本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種可用于進(jìn)行蛋白表達(dá)的原始菌株--枯草芽孢桿菌Z12及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：蛋白表達(dá)技術(shù)是現(xiàn)代生物學(xué)的核心技術(shù)之一，表達(dá)蛋白不僅可用于生物學(xué)研究，也可以提供商業(yè)化的蛋白制品，如重組疫苗、重組胰島素、細(xì)胞因子等產(chǎn)品。目前常用的表達(dá)系統(tǒng)有大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞等，但是它們都各有明顯的優(yōu)缺點(diǎn)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究最充分，有多種選擇，最常用的是Novagen的pET表達(dá)系統(tǒng)，其利用噬菌體的T7RNA聚合酶可專一性地轉(zhuǎn)錄T7啟動子后的目的基因。在最佳條件下，目的蛋白可以達(dá)到大腸桿菌總蛋白的50％以上。盡管具有表達(dá)效率高，培養(yǎng)成本低等優(yōu)點(diǎn)，但是缺點(diǎn)也非常明顯：蛋白容易形成包涵體，復(fù)性難度和成本較高；大腸桿菌不能對蛋白進(jìn)行糖基化修飾；細(xì)胞壁含有脂多糖(內(nèi)毒素)，不易完全去除。另外一個常用的表達(dá)系統(tǒng)是酵母表達(dá)系統(tǒng)，其具有表達(dá)量高，可誘導(dǎo)，蛋白分泌到胞外易于純化，并且具有一定的翻譯后修飾能力等優(yōu)點(diǎn)，但是缺點(diǎn)是部分表達(dá)產(chǎn)物易降解，表達(dá)量不可控，大于30KDa的蛋白幾乎不能分泌。昆蟲細(xì)胞和動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)是具有完整的修飾系統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn)物具有或者類似的天然活性，沒有內(nèi)毒素污染，但是表達(dá)量低，周期長，技術(shù)要求高，生產(chǎn)成本高?？莶菅挎邨U菌是一種廣泛存在于水體、空氣、土壤中的革蘭氏陽性菌，其可以在環(huán)境不適宜的時候產(chǎn)生孢子，孢子可以抵御高溫、干旱等極端環(huán)境，待環(huán)境適宜時再萌發(fā)進(jìn)行營養(yǎng)生長?？莶菅挎邨U菌的分泌能力強(qiáng)，在進(jìn)行高密度發(fā)酵時，蛋白分泌量可以達(dá)到20—25g/L。其發(fā)酵生產(chǎn)的蛋白酶、淀粉酶、次黃嘌呤核苷、核糖甙等產(chǎn)品，早已經(jīng)進(jìn)入我們的日常生活。由于其具有生物安全性，被FDA評委GRAS類添加劑，其生產(chǎn)的益生菌及利用其生產(chǎn)的發(fā)酵產(chǎn)品已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥養(yǎng)殖業(yè)中。上世紀(jì)八十年代就開始利用枯草芽孢桿菌進(jìn)行蛋白表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物不僅包括細(xì)菌來源的各種酶類，如淀粉酶、蛋白酶、內(nèi)葡聚糖酶、脂肪酶等，還包括hEGF、IFN-alpha2、Proinsulin、Streptavidin、cathelicidin-BF等不同來源的蛋白。利用枯草芽孢桿菌的分泌途徑，可將表達(dá)蛋白分泌到發(fā)酵液中，極大地降低了后期分離純化的難度?？莶菅挎邨U菌屬于革蘭氏陽性菌，不含有脂多糖，便于生產(chǎn)注射用藥品?？莶菅挎邨U菌的營養(yǎng)要求簡單，由于其已經(jīng)實(shí)現(xiàn)規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)難度低，培養(yǎng)成本低。目前，枯草芽孢桿菌中的多個菌株及芽孢桿菌屬中的多個種都已經(jīng)完成了基因組測序工作，遺傳背景清楚，安全性高，也便于進(jìn)行基因組改造。但是枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)并不是一個廣泛應(yīng)用的表達(dá)系統(tǒng)，還有許多缺點(diǎn)待克服?？莶菅挎邨U菌的模式菌168菌的野生型菌株已經(jīng)丟失，目前可以得到的菌株都是其突變體。盡管其滿足于科學(xué)研究的要求，但是其蛋白分泌能力差，是營養(yǎng)缺陷性突變體的特性，并不能滿足建立商業(yè)化表達(dá)系統(tǒng)的要求。目前建立的表達(dá)系統(tǒng)都是基于模式菌株168建立的，盡管野生型來源的菌株和已經(jīng)生產(chǎn)應(yīng)用的枯草芽孢桿菌種非常多，不易轉(zhuǎn)化都阻礙了對這些菌株的進(jìn)一步改造。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供種枯草芽孢桿菌Z12，其具有轉(zhuǎn)化效率高，蛋白分泌量大的特點(diǎn)。解決以上技術(shù)問題的本發(fā)明中的一種枯草芽孢桿菌Z12，其特征在于：所述枯草芽孢桿菌Z12，(拉丁文為Bacillussubtilis)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCCNo.12750，保藏日期為2016年7月11日，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。所述枯草芽孢桿菌菌落圓形，呈白色或淡黃色，不透明，表明粗糙，有褶皺，邊緣不整齊。Z12生長過程需氧，生長最適pH7.0-8.5，最適溫度30-45℃，革蘭氏染色呈陽性。所述枯草芽孢桿菌應(yīng)用在作為枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的原始菌株。本發(fā)明中枯草芽孢桿菌的培育方法，包括以下步驟：(1)采集野生型菌種：采集含有枯草芽孢桿菌的土壤，按土壤與培養(yǎng)基的用量比例為1：100加入LB培養(yǎng)基，37℃，200rpm，培養(yǎng)24h，得到富含芽孢桿菌孢子的菌懸液，得到原始菌種。土壤可在原始林區(qū)，富含降解菌的地方進(jìn)行采集。(2)菌株富集與篩選：取1ml菌液，85℃加熱處理30min，殺死所有菌體；然后按103和105倍稀釋涂板，LB培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)；對獲得的單菌落再次劃線，進(jìn)行純度鑒定。(3)菌株轉(zhuǎn)化篩選：菌株轉(zhuǎn)化方法參見高滲轉(zhuǎn)化法：感受態(tài)制備：取步驟(2)中得到的單菌落，接種到2-3mlGM(LB+0.5M山梨糖醇)培養(yǎng)基中，37℃，180rpm過夜培養(yǎng)。第二天早上按1:100接種到50mlGM培養(yǎng)基中，37℃，180rpm培養(yǎng)，待菌液生長到OD達(dá)到0.85-0.95之間時，將菌液放到冰上預(yù)冷10min；4℃，5000g，離心去上清，用等體積預(yù)冷的EM(0.5M山梨糖醇+0.5M甘露糖醇+10％甘油水溶液)重懸菌體，一共重復(fù)4次；加入約1/40體積的EM重懸菌體，保證菌液濃度在1-1.3×1010fu/ml之間。電轉(zhuǎn)化：取60ul上述菌液，加入1ul待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒(pDG148或者pBAV1K-T5-GFP)，質(zhì)粒濃度大于100ng/ul，吹打混勻。然后加入預(yù)冷的1mm電擊杯。電轉(zhuǎn)化儀(EppendorfEporator)參數(shù)設(shè)定，2.1kV，實(shí)際電擊時間在4.0-5.0ms時，才可能有轉(zhuǎn)化菌落生長。電擊后，立即加1mlRM(LB+0.5M山梨糖醇+0.38M甘露糖醇)，吹打混勻，轉(zhuǎn)入5ml無菌離心管中，37℃，180rpm培養(yǎng)3h。將菌液離心，去上清后按一定比例稀釋，取200ul涂布到含有30mg/L卡那霉素的LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)，同時涂布未經(jīng)電轉(zhuǎn)化的菌液做陰性對照。第二天早上觀察菌落生長情況，若轉(zhuǎn)化板有菌落生長，陰性對照沒有，則表明該菌株可以被轉(zhuǎn)化，需要對該菌株進(jìn)行編號記錄。若需要檢測轉(zhuǎn)化效率，則統(tǒng)計(jì)生長菌落總數(shù)，并乘以稀釋倍數(shù)，通過質(zhì)粒添加量，計(jì)算轉(zhuǎn)化效率。本發(fā)明中采用高滲電轉(zhuǎn)化法，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒為pDG148或pBAV1K-T5-GFP，通過篩選得到的枯草芽孢桿菌Z12，可被高效轉(zhuǎn)化并且蛋白分泌量大的枯草芽孢桿菌，可以作為枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的原始菌株。其轉(zhuǎn)化效率可達(dá)1.8×106cfu/ug，單次電擊可得到約2×105個單菌落，轉(zhuǎn)化效率高，可以滿足建立篩選庫的要求。本發(fā)明中發(fā)酵液蛋白濃度：通過篩選得到的Z12菌株，在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，蛋白分泌量可以達(dá)到約378mg/L,而模式菌168只能達(dá)到約121mg/L，Z12的蛋白分泌能力遠(yuǎn)高于模式菌168。本發(fā)明中菌株特征及鑒定，通過篩選得到的枯草芽孢桿菌Z12的菌落形態(tài)為：菌落圓形，呈白色或淡黃色，不透明，表明粗糙，有褶皺，邊緣不整齊。Z12生長過程需氧，生長最適pH7.0-8.5，最適溫度30-45℃，革蘭氏染色呈陽性。通過生理生化鑒定和分子鑒定，確認(rèn)該菌為枯草芽孢桿菌。通過生化鑒定和分子鑒定確認(rèn)該菌屬于生物安全的枯草芽孢桿菌。并且該菌分泌能力強(qiáng)，是模式菌168的3倍以上。附圖說明圖1為本發(fā)明中Z12和168模式菌株發(fā)酵液的PAGE電泳對比圖具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中所用原始質(zhì)粒為市場上購買而得，提取純化：提取純化采用試劑盒進(jìn)行(福際生物的通用質(zhì)粒小量提取試劑盒DE-01001)。實(shí)施例1枯草芽孢桿菌Z12，拉丁文Bacillussubtilis，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏號為CGMCCNo.12750，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。菌株的篩選培育步驟如下：(1)取樣在四川省都江堰市趙公山林區(qū)，隨機(jī)取土壤樣品，并編號標(biāo)記。(2)菌株富集與篩選取約1g土壤樣品，接種到LB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，培養(yǎng)24h。取1ml菌液，85℃加熱處理30min死所有菌體，然后按103稀釋涂板，LB培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)。對獲得的單菌落再次劃線，進(jìn)行純度鑒定。因?yàn)榱粝聛淼亩际茄挎邨U菌，只要確定是不同的菌落都可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化。純度鑒定是劃線培養(yǎng)，所有的單菌落形態(tài)一致。(3)菌株轉(zhuǎn)化：取(2)中得到的單菌落，接種到約3mlGM(LB+0.5M山梨糖醇)培養(yǎng)基中，37℃，180rpm過夜培養(yǎng)。第二天早上按1:100接種到50mlGM培養(yǎng)基中，37℃，180rpm培養(yǎng)，待菌液生長到OD達(dá)到0.85-0.95之間時，將菌液放到冰上預(yù)冷10min；4℃，5000g，離心去上清，用等體積預(yù)冷的EM(0.5M山梨糖醇+0.5M甘露糖醇+10％甘油水溶液)重懸菌體，一共重復(fù)4次；加入約1/40體積的EM重懸菌體，保證菌液濃度在1-1.3×1010cfu/ml之間。取60ul上述菌液，加入1ul待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒(pDG148或者pBAV1K-T5-GFP)，質(zhì)粒濃度大于100ng/ul，吹打混勻，然后加入預(yù)冷的1mm電擊杯。電轉(zhuǎn)化儀(EppendorfEporator)參數(shù)設(shè)定，2.1kV，實(shí)際電擊時間在4.0-5.0ms時，才可能有轉(zhuǎn)化菌落生長。電擊后。立即加1mlRM(LB+0.5M山梨糖醇+0.38M甘露糖醇)，吹打混勻，轉(zhuǎn)入5ml無菌離心管中，37℃，180rpm培養(yǎng)3h。將菌液離心，去上清后按一定比稀釋，取200ul涂布到含有30mg/L卡那霉素的LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)，同時涂布未經(jīng)電轉(zhuǎn)化的菌液做陰性對照。第二天早上觀察菌落生長情況，若轉(zhuǎn)化板有菌落生長，陰性對照沒有，則表明該菌株可以被轉(zhuǎn)化，需要對該菌株進(jìn)行編號。若需要檢測轉(zhuǎn)化效率，則統(tǒng)計(jì)生長菌落總數(shù)，并乘以稀釋倍數(shù)，通過質(zhì)粒添加量，計(jì)算轉(zhuǎn)化效率。實(shí)施例2發(fā)酵液中蛋白含量測定與分析(1)菌液培養(yǎng)取實(shí)例1中步驟(3)得到的可被高效轉(zhuǎn)化的單菌落，接種到3mlLB培養(yǎng)基中，37℃，180rpm過夜培養(yǎng)。第二天按1:100接種到50mlLB培養(yǎng)基中，37℃，180rpm培養(yǎng)48h。取全部菌液，離心，取上清進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。(2)菌液中蛋白含量測定取以上(1)中得到的菌液，采用通用型蛋白沉淀試劑(生工生物，NO.C510012)濃縮蛋白，去除培養(yǎng)基中添加的多肽。采用改良型BCA蛋白濃度測定試劑盒(生工生物，NO.C503051)測定蛋白濃度。(3)PAGE電泳取以上(1)中得到的菌液100ul，加入2×上樣緩沖液，95℃處理5min。采用10％SDSPAGE凝膠進(jìn)行電泳，上樣量為20ul。其中模式菌168和枯草芽孢桿菌Z12的發(fā)酵上清液如電泳圖1。本發(fā)明中的枯草芽孢桿菌Z12在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，蛋白分泌量可以達(dá)到約378mg/L,而模式菌168只能達(dá)到約121mg/L，枯草芽孢桿菌Z12的蛋白分泌能力遠(yuǎn)高于模式菌168。實(shí)施例3菌株鑒定(1)取實(shí)施例1中的原始菌落和經(jīng)轉(zhuǎn)化得到的菌株，劃線到LB平板上，37℃培養(yǎng)24h，觀察菌落形態(tài)。(2)取(1)中得到的菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，觀察。(3)取(1)中的單菌落，接菌約3mlLB培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)。采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(成都福際生物，DE-05311)抽提細(xì)菌基因組。根據(jù)文獻(xiàn)(PhylogeneticheterogeneityofthegenusBacillusrevealedbycomparativeanalysisofsmall-subunit-ribosomalRNAsequences，1991)合成引物擴(kuò)增16SDNA片段，測序，在genbank上進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)其Z12的16SDNA序列于bacillus屬下幾個種的相似性都大于99.5％。其中擴(kuò)增16SDNA片段的引物序列，F(xiàn)：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，R：GGTTACCTTGTTACGACTT，退火溫度60℃，延伸2min。根據(jù)文獻(xiàn)(PhylogeneticanalysisofBacillussubtilisandrelatedtaxabasedonpartialgyrAgenesequences，2000)合成引物擴(kuò)增gyrA片段，測序，在GenBank上進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)其序列與Bacillussubtilis種下的多株菌的gyrA序列相似性大于99.5％。其中擴(kuò)增gyrA片段的引物序列，F(xiàn)：CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT，R：CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT，退火溫度60℃，延伸2min。以上結(jié)果表明，Z12菌株是芽孢桿菌屬(Bacillus)下的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。實(shí)施例4再取實(shí)施例3的(1)中得到的單菌落，根據(jù)伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊第九版中的方法進(jìn)行，Z12和模式菌168的生理生化檢測結(jié)果如下表：特征Z12168特征Z12168淀粉水解++VP反應(yīng)++明膠水解實(shí)驗(yàn)++過氧化氫酶++葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)++木糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)++乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)--檸檬酸鹽++以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3