提取試劑盒從上部幼嫩葉片中提取，提取步驟嚴(yán)格按照植物RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。

2.2S清蛋白基因的克隆

該2S清蛋白基因的DNA序列如SEQ ID No.1所示。根據(jù)該序列設(shè)計擴(kuò)增用引物如下：

擴(kuò)增用引物的上游引物2S-F(SEQ ID No.2)

5’-GTCGACGGCACGAGAA ATGACCAAGCTTAC-3’(加SalI接頭)

擴(kuò)增用引物的下游引物2S-R(SEQ ID No.3)

5’-GGTACCGAAG GGAAAAACGA ACGGTATTCG-3’(加KpnI接頭)。

利用一步RT-PCR從提取獲得的RNA中擴(kuò)增帶有接頭的2S清蛋白基因。一步RT-PCR反應(yīng)體系為：

擴(kuò)增條件：反轉(zhuǎn)錄37℃15min；滅活反轉(zhuǎn)錄酶85℃5s；變性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min，35個循環(huán)后，72℃延伸10min。獲得的DNA片段于4℃保存。

經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，擴(kuò)增到了約700bp的DNA片段，與預(yù)期DNA擴(kuò)增片段長度相符。進(jìn)行割膠回收，PCR回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑取陽性克隆，利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA(pMD18-T-S2)，提取過程嚴(yán)格按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書進(jìn)行。然后將SalI和KpnI雙酶切及PCR鑒定后的陽性克隆測序。比對挑選序列一致的重組子作進(jìn)一步工作之用。

3.P34基因片段的克隆

該P34基因片段的DNA序列如SEQ ID No.4所示。根據(jù)該序列設(shè)計2對擴(kuò)增用引物如下：

擴(kuò)增用引物的上游引物P34-F1(SEQ ID No.5)

5’-CTCGAGCAAGAGTTCAGCAA AAAGTACTTGC-3’(加Xho I接頭)

擴(kuò)增用引物的下游引物P34-R1(SEQ ID No.6)

5’-GAATTCTCCATTGTAACAACCTTCGCTTTC-3’(加EcoR I接頭)

擴(kuò)增用引物的上游引物P34-F2(SEQ ID No.7)

5’-GGATCCCAAGAGTTCAGCAA AAAGTACTTGC-3’(加BamHI接頭)

擴(kuò)增用引物的下游引物P34-R2(SEQ ID No.8)

5’-AAGCTTCTCCATTGTAACAACCTTCGCTTTC-3’(加HindIII接頭)。

利用一步RT-PCR從提取獲得的RNA中擴(kuò)增帶有接頭的P34基因片段。一步RT-PCR反應(yīng)體系為：

分別利用引物對P34-F1和P34-R1、P34-F2和P34-R2進(jìn)行一步RT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：反轉(zhuǎn)錄37℃15min；滅活反轉(zhuǎn)錄酶85℃5s；變性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min，35個循環(huán)后，72℃延伸10min。獲得的DNA片段于4℃保存。

經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，用引物對P34-F1和P34-R1、P34-F2和P34-R2分別擴(kuò)增到了約300bp的DNA片段，與預(yù)期DNA擴(kuò)增片段長度相符。進(jìn)行割膠回收，PCR回收產(chǎn)物分別與pMD18-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑取陽性克隆，利用質(zhì)粒提取試劑盒提取兩種質(zhì)粒DNA(pMD18-T-P34-1，pMD18-T-P34-2)，提取過程嚴(yán)格按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書進(jìn)行。然后將Xho I和EcoR I雙酶切或BamHI和HindIII雙酶切及PCR鑒定后的陽性克隆測序。比對挑選序列一致的重組子作進(jìn)一步工作之用。

4.重組質(zhì)粒pCAMBIA3300-2S的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶SalI和Kpn對含有2S清蛋白基因的重組子pMD18-T-S2進(jìn)行雙酶切，回收約700bp的片段，并將此片段用T₄連接酶連接至經(jīng)過相同酶切的質(zhì)粒載體pCAMBIA3300上。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，并將經(jīng)過酶切鑒定的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，確定插入2S清蛋白基因的方向。將經(jīng)過測序鑒定且2S清蛋白基因正向插入的重組質(zhì)粒命名為pCAMBIA3300-2S。

5.重組質(zhì)粒pHANNIBAL-P34i的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pMD18-T-P34-1用限制性內(nèi)切酶Xho I和EcoR I進(jìn)行雙酶切，回收約300bp的小片段，將此片段用T4連接酶連接到相同酶切的質(zhì)粒載體pHANNIBAL上，進(jìn)行雙酶切鑒定，獲得中間質(zhì)粒pHANNIBAL-P34-1。

將重組質(zhì)粒pMD18-T-P34-2用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切，回收約300bp的小片段，將此片段用T4連接酶連接到相同酶切的中間質(zhì)粒pHANNIBAL-P34-1上，進(jìn)行雙酶切鑒定。

將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pHANNIBAL-P34i，該質(zhì)粒具有正向插入和反向插入的P34基因片段。

6.重組質(zhì)粒pCAMBIA3300-2S-P34i的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pCAMBIA3300-2S用限制性內(nèi)切酶Sac I和EstX I進(jìn)行酶切，回收約1500bp的片段，補平粘性末端。將該片段插入質(zhì)粒pCAMBIA3300中，獲得中間載體pCAMBIA3300-2S-1。

將重組質(zhì)粒pHANNIBAL-P34i用限制性內(nèi)切酶Ava I和PvuI進(jìn)行酶切，回收約1800bp的片段，補平粘性末端。將該片段插入到質(zhì)粒pCAMBIA3300-2S-1中。重組質(zhì)粒具有2S清蛋白基因和P34基因的正向插入和反向插入片段，將經(jīng)過鑒定的重組質(zhì)粒命名為pCAMBIA3300-2S-P34i，其構(gòu)建示意圖如圖1所示。

7.利用重組質(zhì)粒pCAMBIA3300-2S-P34i將其含有的2S清蛋白基因和P34RNAi基因?qū)氪蠖够蚪M。步驟如下：

①將上述制備的pCAMBIA3300-2S-P34i質(zhì)粒采取冷激的方法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404：每100μl菌液中加入5μl已純化的組質(zhì)粒pCAMBIA3300-2S-P34i，混勻后于冰上放置30min；將混有質(zhì)粒的菌液放入液氮中2-5min后，迅速投入37℃水浴中融化5min；向其中加入800μl不含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基(牛肉浸膏5g/L；酵母抽提物1g/L；蛋白胨5g/L；蔗糖5g/L；MgSO₄.7H₂O 5g/L，pH＝7.2)，并于28℃條件下180r/min震蕩培養(yǎng)3-5h，使菌體復(fù)蘇；離心濃縮菌液后，取100μl均勻涂布于含有鏈霉素50mg/l及卡那霉素25mg/L的YEB平板上。28℃倒置培養(yǎng)2-3d后，挑取其中的陽性克隆用于大豆外植體的侵染。

②大豆外植體的侵染及再生：將消毒大豆種子接種在添加6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)0.4mg L^-1的MSB5培養(yǎng)基(1×MS鹽+1×B5維生素)中培養(yǎng)5～7d后，用無菌刀片切除部分下胚軸，留3～5mm，去除1/3的子葉，在兩片子葉之間縱切，去除上胚軸，得到兩個外植體，將外植體放在菌液中(OD₆₀₀＝0.8)室溫侵染30min。

將侵染后的外植體轉(zhuǎn)到添加6-BA 1.0mg L^-1和IBA(3-吲哚丁酸)0.2mg L^-1的MSB5培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出芽，每隔14d更換新的相同培養(yǎng)基至叢生芽出現(xiàn)后轉(zhuǎn)入不添加激素的MSB5芽伸長培養(yǎng)基中，每隔14d轉(zhuǎn)入新的芽伸長培養(yǎng)基中，至芽伸長到3cm左右，轉(zhuǎn)入添加IBA 0.5mg L^-1的MSB5生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)至生出2～3條根，將瓶蓋打開煉苗2d，小心用鑷子取出小苗，溫水洗凈根部殘留瓊脂，然后栽于盛有滅菌的土:蛭石:沙子(1:1:1)均勻混合的塑料盆中，保持一定濕度，此時要適當(dāng)降低培養(yǎng)溫度，三周后移栽到溫室中。

8.轉(zhuǎn)基因大豆的鑒定

挑選3株再生大豆植株進(jìn)行鑒定，鑒定采取PCR方法測定外源基因在轉(zhuǎn)化再生植株中的存在，即利用引物bar-F(SEQ ID No.9)和bar-R(SEQ ID No.10)對bar基因進(jìn)行擴(kuò)增。其中，bar基因是pCAMBIA3300中自帶的篩選標(biāo)記。

提取再生大豆DNA為模版，PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示，轉(zhuǎn)基因大豆擴(kuò)增出與pCAMBIA3300-2S-P34i重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增片段相同的條帶，而沒轉(zhuǎn)化的大豆對照沒有擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。

9.轉(zhuǎn)基因大豆含硫氨基酸含量的測定

取上述三株陽性轉(zhuǎn)化株成熟籽粒作為實驗組，取未轉(zhuǎn)化的wiiliams 82成熟籽粒和轉(zhuǎn)化有空載pCAMBIA3300質(zhì)粒的植株的成熟籽粒作為對照組。取200mg上述種子，在2ml磷酸鹽的緩沖液中(含1mm PMSF和1μm亮抑酶肽)研成粉末，16,000g，4℃離心5min，上清透析去除水。取39mg蛋白，在真空條件下，用0.3ml 6N HCl 110℃水解22h，取4μg水解蛋白用HPLC分析。

HPLC的分析結(jié)果如圖3所示，未轉(zhuǎn)化的wiiliams 82成熟籽粒中，蛋氨酸的含量為0.51％，半胱氨酸的含量為0.66％；轉(zhuǎn)化有空載pCAMBIA3300質(zhì)粒的植株中，蛋氨酸的含量為0.53％，半胱氨酸的含量為0.63％；由此可知，空載質(zhì)粒不影響蛋氨酸和半胱氨酸的含量。挑取的三株轉(zhuǎn)基因大豆植株(2S+P34i-1、2S+P34i-2、2S+P34i-3)的成熟籽粒中，蛋氨酸和半胱氨酸的含量分別為0.84％和0.93％，0.92％、和0.98％，0.95％和1.04％。轉(zhuǎn)基因大豆植株成熟籽粒中蛋氨酸提高了65％～86％，半胱氨酸提高了41％～58％。

10.轉(zhuǎn)基因大豆過敏原P34蛋白含量的測定

通過定量PCR分析，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株P(guān)34基因mRNA的表達(dá)量相對于未轉(zhuǎn)化的植株，降低了95％以上。因此，P34蛋白的表達(dá)在轉(zhuǎn)基因植株中被顯著地抑制了。

以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)無需創(chuàng)造性勞動就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。

序列表

<110> 上海交通大學(xué)

<120> 一種提高大豆含硫氨基酸含量及降低過敏原蛋白的方法

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 698

<212> DNA

<213> 大豆（Glycine max）

<400> 1

ggcacgagaa atgaccaagc ttacaattct cctcatcgct cttctcttca tcgcccacac 60

ctgctgcgcc tccaaatggc aacagcacca gcaagagagc tgccgcgagc agctcaaggg 120

gatcaacctc aacccctgtg agcacatcat ggagaagatc caagctggcc gccgcggcga 180

ggacggcagc gacgaagatc acattctcat caggaccatg ccgggaagaa tcaactacat 240

caggaagaag gaaggaaaag aagaagaaga agaaggacac atgcagaagt gctgcagcga 300

aatgagcgag ctgaaaagcc ccatatgcca gtgcaaagcg ctacagaaga taatggataa 360

ccagagcgag caactggagg ggaaggagaa gaagcagatg gagagagagc tcatgaactt 420

ggctattagg tgcaggttgg gacccatgat agggtgcgac ttgtcctccg atgactgaaa 480

aaaaagtact actaacacat atatgtgtta gtttatgcta gctagaagaa cgtataagct 540

atctccgtat gttgtatatt aataaaaaga tcatcactgg tgaatggtga tcgtgtatgt 600

aacgtagtgg gcaatggaag cacttagagt gtgctttgtg gccttgccct ctgttttgat 660

aactgagact tttgcgaata ccgttcgttt ttcccttc 698

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2S-F

<400> 2

gtcgacggca cgagaaatga ccaagcttac 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2S-R

<400> 3

ggtaccgaag ggaaaaacga acggtattcg 30

<210> 4

<211> 1140

<212> DNA

<213> 大豆（Glycine max）

<400> 4

atgggtttcc ttgtgttgct tcttttctcc ctcttaggtc tctcttctag ttccagcata 60

tcaactcatc gttccatatt ggaccttgac ctaaccaagt ttaccacaca gaaacaggtg 120

tcttcactgt tccaactatg gaagagtgag catggacgtg tctaccataa ccacgaagaa 180

gaggcaaaga gacttgagat tttcaagaat aacttgaact atatcaggga catgaatgca 240

aacagaaaat caccccattc tcatcgttta ggattgaaca agtttgctga catcactcct 300

caagagttca gcaaaaagta cttgcaagct cccaaggatg tgtcgcagca aatcaaaatg 360

gccaacaaga aaatgaagaa ggaacaatat tcttgtgacc atccacctgc atcatgggat 420

tggaggaaaa aaggtgtcat cacccaagta aagtaccaag ggggctgtgg aagcggttgg 480

gcgttttctg ccacgggagc catagaagca gcacatgcaa tagcaacagg agaccttgtt 540

agcctttctg aacaagaact cgtagactgt gtggaagaaa gcgaaggttg ttacaatgga 600

tggcactatc aatcgttcga atgggtttta gaacatggtg ggattgccac tgatgatgat 660

tatccttaca gagctaaaga gggtagatgc aaagccaata agatacaaga caaggttaca 720

attgacggat atgaaactct aataatgtca gatgagagta cagaatcaga gacagagcaa 780

gcgttcttaa gcgccatcct tgagcaacca attagtgtct ccattgatgc aaaagatttt 840

catttataca ccgggggaat ttatgatgga gaaaactgta caagtccgta tgggattaat 900

cactttgttt tacttgtggg ttatggttca gcggatggtg tagattactg gatagcgaaa 960

aattcatggg gagaagattg gggagaagat ggttacattt ggatccaaag aaacacgggt 1020

aatttattag gagtgtgtgg gatgaattat ttcgcttcat acccaaccaa agaggaatca 1080

gaaacactgg tgtctgctcg cgttaaaggt catcgaagag ttgatcactc tcctctttga 1140

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P34-F1

<400> 5

ctcgagcaag agttcagcaa aaagtacttg c 31

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P34-R1

<400> 6

gaattctcca ttgtaacaac cttcgctttc 30

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P34-F2

<400> 7

ggatcccaag agttcagcaa aaagtacttg c 31

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P34-R2

<400> 8

aagcttctcc attgtaacaa ccttcgcttt c 31

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> bar-F

<400> 9

tcgagtcaaa tctcggtgac gggca 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> bar-R

<400> 10

ctcgagtcta ccatgagccc agaac 25