用以檢測(cè)突變的方法與引物組的制作方法
【專利摘要】在此揭示以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase?chain?reaction，簡(jiǎn)稱PCR)為基礎(chǔ)的方法，此方法可用以檢測(cè)樣本中目標(biāo)基因之一所選區(qū)域中是否發(fā)生插入/缺失變異(相較于一參考序列)。目標(biāo)基因具有一模板股與一編碼鏈。此方法運(yùn)用包含一抑制引物以及一正向引物的引物組。所用的抑制引物與正向引物部分序列重疊，但具有不同的解鏈溫度，且抑制引物的3’端經(jīng)修飾而能夠防止抑制引物在PCR過(guò)程中延伸。因此，在特定的PCR條件下，能檢測(cè)到PCR產(chǎn)物意味著在所選區(qū)域中發(fā)生了插入/缺失突變，而未檢測(cè)到PCR產(chǎn)物意味著在所選區(qū)域中并未發(fā)生插入/缺失突變。
【專利說(shuō)明】用以檢測(cè)突變的方法與引物組
(1)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明是關(guān)于用以檢測(cè)變異的方法與引物組。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明是關(guān)于插入和/或缺失變異的檢測(cè)。
(2)

【背景技術(shù)】
[0002]基因突變(gene mutat1n)系指一特定基因或調(diào)控序列的核苷酸序列相較于天然(或正常)核苷酸序列有所改變。突變可以是點(diǎn)突變(point mutat1n ;即，單一核苷酸置換)、一或多個(gè)核苷酸的缺失(delet1n)或插入(insert1n)、多個(gè)核苷酸的置換(substitut1n)或在染色體層級(jí)的互換(crossing-over)。
[0003]近年來(lái)，用以檢測(cè)點(diǎn)突變或染色體互換的技術(shù)發(fā)展迅速。舉例來(lái)說(shuō)，可利用桑格式直接測(cè)序法(Sanger’ s direct sequencing)來(lái)對(duì)目標(biāo)序列測(cè)序，以得知發(fā)生突變的一或多個(gè)核苷酸。然而此種直接測(cè)序的靈敏度不高，因而限制了此技術(shù)在臨床與研究領(lǐng)域等的應(yīng)用。或者是可采用專一的引物和/或探針，以正向檢測(cè)目標(biāo)序列上的點(diǎn)突變或互換。然而，運(yùn)用上述方法來(lái)檢測(cè)插入突變與缺失突變的相關(guān)報(bào)導(dǎo)并不多見(jiàn)。傳統(tǒng)上，在設(shè)計(jì)用以檢測(cè)插入/缺失突變的引物或探針時(shí)，必須先知道突變部位的序列。當(dāng)目標(biāo)基因中帶有超過(guò)一個(gè)的插入和/或缺失核苷酸時(shí)，必須使用多個(gè)引物才能確保所有突變序列都能被檢測(cè)。此外，傳統(tǒng)方法極易發(fā)生檢測(cè)錯(cuò)誤，部分是因?yàn)橐砸锘蛱结樅湍繕?biāo)基因進(jìn)行雜交(hybridizat1n)時(shí),突變部位可能形成環(huán)圈(looped out),因此引物或探針仍可和具有突變核苷酸之目標(biāo)基因發(fā)生非特異性的雜交(unspecific hybridizat1n)。更有甚者,這些習(xí)知檢測(cè)方法之檢測(cè)靈敏度(detect1n sensitivity)通常較低，因而需要使用大量的脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,簡(jiǎn)稱DNA)和/或經(jīng)過(guò)更多次的反應(yīng)循環(huán),使得整個(gè)反應(yīng)耗時(shí)費(fèi)力。在某些情形中，必須使用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitativepolymerase chain react1n,簡(jiǎn)稱RTQ-PCR)和/或RTQ-PCR專用的設(shè)備才能夠進(jìn)行檢測(cè)。因而，為了確保得到正確的檢測(cè)結(jié)果，習(xí)知方法可能需要花費(fèi)較多時(shí)間或成本來(lái)優(yōu)化反應(yīng)參數(shù)。以上種種因素限制了這些技術(shù)在臨床試驗(yàn)以及基礎(chǔ)研究等領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0004]有鑒于上述問(wèn)題，相關(guān)領(lǐng)亟需提出一種能夠正確地檢測(cè)插入和/或缺失突變的方法。
(3)


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]
【發(fā)明內(nèi)容】
旨在提供本揭示內(nèi)容的簡(jiǎn)化摘要，以使閱讀者對(duì)本揭示內(nèi)容具備基本的理解。此
【發(fā)明內(nèi)容】
并非本揭示內(nèi)容的完整概述，且其用意并非在指出本發(fā)明實(shí)施例的重要/關(guān)鍵組件或界定本發(fā)明的范圍。
【發(fā)明內(nèi)容】
旨在提供本揭示內(nèi)容的簡(jiǎn)化摘要，以使閱讀者對(duì)本揭示內(nèi)容具備基本的理解。此
【發(fā)明內(nèi)容】
并非本揭示內(nèi)容的完整概述，且其用意并非在指出本發(fā)明實(shí)施例的重要/關(guān)鍵組件或界定本發(fā)明的范圍。
[0006]本發(fā)明至少部分是基于一種新穎的引物設(shè)計(jì)方案，此種設(shè)計(jì)方案使得樣本中，帶有變體序列(相較于參考序列)的目標(biāo)基因能夠被擴(kuò)增，且因而能夠檢測(cè)到此種具有突變的目標(biāo)基因。具體來(lái)說(shuō)，所述目標(biāo)基因具有模板鏈以及和此模板鏈互補(bǔ)的編碼鏈，而本發(fā)明提出的引物組及方法是針對(duì)該模板鏈中一段選定區(qū)域來(lái)進(jìn)行設(shè)計(jì)。此處所述的選定區(qū)域可能帶有或不帶有至少一變異核苷酸，此變異核苷酸可能是被插入到參考核苷酸序列中，或自參考核苷酸序列中被移除。于一實(shí)施例中，參考序列可為野生型(正常)序列，此時(shí)變體序列可帶有插入和/或缺失突變?；蛘呤牵瑓⒖夹蛄锌梢允且环N已知的突變序列，此時(shí)所謂的變體序列可以是野生型序列或任何其它突變序列。
[0007]有鑒于此，本發(fā)明的第一方面是關(guān)于根據(jù)此引物設(shè)計(jì)方案的引物組。當(dāng)可注意到，在根據(jù)此種方案設(shè)計(jì)特定引物組時(shí)，不需要事先知道經(jīng)插入或刪除之序列(相對(duì)于參考序列)；不過(guò)，本發(fā)明當(dāng)然亦可用來(lái)檢測(cè)已知的變體序列。相對(duì)應(yīng)地，此處所教示的單一種引物組能夠檢測(cè)位于選定區(qū)域內(nèi)的多種變異。因而，在本說(shuō)明書(shū)中有時(shí)亦會(huì)將此處提出的能夠擴(kuò)增這些突變序列的方法稱為通用插入/缺失聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(universal insert1n/delet1n PCR，Unidel-PCR)或簡(jiǎn)稱為 “PCR”。
[0008]根據(jù)本發(fā)明一實(shí)施方式，可用于此處所述之PCR式方法的引物組包含一抑制引物及一正向引物。抑制引物經(jīng)設(shè)計(jì)能夠阻止參考序列在PCR過(guò)程中被擴(kuò)增。為了達(dá)到此一目的，抑制引物的序列與模板鏈之選定區(qū)域的參考序列以及緊接于模板鏈之選定區(qū)域前的至少一核苷酸殘基相同，且抑制引物的3’端經(jīng)修飾以防止該抑制引物于該P(yáng)CR過(guò)程中延伸。正向引物的序列與位于模板鏈選定區(qū)域上游(upstream)之多個(gè)核苷酸殘基相同，且正向引物3’端的至少最后一個(gè)核苷酸殘基與抑制引物5’端的至少第一個(gè)核苷酸殘基相同。
[0009]根據(jù)本發(fā)明另一實(shí)施方式,抑制引物3’端經(jīng)過(guò)磷酸基(phosphate group)、磷酸酯(phosphate ester)、反向 3，_3，連接(inverted3，_3，linkage)、2，,3，-二脫氧核苷(2，,3，-dideoxynucIeoside)或 3，脫氧核苷(3，-deoxynucIeoside)的修飾。
[0010]在非必要的實(shí)施方式中，正向引物的解鏈溫度(melting temperature,Tm)不同于抑制引物的解鏈溫度。根據(jù)某些實(shí)施方式，抑制引物與正向引物的解鏈溫度皆分別高于或等于50°C。在一非必要的實(shí)施方式中，抑制引物的解鏈溫度為約65-75°C，而正向引物的解鏈溫度為約50-60°C。
[0011]根據(jù)本發(fā)明另一實(shí)施方式，抑制引物的長(zhǎng)度為10-100個(gè)核苷酸。根據(jù)本發(fā)明又一實(shí)施方式，正向引物的長(zhǎng)度為10-30個(gè)核苷酸。根據(jù)本發(fā)明再一實(shí)施方式,正向引物3’端的至少最后5-10個(gè)核苷酸和抑制引物5’端的至少前5-10個(gè)核苷酸相同。
[0012]在一實(shí)施例中，選定區(qū)域的序列如SEQ ID NO:1所示，抑制引物的序列如SEQ IDNO:2所示，且正向引物的序列如SEQ ID N0:3所示。在另一實(shí)施例中，選定區(qū)域的序列如SEQ ID NO:4所示，抑制引物的序列如SEQ ID NO:5所示，且正向引物的序列如SEQ ID NO:6所示。在又一實(shí)施例中，選定區(qū)域的序列如SEQ ID NO:7所示，抑制引物的序列如SEQ IDNO:8所示,且正向引物的序列如SEQ ID N0:9所示。
[0013]本發(fā)明的第二種方面是關(guān)于一種用以檢測(cè)一樣本中目標(biāo)基因之PCR式方法，其中上述目標(biāo)基因的一選定區(qū)域內(nèi)可能帶有或不帶有至少一變異核苷酸(相較于正常序列)，所述的目標(biāo)基因具有模板鏈以及與該模板鏈互補(bǔ)的編碼鏈。下文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本方法在檢測(cè)插入/缺失變異方面展現(xiàn)了極高的靈敏度(sensibility)。此外，本方法能夠檢測(cè)未知序列的此種插入或缺失型的變異核苷酸。
[0014]根據(jù)本發(fā)明一實(shí)施方式，此PCR式方法包含以下步驟。將帶有目標(biāo)基因的樣本與根據(jù)本發(fā)明上述實(shí)施方式所述的引物組混合，以得到反應(yīng)混合物。接著，對(duì)混合物進(jìn)行PCR，其依序包含以下步驟:變性(denaturing)、退火(annealing)與延伸(extens1n)。在退火步驟中，退火溫度使得正向引物和抑制引物能夠彼此競(jìng)爭(zhēng)而與模板鏈退火。其后，決定經(jīng)過(guò)PCR過(guò)程后是否得到PCR產(chǎn)物。在本實(shí)施方式中，當(dāng)可檢測(cè)到PCR產(chǎn)物時(shí)，表示樣本中目標(biāo)基因選定區(qū)域內(nèi)有一或多插入或缺失變異；而當(dāng)無(wú)法檢測(cè)到PCR產(chǎn)物時(shí)，表示樣本中目標(biāo)基因選定區(qū)域內(nèi)沒(méi)有插入或缺失變異。
[0015]根據(jù)本發(fā)明另一實(shí)施方式，混合物中抑制引物與正向引物的摩爾比為約1:1至10:1 ;且較佳為3:1至10:1。
[0016]在參閱下文實(shí)施方式后，本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】中具有通常知識(shí)者當(dāng)可輕易了解本發(fā)明之基本精神及其它發(fā)明目的，以及本發(fā)明所采用之技術(shù)手段與實(shí)施方式。
(4)

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]為讓本發(fā)明的上述與其它目的、特征、優(yōu)點(diǎn)與實(shí)施例能更明顯易懂，所附圖式之說(shuō)明如下:
[0018]第1圖為示意圖，概要地說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明實(shí)方式的引物設(shè)計(jì)方案；以及
[0019]第2圖為照片，呈現(xiàn)出根據(jù)本發(fā)明一實(shí)施例來(lái)檢測(cè)插入/缺失突變之電泳結(jié)果。
(5)

【具體實(shí)施方式】
[0020]為了使本揭示內(nèi)容的敘述更加詳盡與完備，下文針對(duì)了本發(fā)明的實(shí)施方面與具體實(shí)施例提出了說(shuō)明性的描述；但這并非實(shí)施或運(yùn)用本發(fā)明具體實(shí)施例的唯一形式。實(shí)施方式中涵蓋了多個(gè)具體實(shí)施例的特征以及用以建構(gòu)與操作這些具體實(shí)施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其它具體實(shí)施例來(lái)達(dá)成相同或均等的功能與步驟順序。
[0021]除非本說(shuō)明書(shū)另有定義，此處所用的科學(xué)與技術(shù)詞匯之含義與本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】中具有通常知識(shí)者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文沖突的情形下，本說(shuō)明書(shū)所用的單數(shù)名詞涵蓋該名詞的復(fù)數(shù)型；而所用的復(fù)數(shù)名詞時(shí)亦涵蓋該名詞的單數(shù)型。同時(shí)，在此處“至少一”以及“一或多”等詞匯當(dāng)包含一、二、三或更多種。
[0022]雖然用以界定本發(fā)明較廣范圍的數(shù)值范圍與參數(shù)界是約略的數(shù)值，此處已盡可能精確地呈現(xiàn)【具體實(shí)施方式】的相關(guān)數(shù)值。然而，任何數(shù)值本質(zhì)上不可避免地含有因個(gè)別測(cè)試方法所致的標(biāo)準(zhǔn)偏差。在此處，“約”通常系指實(shí)際數(shù)值在一特定數(shù)值或范圍的正負(fù)10%、5%、1%或0.5%之內(nèi)?；蛘呤牵凹s” 一詞代表實(shí)際數(shù)值落在平均值的可接受標(biāo)準(zhǔn)差之內(nèi)，視本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】中具有通常知識(shí)者的考慮而定。除了實(shí)驗(yàn)例之外，或除非另有明確的說(shuō)明，當(dāng)可理解此處所用的所有范圍、數(shù)量、數(shù)值與百分比(例如用以描述材料用量、時(shí)間長(zhǎng)短、溫度、操作條件、數(shù)量比例及其它相似者)均經(jīng)過(guò)“約”的修飾。因此，除非另有相反的說(shuō)明，本說(shuō)明書(shū)與附隨申請(qǐng)專利范圍所揭示的數(shù)值參數(shù)皆為約略的數(shù)值，且可視需求而更動(dòng)。至少應(yīng)將這些數(shù)值參數(shù)理解為所指出的有效位數(shù)與套用一般進(jìn)位法所得到的數(shù)值。
[0023]“核苷酸”(nucleic acid) 一詞在此處系指由雜環(huán)堿基(heterocyclic base)、糖類(sugar)與一或多個(gè)磷酸基(phosphate group)所組成的化合物。最常見(jiàn)的核苷酸是以嘌呤(purine)或喃唳(pyrimidine)的衍生物作為堿基,而糖類則是五碳脫氧核糖(pentose deoxyribose)或五碳核糖(pentose ribose)。常見(jiàn)的嘌呤有腺嘌呤(adenine,A)與鳥(niǎo)嘌呤(guanine, G);而常見(jiàn)的嘧唳有胞嘧唳(cytosine, C)、胸腺嘧唳(thymine,T)與尿嘧唳(uracil, U)?！昂塑账嵝蛄小?nucleotide sequence) 一詞在此系指在一單鏈核酸(nucleic acid)中的寡核苷酸(oligonucleotide)或聚核苷酸(polynucleotide)之核苷酸排序。除非另有說(shuō)明，單鏈核苷酸序列的左手端為5,端；而右手端為3,端?！跋掠巍?downstream) —詞系指位于所述核苷酸序列之3 '方向的一核苷酸序列；而“上游”(upstream) —詞則是指位于所述核苷酸序列之5'方向的一核苷酸序列。
[0024]在本說(shuō)明書(shū)中，“目標(biāo)基因”(target gene) 一詞系指欲用以探究其“選定區(qū)域”(selected reg1n)內(nèi)是否帶有或不帶有插入/缺失變異的一種核苷酸序列。一般來(lái)說(shuō)，目標(biāo)基因?yàn)殡p鏈DNA的形式,其系由一模板鏈(template strand)以及與該模板鏈互補(bǔ)的一編碼鏈(coding strand)所組成。根據(jù)本領(lǐng)域的習(xí)慣，模板鏈的序列由5’至3’方向呈現(xiàn)(由左到右)；而編碼鏈則是由3’至5’方向呈現(xiàn)(由左到右)。根據(jù)本發(fā)明之方面與實(shí)施方式，抑制引物與正向引物經(jīng)設(shè)計(jì)能夠和編碼鏈中的一特定序列雜交(hybridize)或退火(anneal)。
[0025]“參考序列”(reference sequence) 一詞在此系指一種受到關(guān)注的特定序列。參考序列可以是“野生型”(wild-type)、“非突變”(non_mutated)或“正?！?normal)序列，這些序列中不帶有插入/缺失或其它突變。或者是，參考序列可以是一種突變的序列。
[0026]在此處變體”(variant) —詞系指一參考(reference)核酸分子的一或多個(gè)核苷酸發(fā)生了改變。當(dāng)參考核酸分子是未經(jīng)突變的野生型核酸分子時(shí)，變體序列可以是任何具有插入和/或缺失突變的突變序列。當(dāng)參考序列是一種已知的突變序列時(shí)，變體序列包括野生型序列以及其它突變序列。
[0027]“插入變體” (insert1n variant) 一詞系指改變是由于在參考核酸分子中出現(xiàn)了一或多個(gè)額外的核苷酸；因此，插入變體包含了插入突變。此外，基因剪接(gene splicing)序列也可視為插入突變，因?yàn)樵贒NA股中加入了額外的堿基?！叭笔ё凅w” 一詞則是指由參考核酸分子中移除一或多個(gè)核苷酸所導(dǎo)致的變體，且包括缺失突變。在本說(shuō)明書(shū)中交替使用“插入和/或缺失變體”以及“插入/缺失變體”等用語(yǔ)可交替指稱插入變體或缺失變體或同時(shí)帶有插入與缺失兩種變體之情形。舉例來(lái)說(shuō)，可將互換(crossing-over)序列視為包含插入突變與缺失突變的序列。。
[0028]“正向引物” (forward primer)在此系指一種單鏈核苷酸序列,其序列和欲復(fù)制的一單鏈核酸的序列相同。當(dāng)正向引物處于適當(dāng)?shù)沫h(huán)境(如具有適當(dāng)緩沖液、鹽類、溫度和/或pH值)下且環(huán)境中存有核苷酸以及用于核酸聚合的成分(如，DNA聚合酶(polymerase)或RNA聚合酶)，正向引物能夠作為一引物延伸產(chǎn)物的合成起始點(diǎn)。具體來(lái)說(shuō)，“正向引物”能夠和與模板鏈5’端互補(bǔ)的序列雜交(或退火)。在此處，“抑制引物”為單鏈核苷酸序列，其可和至少與選定區(qū)域5’端互補(bǔ)之序列雜交(或退火)，且一如其名地，抑制引物不會(huì)引發(fā)(initiate)與之結(jié)合的核苷酸序列之?dāng)U增。
[0029]“雜交”一詞系指具有足夠互補(bǔ)性的二核苷酸序列經(jīng)由華森-克李克(Watson-Crick)堿基配對(duì)或其它非正規(guī)的配對(duì)而形成了復(fù)合物(complexes)或雜交體(hybrid)。雜交作用可能發(fā)生在兩股DNA之間、兩股RNA之間或一股DNA與一股RNA之間。雜交作用會(huì)在分子生物學(xué)領(lǐng)域中習(xí)知的多種適當(dāng)條件(如溫度、PH值、鹽類濃度等)下發(fā)生。
[0030]在此處，“擴(kuò)增” (amplificat1n) —詞系指能夠增加樣本中特定核苷酸序列含量的方法或過(guò)程。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是相關(guān)領(lǐng)域熟知的擴(kuò)增反應(yīng)，下文將進(jìn)一步詳述此處所用的PCR過(guò)程。在此處反應(yīng)混合物” (react1n mixture)與“混合物” (mixture)等詞是用來(lái)指稱可用于后續(xù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的組成物。
[0031]參照第I圖來(lái)描述此處提出的引物設(shè)計(jì)方案，以利了解本發(fā)明之內(nèi)容。當(dāng)可注意到第I圖中所示的序列是為了說(shuō)明本發(fā)明且僅為例示；因此申請(qǐng)專利范圍不受這些序列的限制。
[0032]如第I圖所示，目標(biāo)基因是內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體外顯子19 (epidermal growthfactor代(3印如1'伍6?1?)6101119)，此目標(biāo)基因的模板鏈包含EGFR外顯子的第2214至2261個(gè)核苷酸，其序列為 5’ -TAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAA-3’ (SEQID NO:10)，而與模板鏈互補(bǔ)的編碼鏈包含以下序列3’-ATTTTA AGGGCAGCGATAGTTCCTTAATTCTCTTCGTTGTAGAGGCTT-5’ (SEQ ID NO:11)。在本說(shuō)明書(shū)的公開(kāi)內(nèi)容中，在模板鏈中選定了一區(qū)域以探究此選定區(qū)域中是否帶有或不帶有一或多插入/缺失變異。在本實(shí)施例中，模板鏈中的選定區(qū)域之序列為T(mén)AAGAGAAGC(SEQ ID NO:1，即EGFR外顯子的第2240至2249個(gè)核苷酸)。
[0033]理論上，欲探究的選定區(qū)域的核苷酸長(zhǎng)度并無(wú)特殊限制。根據(jù)本發(fā)明的非必要實(shí)施方式，選定區(qū)域最多可帶有99個(gè)核苷酸。舉例來(lái)說(shuō),選定區(qū)域的長(zhǎng)度可為約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 99 個(gè)核苷酸。
[0034]為了檢測(cè)選定區(qū)域內(nèi)的插入/缺失變異，設(shè)計(jì)了兩種引物(B卩，抑制引物及正向引物)，其分別可結(jié)合至模板鏈的不同但重疊部分。下文將詳細(xì)說(shuō)明這兩種引物。
[0035]抑制引物
[0036]抑制引物的序列和模板鏈之選定區(qū)域的參考序列以及緊接在該模板鏈選定區(qū)域上游的至少一核苷酸殘基相同，因此在適當(dāng)?shù)碾s交環(huán)境下，抑制引物可退火至一與選定區(qū)域以及至少一相鄰核苷酸互補(bǔ)的序列。非必要地，抑制引物更包含緊接在選定區(qū)域上游的至少5至20個(gè)連續(xù)的核苷酸殘基。同樣非必要地，抑制引物可包含緊接在該選定區(qū)域下游的至少一核苷酸殘基。相似地，上述緊接在選定區(qū)域下游的核苷酸殘基可為至少5至20個(gè)核苷酸殘基。舉例來(lái)說(shuō)，如第I圖所示，一例示的抑制引物之序列為CGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTC C(SEQ ID NO:2，選定區(qū)域以斜體標(biāo)記)。如第I圖所示，此抑制引物包含了緊接在選定區(qū)域上游的15個(gè)連續(xù)核苷酸殘基(CGCTATCAAGGAAT)以及緊接在選定區(qū)域下游的9個(gè)連續(xù)核苷酸殘基(AACATCTCC)。本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】中具有通常知識(shí)者當(dāng)可理解，由于此抑制引物涵蓋了整個(gè)所選區(qū)域，當(dāng)所選區(qū)域中沒(méi)有插入/缺失突變時(shí)，抑制引物可形成相對(duì)較穩(wěn)定的雜交體。相反地，當(dāng)所選區(qū)域中帶有插入/缺失之核苷酸時(shí)，抑制引物和編碼鏈在所選區(qū)域的部分會(huì)出現(xiàn)無(wú)法對(duì)齊(misalignment)的現(xiàn)象,而使得其中抑制引物或編碼鏈其中之一形成環(huán)圈(loop)，而得到較不穩(wěn)定的雜交體(見(jiàn)第I圖)?；蛘呤牵?dāng)插入/刪除之核苷酸位于所選區(qū)域的前端或尾端時(shí)，抑制引物與編碼鏈無(wú)法對(duì)齊，因而在該端點(diǎn)處形成一分岔(fork)，而得到較不穩(wěn)定的雜交體(圖中未繪示)。
[0037]顧名思義，抑制引物可以阻止此引物在PCR過(guò)程中延伸。要達(dá)到此一目的，可在一般引物的3’端加上非核苷阻斷物(non-nucleosidic blocker),如磷酸基或磷酸酯。譬如由 3’-間隔物(3’_Spacer) C3 胞嘧唳-憐酸-鳥(niǎo)嘌呤(C3 cytosine-phosphate-guanine,簡(jiǎn)稱C3-CPG)形成的3’ -丙基磷酸酯(3’ -propylphosphate)就是一種很有效的3’端非核苷阻斷物。在3’位置上形成反向的3’ -3’連接也能夠有效地防止聚合酶將核苷酸延伸，因?yàn)樵谄?’位置上沒(méi)有可用的羥基可供起始合成反應(yīng)。另一種避免聚合酶在3’端進(jìn)行延伸的方法是利用核苷阻斷物(nucleosidic blocker),如2’，3’ - 二脫氧核苷(如2，，3，-ddC-CPG)或 3，脫氧核苷(如 3，-dA_CPG、3，-dC_CPG、3，-dG-CPG 或 3，-dT-CPG)。當(dāng)然，亦可采用可用以修飾抑制引物3’端的其它等效技術(shù)，而這些其它技術(shù)亦屬于本發(fā)明之范圍。
[0038]根據(jù)本發(fā)明的原理與精神，抑制引物應(yīng)涵蓋整個(gè)選定區(qū)域以及至少一個(gè)額外的核苷酸殘基。因而，根據(jù)某些實(shí)施方式，本發(fā)明的抑制引物之長(zhǎng)度為至少10-100個(gè)核苷酸。本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】中具有通常知識(shí)者當(dāng)可理解，抑制引物的確切長(zhǎng)度取決于欲探究的選定區(qū)域之長(zhǎng)度以及該引物適用的反應(yīng)條件，如退火溫度與離子強(qiáng)度(1nic strength)。舉例來(lái)說(shuō)，第I圖所示的抑制引物長(zhǎng)度為33個(gè)核苷酸殘基。
[0039]根據(jù)本發(fā)明某些實(shí)施方式，抑制引物的解鏈溫度大于等于約50°C。在非必要且較佳的情形中，抑制引物的解鏈溫度約為55-85 °C;且更加為約65-75 °C。具體來(lái)說(shuō)，抑制引物的解鏈溫度可為約 55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84 或 85°C。SEQ ID N02 的抑制引物之解鏈溫度為約 69°C。
[0040]正向引物
[0041]本發(fā)明的正向引物經(jīng)特殊設(shè)計(jì)，而使得其3’端和抑制引物的5’端重疊。如此一來(lái)，在雜交環(huán)境下， 抑制引物可和正向引物競(jìng)爭(zhēng)重疊部分的一或多核苷酸殘基，以便與模板鏈的互補(bǔ)序列(即，編碼鏈)雜交。具體來(lái)說(shuō)，正向引物的序列與位于選定區(qū)域上游的多個(gè)核苷酸殘基相同，且該正向引物3’端的至少最后一個(gè)核苷酸殘基與該抑制引物5’端的至少第一個(gè)核苷酸殘基相同。非必要地，正向引物3’端的至少5、10或15個(gè)連續(xù)核苷酸殘基和抑制引物5’端的至少5、10或15個(gè)連續(xù)核苷酸殘基相同。第I圖中例示的正向引物序列為AATTCCCGTCGCTATCAA (SEQ ID NO:3)，此序列最后9個(gè)連續(xù)殘基(即CGCTATCAA)與抑制引物的前9個(gè)連續(xù)殘基相同。
[0042]根據(jù)某些實(shí)施方式，正向引物的長(zhǎng)度為10-30個(gè)核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的原理與精神，正向引物的確切長(zhǎng)度取決于其和抑制引物的重疊核苷酸殘基數(shù)目以及該引物適用的反應(yīng)條件，如退火溫度與離子強(qiáng)度。舉例來(lái)說(shuō)，第I圖所示的正向引物長(zhǎng)度為18個(gè)核苷酸殘基。
[0043]根據(jù)本發(fā)明某些實(shí)施方式，正向引物的解鏈溫度大于等于約50°C。在非必要且較佳的情形中，正向引物的解鏈溫度約為50-70°C ;且更加為約55-60°C。具體來(lái)說(shuō)，正向引物的解鏈溫度可為約 50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70°C。SEQ ID N03的正向引物之解鏈溫度為約55°C。
[0044]當(dāng)注意到，在非必要的實(shí)施方式中，抑制引物的解鏈溫度可和正向引物的解鏈溫度不同。如此一來(lái)，可將含有這兩種引物的PCR反應(yīng)混合物分別置于不同的退火溫度下，而分別控制這兩種引物和編碼鏈之雜交。一般來(lái)說(shuō)，抑制引物解鏈溫度與正向引物的解鏈溫度差為約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15°C。以第I圖所示的引物對(duì)為例，兩種引物的解鏈溫度差約為14°C。
[0045]檢測(cè)插入/缺失變異的方法
[0046]在詳細(xì)介紹了此處提出的引物設(shè)計(jì)方案以及例示的引物組之后，接著說(shuō)明利用此種引物組的PCR式檢測(cè)方法。
[0047]根據(jù)本發(fā)明一實(shí)施方式，將帶有目標(biāo)基因的樣本與此處提出的引物組混合，以得到可用于后續(xù)PCR處理的混合物。所述的目標(biāo)基因是雙鏈DNA，具有模板鏈以及與模板鏈互補(bǔ)之模板鏈。
[0048]當(dāng)可理解，適用于本方法的引物組乃是根據(jù)上文所述的方案而設(shè)計(jì)，且因而在此省略了關(guān)于抑制引物與正向引物的詳細(xì)說(shuō)明，以求簡(jiǎn)潔與明了。
[0049]根據(jù)本發(fā)明多種實(shí)施方式，在PCR混合物中，抑制引物與正向引物的摩爾比為約1:1至10:1 ;且較佳為約3:1至10:1。舉例來(lái)說(shuō)，兩者的摩爾比可為約1:1、1:2、1:3、1:
4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。在一實(shí)驗(yàn)例中，反應(yīng)混合物中含有約0.2 μ M的正向引物與約I μΜ的抑制引物。
[0050]一般來(lái)說(shuō)，模板鏈(以及編碼鏈)的選定區(qū)域內(nèi)可能帶有或不帶有一或多插入/缺失變異。根據(jù)本發(fā)明的原理與精神，本方法適用以檢測(cè)已知或未知的變體序列。
[0051]在某些情形中，欲檢測(cè)的生物樣本中可能同時(shí)含有野生型序列與突變序列。譬如，在取自生物體組織的樣本中，可能含有某些突變細(xì)胞。在此種情形中，突變序列(相較于野生型序列)可能僅占了一小部分。由于本方法在檢測(cè)插入/缺失突變時(shí)展現(xiàn)了極高的靈敏度，因此樣本中突變序列含量稀少不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。在一實(shí)施例中，當(dāng)樣本同時(shí)含有野生型與突變序列時(shí)，即便突變序列的量?jī)H有野生型序列的萬(wàn)分之一，本方法都能夠檢測(cè)到突變序列的存在。此外，根據(jù)本發(fā)明某些實(shí)施例，只需10-1000份的目標(biāo)基因即足以進(jìn)行檢測(cè)。
[0052]本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】中具有通常知識(shí)者當(dāng)可理解，反應(yīng)混合物中可更包含其它擴(kuò)增反應(yīng)試劑。這些用于PCR的擴(kuò)增反應(yīng)試劑可包含，但不限于:緩沖劑(buffers);反應(yīng)試劑(reagents);具有反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase)活性、聚合酶(polymerase)和/或外切酶(exonuclease)活性的酵素；酵素輔助因子(enzyme cofactors),如鎂或猛；鹽類；以及脫氧三磷酸核苷(deoxyribonucleotide triphosphates, dNTPs),如脫氧三憐酸腺苷(deoxyadenosine triphosphate, dATP)、脫氧三憐酸鳥(niǎo)苷(deoxyguanosinetriphosphate, dGTP)、脫氧三憐酸胞苷(deoxycytidine triphosphate, dCTP)、脫氧三憐酸胸苷(deoxythymidine triphosphate, dTTP)及脫氧三憐酸尿苷(deoxyuridinetriphosphate, dUTP)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可依據(jù)所用的PCR方法來(lái)選擇適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增反應(yīng)試劑。
[0053]之后對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行PCR處理；此處理依序包含變性步驟、退火步驟與延伸步驟；茲分述如下。
[0054]在變性步驟中，將由模板鏈與編碼鏈形成的雙鏈DNA (DNA duplex)變性(即，熔化)。雙鏈DNA確切的變性過(guò)程取決于其大小、序列與分子組成(主要是G-C鍵結(jié)相對(duì)于A-T鍵結(jié)的比例或G-C % )。在適當(dāng)?shù)臏囟认?，雙鏈DNA通常會(huì)在一秒內(nèi)就變性，上述溫度約介于80°C (—般為G-C%較低且較小的分子)至約95°C (—般為較大的分子，如人類基因組DNA)之間；在某些情形中，變性溫度可能更低。
[0055]在變性步驟之后，將反應(yīng)混合物冷卻至退火溫度，而使得抑制引物和正向引物能夠彼此競(jìng)爭(zhēng)與模板鏈退火之機(jī)會(huì)。本領(lǐng)域具有通常知識(shí)者當(dāng)可理解，互相雜交的兩序列不必然需要完全互補(bǔ)。因而，抑制引物不但可和帶有參考序列的編碼鏈雜交，也會(huì)和選定區(qū)域內(nèi)具有插入/缺失變異的編碼鏈雜交。然而，如上文所述，相較于由抑制引物和參考序列編碼鏈所形成的雜交體，由抑制引物和變體序列編碼鏈所形成雜交體較不穩(wěn)定；因此抑制引物和變體序列編碼鏈所形成的雜交體較易變性，因而使得正向引物有機(jī)會(huì)退火至此種變異的編碼鏈，并形成相對(duì)較穩(wěn)定的雜交體。因而，在后續(xù)的延伸步驟中，能夠擴(kuò)增選定區(qū)域中帶有變異核苷的目標(biāo)基因；而帶有和抑制引物退火的參考序列之目標(biāo)基因鏈則不會(huì)擴(kuò)增。
[0056]在非必要的實(shí)施方式中，退火步驟包含兩個(gè)階段。在第一退火階段中，所用的第一退火低于(或接近)抑制引物解鏈溫度且高于正向引物解鏈溫度。在這種情形下，只有抑制引物可和編碼鏈雜交，而正向引物則不會(huì)和編碼鏈雜交。其后，在第二退火階段中，進(jìn)一步將混合物冷卻至第二退火溫度，此溫度低于(或接近)正向引物解鏈溫度，因而使得正向引物可和編碼鏈雜交。然而，在設(shè)計(jì)時(shí)，使得正向引物的3’端和抑制引物的5’端重疊。因而，當(dāng)抑制引物已經(jīng)在第一退火階段中和編碼鏈形成較穩(wěn)定的雜交體時(shí)，在正向引物的3’端會(huì)出現(xiàn)分岔結(jié)構(gòu)(參見(jiàn)第I圖)，而使得所形成之正向引物與編碼鏈的雜交體相對(duì)較不穩(wěn)定。換句話說(shuō)，對(duì)于選定區(qū)域內(nèi)不具有插入/缺失突變的參考模板鏈，抑制引物會(huì)穩(wěn)定地退火至參考編碼鏈，且因而可抑制核苷酸在后續(xù)步驟中延伸。另一方面，當(dāng)選定區(qū)域內(nèi)存有變異的核苷酸時(shí)，由抑制引物和此變異編碼鏈所形成的雜交體相對(duì)較不穩(wěn)定，而容易變性，因而使得正向引物有機(jī)會(huì)退火至此種變異的編碼鏈并形成相對(duì)穩(wěn)定的雜交體。因而，在后續(xù)延伸步驟中能夠擴(kuò)增選定區(qū)域內(nèi)帶有變異核苷的目標(biāo)基因；而帶有和抑制引物退火的參考序列之目標(biāo)基因則不會(huì)擴(kuò)增。
[0057]在退火步驟之后，將溫度調(diào)整到延伸溫度，以使得核苷酸能夠延伸。理想的延伸溫度為本領(lǐng)域所熟知；一般來(lái)說(shuō)，延伸溫度約為70-80°C。然而,在考慮相關(guān)因素(如所用的聚合酶種類)后，亦可采用其它溫度。
[0058]之后使反應(yīng)混合物在變性、退火與延伸等步驟間循環(huán)，以持續(xù)擴(kuò)增目標(biāo)基因(特別是，選定區(qū)域中帶有變異核苷的目標(biāo)基因)。此處提出的PCR處理可運(yùn)用于任何已知的PCR熱循環(huán)裝置(thermocycler)及其均等物。此外,此處提出的PCR式方法兼容于大多數(shù)的既有PCR處理。因而，能夠?qū)⒈痉椒ㄟ\(yùn)用于各種PCR技術(shù)，包括但不限于非對(duì)稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(asymmetric PCR)、熱啟動(dòng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(hot start PCR)、迷你引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(miniprimer PCR)、多引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(multiplex-PCR)、嵌套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(nested PCR),實(shí)時(shí)定量PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reversetranscript1n PCR)、固相聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(solid phase PCR)與遞減聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(touchdown PCR)。
[0059]本方法亦包含PCR產(chǎn)物之檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式，存有PCR產(chǎn)物表示目標(biāo)基因之選定區(qū)域內(nèi)有一或多插入/缺失變異；而沒(méi)有PCR產(chǎn)物表示目標(biāo)基因之選定區(qū)域內(nèi)沒(méi)有插入/缺失變異。
[0060]相關(guān)領(lǐng)域已有多種技術(shù)可用以決定PCR產(chǎn)物存在與否；這些技術(shù)包括但不限于:電泳(gel electrophoresis)、突光共振倉(cāng)泛量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonant energytransfer)以及標(biāo)記探針雜交(hybridizat1n to a labeled probe)。所述的標(biāo)記探針可帶有至少一種以下標(biāo)記:生物素(b1tin)、突光基團(tuán)(fluorescent moiety)、抗原(antigen)分子量標(biāo)簽(molecular weight tag)以及探針解鏈溫度修飾基(modifier ofprobe Tm)。此外,亦可在延伸步驟中加入一標(biāo)記(如,突光或放射性標(biāo)記)，以標(biāo)記PCR產(chǎn)物。所述的檢測(cè)步驟包含測(cè)量突光強(qiáng)度(fluorescence)、分子量(mass)、電量(charge)和/或化學(xué)突光強(qiáng)度(chemiluminescence)?？稍赑CR過(guò)程中進(jìn)行此一檢測(cè)步驟(^[JRT-PCR),或可在PCR過(guò)程完成后進(jìn)行檢測(cè)。
[0061]下文舉出多種實(shí)施例來(lái)闡明本發(fā)明之部分方面，以使本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】中具有通常知識(shí)者能藉以實(shí)踐本發(fā)明。因此不應(yīng)將這些實(shí)施例視為對(duì)本發(fā)明范圍之限制。本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】中具有通常知識(shí)者基于此處提的說(shuō)明，當(dāng)可在不需過(guò)度推衍的情形下運(yùn)用本發(fā)明。此處提及的所有文獻(xiàn)，皆視為已完全引用而成為本說(shuō)明書(shū)的一部份。
[0062]實(shí)施例1
[0063]檢測(cè)EGFR外顯子19的插入/缺失突變
[0064]由馬偕醫(yī)院(臺(tái)灣)取得總計(jì)134個(gè)臨床樣本，樣本采集均經(jīng)過(guò)患者的告知后同意。處理樣本以分離其中的核酸分子。在初期實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)行Unidel-PCR擴(kuò)增所用的試劑如T =PCR 2X Master Mix 緩沖液(JMR) 20 μ 1、0.2 μ M 正向引物(SEQ ID NO:3)、2 μ M抑制引物(SEQ ID NO:2)、0.2 μ M 反向引物(AGCAGCTGCCAGACATGAGA ；SEQ ID NO:19)、與分離的DNA (野生型或突變株)I μ I (105份)或模板DNA 100 ng，加水使最終體積為20 μ I。利用ABI 9700 PCR設(shè)備進(jìn)行PCR，反應(yīng)中所用的循環(huán)條件為:變性溫度95°C持續(xù)10分鐘；之后溫度循環(huán)為94°C (60秒)、60°C (60秒)與72°C (60秒)，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)；最后在72°C (10分鐘)下進(jìn)行延伸。
[0065]在PCR完成后，自PCR槽中取出一樣本，并在洋菜膠上進(jìn)行電泳分離。樣本與對(duì)照標(biāo)記皆以溴化乙錠(ethidium bromide, EtBr)染色并以突光檢測(cè)顯影，同時(shí)以電荷I禹合組件相機(jī)擷取影像。將洋菜膠上的產(chǎn)物帶切下，并對(duì)其中所含的核酸測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示利用此處提出的Unidel-PCR方法可以檢測(cè)到多種EGFR外顯子19的變體；表一摘要整理了這些突變株的突變序列、突變位置以及受突變影響的氨基酸殘基。野生型EGFR外顯子19的序列包含SEQ ID NO:10所示的序列(即EGFR外顯子19的第2214至2261個(gè)核苷酸)。
[0066]表一
[0067]
seqidI核:酸位I ^ 突變類型I NO__S____列
122235-2249GGAATTAAGAGAAGC缺失E746-A750
132236-2250GAATTAAGAGAAGCA缺失E746-A750
142239-2247TTAAGAGAAC缺失747-P749，A750P
[0068]

【權(quán)利要求】
1.一種基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain react1n, PCR)的方法,用以檢測(cè)一樣本中一目標(biāo)基因之一選定區(qū)域內(nèi)相對(duì)于一參考序列是否有插入或缺失變異，包含以下步驟: (a)形成一混合物，其包含該樣本與一引物組，其中該樣本中的該目標(biāo)基因包含一模板鏈，以及一編碼鏈其與該模板鏈互補(bǔ)，且該引物組包含: (i)一抑制引物，其包含一序列，此序列與該模板鏈之該選定區(qū)域的序列以及緊接于該模板鏈之該選定區(qū)域之前的至少一核苷酸殘基相同，其中該抑制引物之3’端經(jīng)修飾以防止該抑制引物于該P(yáng)CR過(guò)程中延伸；以及 (?) 一正向引物，其包含一序列，此序列與位于該模板鏈之該選定區(qū)域上游之多個(gè)核苷酸殘基相同，其中該正向引物之3’端的至少最后一個(gè)核苷酸殘基與該抑制引物之5’端的至少第一個(gè)核苷酸殘基相同； (b)對(duì)該混合物依序進(jìn)行以下步驟:一變性步驟、一退火步驟、及一延伸步驟，其中于該退火步驟中，該正向引物與該抑制引物競(jìng)爭(zhēng)以退火至該編碼鏈；以及 (c)決定經(jīng)過(guò)步驟(a)與(b)后是否得到一PCR產(chǎn)物，其中該P(yáng)CR產(chǎn)物之存在表示該樣本中該目標(biāo)基因之該選定區(qū)域內(nèi)存有該插入或缺失變異，且該P(yáng)CR產(chǎn)物的不存在表示該樣本中該目標(biāo)基因之該選定區(qū)域內(nèi)不存有該插入或缺失變異。
2.如權(quán)利要求1所述之方法，其中于該混合物中，該抑制引物與該正向引物所用的摩爾比為約1:1至10:lo
3.如權(quán)利要求1所述之方法，其中該正向引物之解鏈溫度與該抑制引物之解鏈溫度不同。
4.如權(quán)利要求3所述之方法，其中該正向引物與該抑制引物之解鏈溫度分別大于等于.50
5.如權(quán)利要求1所述之方法，其中該抑制引物的長(zhǎng)度為10-100個(gè)核苷酸。
6.如權(quán)利要求1所述之方法，其中該正向引物的長(zhǎng)度為10-30個(gè)核苷酸。
7.如權(quán)利要求1所述之方法，其中該正向引物之3’端的至少最后5到10個(gè)核苷酸殘基與該抑制引物之5’端的至少前5-10個(gè)核苷酸殘基相同。
8.如權(quán)利要求1所述之方法，其中該抑制引物之3’端經(jīng)過(guò)一磷酸基、一磷酸酯、一反向.3’ -3’連接、一 2’，3’ - 二脫氧核苷或一 3’脫氧核苷之修飾。
9.如權(quán)利要求1所述之方法，其中: 該選定區(qū)域之該參考序列為T(mén)AAGAGAAGC(SEQ ID NO:1)； 該抑制引物包含一 CGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCC 序列(SEQ ID NO:2);以及 該正向引物包含一 AATTCCCGTCGCTATCAA 序列(SEQ ID NO:3)。
10.如權(quán)利要求1所述之方法，其中: 該選定區(qū)域之該參考序列為CCCAGAGCCTC(SEQ ID NO:4)； 該抑制引物包含一 CTGGTCCCAGAGCCTCGC序列(SEQ ID NO:5);以及 該正向引物包含一 GCATTCCTGCCCCTGGT 序列(SEQ ID NO:6)。
11.如權(quán)利要求1所述之方法，其中: 該選定區(qū)域之該參考序列為 TGCGGCGGGTCTTACTCACCTTTTAACTTAAAGAGAACTACGGGTTCACGATGGGGTCAGGATAACAAAAATCTTTGATCTAGAATGCACT(SEQ ID NO:7)；該抑制弓 I 物包含一 GTAACCCCTTGCGGCGGGTCTTACTCACCTTTTAACTTAAAGAGAACTACGGGTTCACGATGGGGTCAGGATAACAAAAATCTTTGATCTAGAATGCACT 序列(SEQ ID NO:8)；以及該正向引物包含一 AGGCTAGCGTAACCCCT 序列(SEQ ID NO:9)。
12.一種引物組，用以經(jīng)過(guò)PCR來(lái)檢測(cè)一目標(biāo)基因之一選定區(qū)域內(nèi)相對(duì)于一參考序列是否有插入或缺失變異，該目標(biāo)基因具有一模板鏈以及與該模板鏈互補(bǔ)的一編碼鏈，該引物組包含: (i)一抑制引物，其包含一序列，此序列與該模板鏈之該選定區(qū)域的該參考序列以及緊接于該模板鏈之該選定區(qū)域之前的至少一核苷酸殘基相同，其中該抑制引物之3’端經(jīng)修飾以防止該抑制引物于該P(yáng)CR過(guò)程中延伸；以及 (?)一正向引物，其包含一序列，此序列與位于該模板鏈之該選定區(qū)域上游之多個(gè)核苷酸殘基相同，其中該正向引物之3’端的至少最后一個(gè)核苷酸殘基與該抑制引物之5’端的至少第一個(gè)核苷酸殘基相同。
13.如權(quán)利要求12所述之引物組，其中該抑制引物之3’端經(jīng)過(guò)一磷酸基、一磷酸酯、一反向3’ -3’連接、一 2’，3’ - 二脫氧核苷或一 3’脫氧核苷之修飾。
14.如權(quán)利要求12所述之引物組，其中該正向引物之解鏈溫度與該抑制引物之解鏈溫度不同。
15.如權(quán)利要求14所述之引物組，其中該正向引物與該抑制引物之解鏈溫度分別大于等于50°C。
16.如權(quán)利要求12所述之引物組，其中該抑制引物的長(zhǎng)度為10-100個(gè)核苷酸。
17.如權(quán)利要求12所述之引物組，其中該正向引物的長(zhǎng)度為10-30個(gè)核苷酸。
18.如權(quán)利要求12所述之引物組，其中該正向引物之3’端的至少最后5到10個(gè)核苷酸殘基與該抑制引物之5’端的至少前5-10個(gè)核苷酸殘基相同。
19.如權(quán)利要求12所述之引物組，其中: 該選定區(qū)域之該參考序列為T(mén)AAGAGAAGC(SEQ ID NO:1)； 該抑制引物包含一 CGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCC 序列(SEQ ID NO:2);以及 該正向引物包含一 AATTCCCGTCGCTATCAA 序列(SEQ ID NO:3)。
20.如權(quán)利要求12所述之引物組，其中: 該選定區(qū)域之該參考序列為CCCAGAGCCTC(SEQ ID NO:4)； 該抑制引物包含一 CTGGTCCCAGAGCCTCGC序列(SEQ ID NO:5);以及 該正向引物包含一 GCATTCCTGCCCCTGGT 序列(SEQ ID NO:6)。
21.如權(quán)利要求12所述之引物組，其中: 該選定區(qū)域之該參考序列為 TGCGGCGGGTCTTACTCACCTTTTAACTTAAAGAGAACTACGGGTTCACGATGGGGTCAGGATAACAAAAATCTTTGATCTAGAATGCACT(SEQ ID NO:7)； 該抑制弓 I 物包含一 GTAACCCCTTGCGGCGGGTCTTACTCACCTTTTAACTTAAAGAGAACTACGGGTTCACGATGGGGTCAGGATAACAAAAATCTTTGATCTAGAATGCACT 序列(SEQ ID NO:8)；以及該正向引物包含一 AGGCTAGCGTAACCCCT 序列(SEQ ID NO:9)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104185683SQ201180076166
【公開(kāi)日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月30日
【發(fā)明者】黃志凱, 陳冀寬, 王道遠(yuǎn) 申請(qǐng)人:黃志凱, 陳冀寬, 王道遠(yuǎn)