本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種微生物混合發(fā)酵制備黃姜皂苷的方法。

背景技術(shù)：

黃姜(Dioscorea zingiberensis C.H.Wright)學(xué)名盾葉薯蕷，又稱火頭根，多年生纏繞草本植物，為我國特有的野生植物資源，主要分布于湖南、陜西、四川、貴州及云南等省。黃姜的根狀莖含薯蕷皂苷等甾體皂苷類成分、40％左右的淀粉、50％的纖維素以及一些水溶性苷類、生物堿類、黃酮苷類、強心苷類、單寧、色素等化學(xué)成分。黃姜的主要有效成分是薯蕷皂苷元，也稱皂素(以下均稱皂素)。皂素是黃姜皂苷的配基，在黃姜中主要以皂苷的形式存在。以黃姜皂素合成的甾體激素中間體及皮質(zhì)激素、性激素、蛋白同化激素等產(chǎn)品為主的數(shù)百種國計民生特需的藥物，被譽為“藥用黃金”。甾體激素類藥物已迅速發(fā)展為僅次于抗生素的第二大類藥物。

盾葉薯蕷植物中的淀粉、蛋白質(zhì)、果膠等成分對甾體皂苷具有一定的包裹作用，而甾體皂苷又通過糖苷鍵與植物纖維相連。因而簡單的酸水解方法收率低，很難將植物中的薯蕷皂素提取完全，僅能提取其中的1/4。

專利CN1515585A公開了一種環(huán)保無污染生產(chǎn)薯蕷皂素的方法，但其中過篩分離40％的纖維素部分會帶走一些與纖維素結(jié)合的皂苷，從而降低了皂素的得率。專利CN1970785A公開了一種薯蕷皂素清潔生產(chǎn)及綜合利用的方法，將黃姜原料粉碎后直接進行溶劑提取，與黃姜木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)共價偶聯(lián)的結(jié)合態(tài)皂苷無法獲得，皂素得率存在提升空間。專利CN1821380A公開了一種處理黃姜的高效復(fù)合微生物菌群，其使用的微生物菌群涵蓋細菌、霉菌、酵母菌等多種復(fù)合微生物，但存在問題是真菌生長時間較長，且細菌與真菌在生長過程中存在拮抗作用，大多數(shù)微生物在對黃姜木質(zhì)纖維素處理過程中，存在分階段生長的情況，與自然發(fā)酵過程一樣存在不可控性，且微生物對皂苷元母核可能會有降解與轉(zhuǎn)化作用，從而降低皂素得率。

綜上所述，傳統(tǒng)的酸水解法提取黃姜皂素由于皂苷的轉(zhuǎn)化不是專一性的，是同時水解各種物質(zhì)，包括木質(zhì)纖維素，淀粉，蛋白等等，用酸量大，因此，效率低、能耗大，且需要高溫處理；現(xiàn)有技術(shù)大多利用微生物自然發(fā)酵處理黃姜，而自然發(fā)酵的微生物不可控，因而可能會摻雜一些可以降解皂素母核的微生物，使得皂素產(chǎn)量大幅下降。

因此，最大限度提高黃姜皂素收率，降低黃姜皂素生產(chǎn)成本則是現(xiàn)有生產(chǎn)工藝面臨的突出問題，通過創(chuàng)新微生物方法促進黃姜皂苷的大量游離，尤其是黃姜中束縛皂苷的游離極為重要，所以，研發(fā)新的綠色生產(chǎn)工藝并進行產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用刻不容緩。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷或改進需求，本發(fā)明提供了一種芽孢桿菌、微生物菌群及其混合發(fā)酵制備黃姜皂苷的方法，其目的在于通過選擇合適的微生物菌種，制備得到微生物菌群，使得在黃姜發(fā)酵時該微生物菌群能夠先后分泌高活性木質(zhì)纖維素降解酶、淀粉酶和糖基轉(zhuǎn)移酶等，協(xié)同促進黃姜皂苷的游離，且提高皂苷在水相中的溶解度，從而提高最終皂素的得率，由此解決現(xiàn)有技術(shù)黃姜皂素收率低的突出問題，為下一階段的微生物高效轉(zhuǎn)化皂苷生產(chǎn)皂素奠定了堅實基礎(chǔ)。

為實現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個方面，提供了一種芽孢桿菌，分類命名為Bacillus sp.HG224，所述芽孢桿菌于2016年12月30日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，其保藏編號為CCTCC M2016791。

按照本發(fā)明的另一個方面，提供了一種黃姜發(fā)酵的微生物菌群，所述微生物菌群包括芽孢桿菌HG224和至少一種果膠桿菌，所述果膠桿菌能夠用歐文氏菌代替。

優(yōu)選地，所述果膠桿菌為胡蘿卜果膠桿菌，其拉丁文名學(xué)名為Pectobacterium carotovorum。

優(yōu)選地，所述歐文氏菌為解淀粉歐文氏菌，其拉丁文學(xué)名為Erwinia amylovora。

優(yōu)選地，所述微生物菌群還包括至少一種纖維單胞菌。

優(yōu)選地，所述纖維單胞菌為產(chǎn)黃纖維單胞菌，其拉丁文學(xué)名為Cellulomonas flavigena。

優(yōu)選地，所述微生物菌群中所述芽孢桿菌HG224、果膠桿菌和纖維單胞菌均處于對數(shù)生長期，所述處于對數(shù)生長期的芽孢桿菌HG224、果膠桿菌和纖維單胞菌的菌液體積比為1:0.4～1.2:0～1.2，所述果膠桿菌能夠用歐文氏菌代替。

優(yōu)選地，所述微生物菌群用于分泌木質(zhì)纖維素降解酶、淀粉酶和糖基轉(zhuǎn)移酶。

優(yōu)選地，所述木質(zhì)纖維素降解酶為纖維素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、果膠酶或木質(zhì)素降解酶。

優(yōu)選地，所述微生物菌群在黃姜發(fā)酵時用于分泌200～820U/ml的淀粉酶、120～450U/ml的β-葡萄糖苷酶、120～410U/ml的木聚糖酶、130～370U/ml的甘露聚糖酶和110～390U/ml的果膠酶、158～430U/ml的糖基轉(zhuǎn)移酶以及205～890U/ml的纖維素酶。

按照本發(fā)明的另一個方面，提供了一種所述的微生物菌群的制備方法，包括如下步驟：取所述芽孢桿菌HG224、果膠桿菌和纖維單胞菌的菌株的單菌落分別接種于所述LB培養(yǎng)基中，在溫度為30～40℃，轉(zhuǎn)速為100～220r/min條件下培養(yǎng)菌株至對數(shù)生長期，分別獲得所述芽孢桿菌HG224、果膠桿菌和纖維單胞菌的處于對數(shù)生長期的菌液，將所述菌液按照體積比例1:0.4～1.2:0～1.2混合制成所述微生物菌群，所述果膠桿菌能夠用歐文氏菌代替。

按照本發(fā)明的另一個方面，提供了一種所述的微生物菌群的應(yīng)用，應(yīng)用于黃姜發(fā)酵。

優(yōu)選地，所述的微生物菌群應(yīng)用于黃姜發(fā)酵時包括如下步驟：按照黃姜干重與水的質(zhì)量比為1:5～1:15配制成均勻漿液，在漿液中接種體積百分數(shù)為10％～40％的所述的微生物菌群，進行微生物菌群混合發(fā)酵培養(yǎng)，得到含有黃姜皂苷的發(fā)酵液。

優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為：在溫度為30～40℃、轉(zhuǎn)速為100～220r/min條件下培養(yǎng)4～24h。

優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)時間為4～6h。

總體而言，通過本發(fā)明的上述技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，能夠取得下列有益效果。

1、本發(fā)明提供了一種芽孢桿菌HG224，并提供了一種包含該芽孢桿菌的用于黃姜發(fā)酵的微生物菌群，采用該微生物菌群發(fā)酵處理黃姜原料時，其能夠分泌木質(zhì)纖維素降解酶系、淀粉酶和糖基轉(zhuǎn)移酶且酶活活力很高，使木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)松散，并使束縛的皂苷釋放出來，使存在于黃姜組織細胞中被木質(zhì)纖維素、果膠、淀粉等包裹的皂苷充分游離，通過發(fā)酵時間控制，使得淀粉轉(zhuǎn)化為低聚糖或寡糖，解除淀粉的包裹作用而不影響葡萄糖含量。

2、微生物轉(zhuǎn)化皂苷時由于大量皂苷的水不溶的狀態(tài)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率較低，采用本發(fā)明所述的微生物菌群發(fā)酵黃姜后，由于大量束縛的水溶性皂苷的釋放并存在于水相中，為后續(xù)轉(zhuǎn)化皂苷的微生物進行高效轉(zhuǎn)化生產(chǎn)皂素奠定了堅實基礎(chǔ)。

3、本發(fā)明提供的微生物菌群的制備方法及其在黃姜發(fā)酵中的應(yīng)用，促進大量束縛的皂苷游離，使得后續(xù)皂素生產(chǎn)得率高，工藝綠色環(huán)保、無污染、成本低，產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景廣闊。

4、本發(fā)明的微生物菌群應(yīng)用于黃姜發(fā)酵促進黃姜皂苷釋放和溶解時，由于其中不同菌種的協(xié)同作用，與不添加微生物或僅添加單一微生物相比，皂苷得率大大提高。

附圖說明

圖1是Bacillus sp.HG224發(fā)酵黃姜時β-葡萄糖苷酶的酶活動態(tài)監(jiān)測曲線；

圖2是Bacillus sp.HG224發(fā)酵黃姜時淀粉酶的酶活動態(tài)監(jiān)測曲線；

圖3是Bacillus sp.HG224發(fā)酵黃姜時木聚糖酶的酶活動態(tài)監(jiān)測曲線；

圖4是Bacillus sp.HG224發(fā)酵黃姜時甘露聚糖酶的酶活動態(tài)監(jiān)測曲線；

圖5是Bacillus sp.HG224發(fā)酵黃姜時果膠酶的酶活動態(tài)監(jiān)測曲線；

圖6是Bacillus sp.HG224發(fā)酵黃姜時糖基轉(zhuǎn)移酶的酶活動態(tài)監(jiān)測曲線；

圖7是芽孢桿菌Bacillus sp.HG224依據(jù)16S rDNA序列采用N-j法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個實施方式中所涉及到的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。

本發(fā)明提供的一種芽孢桿菌，其分類命名為Bacillus sp.HG224，其于2016年12月30日保藏于中國武漢，中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，其保藏編號為CCTCC M2016791，其拉丁文學(xué)名為Bacillus sp.。

圖7為芽孢桿菌HG224依據(jù)16S rDNA序列采用N-j法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹。菌株芽孢桿菌HG224依據(jù)其16S rDNA序列采用Neighbour-joining法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹，跟菌株枯草芽孢桿菌M6K在系統(tǒng)進化樹上聚為同一簇群，因而將其歸為芽孢桿菌屬菌株。

本發(fā)明提供的用于黃姜發(fā)酵的微生物菌群，包括芽孢桿菌HG224和至少一種果膠桿菌，其中果膠桿菌能夠用歐文氏菌代替。該微生物菌群還可以包括至少一種纖維單胞菌。

其中果膠桿菌優(yōu)選為胡蘿卜果膠桿菌Pectobacterium carotovorum，歐文氏菌優(yōu)選為解淀粉歐文氏菌Erwinia amylovora，纖維單胞菌優(yōu)選為產(chǎn)黃纖維單胞菌Cellulomonas flavigena，這三種菌均沒有特定的菌株限定。

芽孢桿菌HG224、果膠桿菌和纖維單胞菌均處于對數(shù)生長期，該微生物菌群應(yīng)用與黃姜發(fā)酵時按照菌液體積比為1:0.4～1.2:0～1.2進行接種，其中果膠桿菌能夠用歐文氏菌代替。

該微生物菌群發(fā)酵黃姜時用于分泌木質(zhì)纖維素降解酶、淀粉酶和糖基轉(zhuǎn)移酶，其中木質(zhì)纖維素降解酶為纖維素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、果膠酶或木質(zhì)素降解酶。

該微生物菌群在黃姜發(fā)酵時能夠分泌200～820U/ml的淀粉酶、120～450U/ml的β-葡萄糖苷酶、120～410U/ml的木聚糖酶、130～370U/ml的甘露聚糖酶和110～390U/ml的果膠酶、158～430U/ml的糖基轉(zhuǎn)移酶以及205～890U/ml的纖維素酶。

該微生物菌群的制備方法，包括如下步驟：取所述芽孢桿菌HG224、果膠桿菌和纖維單胞菌的菌株的單菌落分別接種于所述LB培養(yǎng)基中，在溫度為30～40℃，轉(zhuǎn)速為100～220r/min條件下，分別獲得所述芽孢桿菌HG224、果膠桿菌和纖維單胞菌的處于對數(shù)生長期的菌液，將所述菌液按照體積比例1:0.4～1.2:0～1.2混合制成所述微生物菌群，所述果膠桿菌能夠用歐文氏菌代替。

微生物菌群應(yīng)用于黃姜發(fā)酵時包括如下步驟：按照黃姜干重與水的質(zhì)量比為1:5～1:15配制成均勻漿液，在漿液中接種體積百分數(shù)為10％～40％的上述的微生物菌群，在溫度為30～40℃、轉(zhuǎn)速為100～220r/min條件下培養(yǎng)4～24h，優(yōu)選4～6h，進行微生物菌群混合發(fā)酵培養(yǎng)，得到含有黃姜皂苷的發(fā)酵液。將發(fā)酵液經(jīng)固液分離菌體后，得到含黃姜皂苷的清液，取樣分析其中的皂苷含量(加酸水解，將水解物水洗脫酸，后進行溶劑提取檢測提取液中的皂素含量來表征皂苷含量)，然后通過多級膜過濾進一步得到含大量黃姜皂苷的濃縮液，或者將上述清液直接進行微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)黃姜皂素。

本發(fā)明的微生物菌群應(yīng)用于黃姜發(fā)酵時，各種酶在黃姜發(fā)酵促溶皂苷過程中起到的作用分析如下：

纖維素酶：纖維素酶能有效降解黃姜材料中的纖維素結(jié)構(gòu)，而纖維素是葡萄糖殘基以β-1,4-糖苷鍵高度聚合形成的多糖類物質(zhì)，不同糖鏈之間又通過氫鍵、范德華力等等緊密連接，導(dǎo)致了對皂苷的束縛作用，因而纖維素酶能有效的促進皂苷的釋放。

淀粉酶：淀粉酶主要將淀粉降解為低聚的葡聚糖或寡糖，因而可以有效的解除淀粉對黃姜皂苷的包裹，同時由于發(fā)酵時間的控制微生物又未能及時將淀粉降解為葡萄糖后被自己所利用，黃姜糖液的葡萄糖濃度保持相對恒定，從而有效保障了接下來對糖液的綜合利用。

木聚糖酶、甘露聚糖酶和果膠酶：由于黃姜木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，微生物在發(fā)酵過程中接觸到的底物處于不斷變化的過程中，微生物在發(fā)酵過程中分泌的木聚糖酶、甘露聚糖酶、果膠酶屬于協(xié)同作用酶，如果缺少這些酶，微生物將不能接觸到相關(guān)底物，其他降解酶將不會被微生物所分泌，因而極大影響了微生物發(fā)酵促進黃姜皂苷游離的效果。

糖基轉(zhuǎn)移酶：微生物在發(fā)酵過程中，隨著大量黃姜皂苷的游離，促使微生物分泌糖基轉(zhuǎn)移酶將單糖重新連接到水不溶的皂苷上，有效提高皂苷在水相中的溶解度。

單一菌株芽孢桿菌HG224的纖維素酶的酶活很低，由于半纖維素、木質(zhì)素的包裹，導(dǎo)致微生物未能接觸到纖維素結(jié)構(gòu)，從而幾乎不分泌纖維素酶；單一菌株分泌的木聚糖酶、甘露聚糖酶和果膠酶酶活水平很低，影響整體降解效率，發(fā)酵促進黃姜皂苷游離的效果很有限。

而兩種微生物(芽孢桿菌HG224和一種果膠桿菌，或芽孢桿菌HG224和一種歐文氏菌)的混合使得該菌群微生物之間能夠分工合作，既避免了不同種微生物對有限底物的競爭作用，也提高了不同底物的降解效率，同時分泌高酶活性的以上各種酶，各種酶之間的協(xié)同作用更明顯，快速釋放被束縛的黃姜皂苷。

三種微生物(芽孢桿菌HG224、一種歐文氏菌或果膠桿菌、一種纖維單胞菌)的混合由于酶系的豐富程度極大提高，各種酶之間的協(xié)同作用更明顯，可以獲得更高的皂苷含量。但是該菌群在促進皂苷游離的同時也會產(chǎn)生繼續(xù)水解皂苷導(dǎo)致皂苷水溶性下降的副作用，使得游離皂苷再次沉淀并與固形物混雜在一起，使得工藝過程復(fù)雜化，并消耗更多的有機溶劑，因此三種微生物的混合菌群需要精準的發(fā)酵調(diào)控才可以達到應(yīng)有的性能，最大程度地促進皂苷的游離。

以下為實施例：

實施例1和2為不添加任何微生物的情況下的空白對比試驗，實施例3為單一菌種發(fā)酵黃姜的對比試驗，實施例4～5為本發(fā)明的兩種微生物菌群(芽孢桿菌HG224和一種果膠桿菌，或芽孢桿菌HG224和一種歐文氏菌)的制備以及應(yīng)用于黃姜發(fā)酵的實施例，實施例6～8采用三種微生物(芽孢桿菌HG224、一種果膠桿菌或歐文氏菌、一種纖維單胞菌)的制備以及應(yīng)用于發(fā)酵黃姜的實施例。除實施例1和2以外，每個實施例均監(jiān)測了黃姜發(fā)酵過程中各微生物酶活變化曲線，分析測試了黃姜發(fā)酵清液中包含的皂苷含量占總皂苷含量的百分比，其中總皂苷含量是通過將等量黃姜材料直接酸解獲得的皂素含量換算得到。

實施例1

不添加任何微生物的情況下，具體操作步驟如下：

取黃姜鮮姜500g，洗凈去須后加水粉碎勻漿，按照黃姜干重與水的質(zhì)量比為1:5配制成均勻漿液，在37℃，轉(zhuǎn)速為200r/min條件下處理4h后得到的黃姜漿液，其液相中包含的皂苷含量(按照皂素母核含量來計算)占總皂苷含量的29％(總皂苷含量通過將等量黃姜材料直接酸解獲得的皂素含量換算)。

實施例2

不添加任何微生物的情況下，具體操作步驟如下：

取黃姜鮮姜500g，洗凈去須后加水粉碎勻漿，按照黃姜干重與水的質(zhì)量比為1:15配制成均勻漿液，在37℃，轉(zhuǎn)速為200r/min條件下處理4h后得到的黃姜漿液，其液相中包含的皂苷含量(按照皂素母核含量來計算)占總皂苷含量的42％。

實施例3

一種黃姜發(fā)酵的微生物菌株，按照如下制備方法制備：

取Bacillus sp.HG224菌株的單菌落接種于LB培養(yǎng)基中，在37℃150r/min條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)至菌株處于對數(shù)生長期后收獲得到擴大菌液。

將該微生物菌株應(yīng)用于黃姜發(fā)酵時，具體操作步驟如下：

(1)黃姜預(yù)處理：

取黃姜鮮姜500g，洗凈去須后加水粉碎勻漿，按照黃姜干重與水的質(zhì)量比為1:10配制成均勻漿液；

(2)黃姜發(fā)酵

在漿液中接種20％(v/v)的微生物菌群，在29℃轉(zhuǎn)速為200r/min條件下培養(yǎng)0.5h，36℃轉(zhuǎn)速為200r/min條件下培養(yǎng)3.5h，得到黃姜發(fā)酵液。

圖1～圖6為采用Bacillus sp.HG224應(yīng)用于黃姜發(fā)酵時各微生物酶活動態(tài)監(jiān)測曲線。從圖中可以看出：

1、單菌的纖維素酶的酶活很低，由于半纖維素、木質(zhì)素的包裹，導(dǎo)致微生物未能接觸到纖維素結(jié)構(gòu)，從而幾乎不分泌纖維素酶。

2、β-葡萄糖苷酶的酶活較高，如圖1所示，為150～230U。

3、淀粉酶的酶活較高，如圖2所示，400～550U，淀粉酶主要將淀粉降解為低聚的葡聚糖或寡糖，因而可以有效的解除淀粉對黃姜皂苷的包裹，同時由于發(fā)酵時間的控制微生物又未能及時將淀粉降解為葡萄糖后被自己所利用，黃姜糖液的葡萄糖濃度保持相對恒定，從而有效保障了接下來對糖液的綜合利用。

4、木聚糖酶的酶活(圖3)，10～30U；甘露聚糖酶的酶活(圖4)，60～80U；果膠酶的酶活(圖5)，12～32U。

由于黃姜木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，微生物在發(fā)酵過程中接觸到的底物處于不斷變化的過程中，微生物在發(fā)酵過程中分泌的這些酶屬于協(xié)同作用酶，雖然酶活處于較低水平，但是這些酶是必不可少的，如果缺少這些酶，微生物將不能接觸到相關(guān)底物，其他降解酶將不會被微生物所分泌，因而極大影響了微生物發(fā)酵促進黃姜皂苷游離的效果，但同時可以看到這些酶的酶活水平較低，影響整體降解效率，單一菌株具備一定的降解能力，但效果有限。

5、糖基轉(zhuǎn)移酶的酶活為50～380U(圖6)。微生物在發(fā)酵過程中，隨著大量黃姜皂苷的游離，促使微生物分泌糖基轉(zhuǎn)移酶將單糖重新連接到水不溶的皂苷上，有效提高皂苷在水相中的溶解度。

本實施例得到的黃姜發(fā)酵液液相中包含的皂苷含量(按照皂素母核含量來計算)只占總皂苷含量的62％，單一微生物在黃姜發(fā)酵、促進其中皂苷游離、提高皂苷在水相中的溶解度的能力很有限。

實施例4

一種用于黃姜發(fā)酵的微生物菌群，按照如下制備方法制備：

取Bacillus sp.HG224和Pectobacterium carotovorum菌株的單菌落分別接種于LB培養(yǎng)基中，在30℃，100r/min條件下培養(yǎng)，分別培養(yǎng)至各菌株處于對數(shù)生長期后收獲得到擴大菌液，按照菌液體積比混合制成微生物菌群混合液，比例如下：Bacillus sp.50％和Pectobacterium carotovorum 50％。

將微生物菌群混合液應(yīng)用于黃姜發(fā)酵時，具體操作步驟如下：

(1)黃姜預(yù)處理：

取黃姜鮮姜1000g，洗凈去須后加水粉碎勻漿，按照黃姜干重與水的質(zhì)量比為1:5配制成均勻漿液；

(2)黃姜發(fā)酵

在漿液中接種10％(v/v)的上述微生物菌群混合液，在30℃轉(zhuǎn)速為100r/min條件下培養(yǎng)4h進行發(fā)酵培養(yǎng)，得到黃姜發(fā)酵液，液相中包含的皂苷含量(按照皂素母核含量來計算)占總皂苷含量的70％。

混合微生物菌群中的不同微生物能同時利用不同的底物，從而快速釋放被包裹及共價結(jié)合的黃姜皂苷。

實施例5

一種用于黃姜發(fā)酵的微生物菌群，按照如下制備方法制備：

取Bacillus sp.HG224和Erwinia amylovora菌株的單菌落分別接種于LB培養(yǎng)基中，在30℃，100r/min條件下培養(yǎng)，分別培養(yǎng)至各菌株處于對數(shù)生長期后收獲得到擴大菌液，按照菌液體積比混合制成微生物菌群混合液，體積比例如下：Bacillus sp.70％和Erwinia amylovora 30％。

將微生物菌群混合液應(yīng)用于黃姜發(fā)酵時，具體操作步驟如下：

(1)黃姜預(yù)處理：

取黃姜鮮姜1000g，洗凈去須后加水粉碎勻漿，按照黃姜干重與水的質(zhì)量比為1:5配制成均勻漿液；

(2)黃姜發(fā)酵

在漿液中接種10％(v/v)的上述微生物菌群混合液，在30℃轉(zhuǎn)速為100r/min條件下培養(yǎng)4h進行發(fā)酵培養(yǎng)，得到黃姜發(fā)酵液，液相中包含的皂苷含量(按照皂素母核含量來計算)占總皂苷含量的74％。

混合微生物菌群中的不同微生物能同時利用不同的底物，從而快速釋放被包裹及共價結(jié)合的黃姜皂苷。

實施例6

一種用于黃姜發(fā)酵的微生物菌群，按照如下制備方法制備：

取Bacillus sp.HG224、Erwinia amylovora和Cellulomonas flavigena菌株的單菌落分別接種于LB培養(yǎng)基中，在37℃，200r/min條件下培養(yǎng)，分別培養(yǎng)至各菌株處于對數(shù)生長期后收獲得到擴大菌液，按照菌液體積比混合制成微生物菌群混合液，體積比例如下：Bacillus sp.35％、Erwinia amylovora 40％和Cellulomonas flavigena 25％。

將微生物菌群應(yīng)用于黃姜發(fā)酵時，具體操作步驟如下：

(1)黃姜預(yù)處理：

取黃姜鮮姜800g，洗凈去須后加水粉碎勻漿，按照黃姜干重與水的質(zhì)量比為1:12配制成均勻漿液；

(2)黃姜發(fā)酵

在漿液中接種30％(v/v)的微生物菌群混合液，在37℃轉(zhuǎn)速為210r/min條件下培養(yǎng)5h進行發(fā)酵培養(yǎng)，得到黃姜發(fā)酵液，液相中包含的皂苷含量(按照皂素母核含量來計算)占總皂苷含量的83％；

實施例7

一種用于黃姜發(fā)酵的微生物菌群，按照如下制備方法制備：

取Bacillus sp.HG224、Erwinia amylovora和Cellulomonas flavigena菌株的單菌落分別接種于LB培養(yǎng)基中，在30℃，100r/min條件下培養(yǎng)，分別培養(yǎng)至各菌株處于對數(shù)生長期后收獲得到擴大菌液，按照菌液體積比混合制成微生物菌群混合液，體積比例如下：Bacillus sp.40％、Erwinia amylovora 25％和Cellulomonas flavigena 35％。

將微生物菌群應(yīng)用于黃姜發(fā)酵時，具體操作步驟如下：

(1)黃姜預(yù)處理：

取黃姜鮮姜1500g，洗凈去須后加水粉碎勻漿，按照黃姜干重與水的質(zhì)量比為1:5配制成均勻漿液；

(2)黃姜發(fā)酵

在漿液中接種10％(v/v)的微生物菌群混合液，在30℃轉(zhuǎn)速為100r/min條件下培養(yǎng)4h進行發(fā)酵培養(yǎng)，得到黃姜發(fā)酵液，液相中包含的皂苷含量(按照皂素母核含量來計算)占總皂苷含量的73％；

實施例8

一種用于黃姜發(fā)酵的微生物菌群，按照如下制備方法制備：

取Bacillus sp.HG224、Erwinia amylovora和Cellulomonas flavigena菌株的單菌落分別接種于LB培養(yǎng)基中，在40℃，220r/min條件下培養(yǎng)，分別培養(yǎng)至各菌株處于對數(shù)生長期后收獲得到擴大菌液，按照菌液體積比混合制成微生物菌群混合液，體積比例如下：Bacillus sp.30％、Erwinia amylovora 35％和Cellulomonas flavigena 35％。

將微生物菌群應(yīng)用于黃姜發(fā)酵時，具體操作步驟如下：

(1)黃姜預(yù)處理：

取黃姜鮮姜1800g，洗凈去須后加水粉碎勻漿，按照黃姜干重與水的質(zhì)量比為1:15配制成均勻漿液；

(2)黃姜發(fā)酵

在漿液中接種40％(v/v)的微生物菌群混合液，在40℃轉(zhuǎn)速為220r/min條件下培養(yǎng)6h進行發(fā)酵培養(yǎng)，得到黃姜發(fā)酵液，液相中包含的皂苷含量(按照皂素母核含量來計算)占總皂苷含量的85％。

實施例9

一種用于黃姜發(fā)酵的微生物菌群，按照如下制備方法制備：

取Bacillus sp.HG224、Erwinia amylovora和Cellulomonas flavigena菌株的單菌落分別接種于LB培養(yǎng)基中，在30℃，100r/min條件下培養(yǎng)，分別培養(yǎng)至各菌株處于對數(shù)生長期后收獲，再經(jīng)過兩次放大得到擴大菌液，按照菌液體積比混合制成微生物菌群混合液，體積比例如下：Bacillus sp.40％、Erwinia amylovora 25％和Cellulomonas flavigena 35％。

將微生物菌群應(yīng)用于黃姜發(fā)酵時，具體操作步驟如下：

(1)黃姜預(yù)處理：

取黃姜鮮姜若干(干重1750kg)，洗凈去須后加水粉碎勻漿，按照黃姜干重與水的質(zhì)量比為1:5配制成均勻漿液；

(2)黃姜發(fā)酵

在漿液中接種10％(v/v)的微生物菌群混合液，在30℃轉(zhuǎn)速為100r/min條件下培養(yǎng)4h進行發(fā)酵培養(yǎng)，得到黃姜發(fā)酵液，液相中包含的皂苷含量(按照皂素母核含量來計算)占總皂苷含量的76％；

實施例10

一種用于黃姜發(fā)酵的微生物菌群，按照如下制備方法制備：

取Bacillus sp.HG224、Erwinia amylovora和Cellulomonas flavigena菌株的單菌落分別接種于LB培養(yǎng)基中，在40℃，220r/min條件下培養(yǎng)，分別培養(yǎng)至各菌株處于對數(shù)生長期后，再經(jīng)過兩次放大得到擴大菌液，按照菌液體積比混合制成微生物菌群混合液，體積比例如下：Bacillus sp.30％、Erwinia amylovora 35％和Cellulomonas flavigena 35％。

將微生物菌群應(yīng)用于黃姜發(fā)酵時，具體操作步驟如下：

(1)黃姜預(yù)處理：

取黃姜鮮姜若干(干重2250kg)，洗凈去須后加水粉碎勻漿，按照黃姜干重與水的質(zhì)量比為1:15配制成均勻漿液；

(2)黃姜發(fā)酵

在漿液中接種40％(v/v)的微生物菌群混合液，在40℃轉(zhuǎn)速為220r/min條件下培養(yǎng)6h進行發(fā)酵培養(yǎng)，得到黃姜發(fā)酵液，液相中包含的皂苷含量(按照皂素母核含量來計算)占總皂苷含量的86％。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。