一種用于檢測(cè)大豆脂肪酸脫氫酶合成基因b1型突變的引物組及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)大豆脂肪酸脫氫酶合成基因B1型突變的引物組及應(yīng) 用，屬于植物分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)和作物分子輔助選擇技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆為人類提供重要的植物油份，并且大豆的含油量是大豆最重要的經(jīng)濟(jì)性狀。 商品大豆油主要包括大約11 %的軟脂酸（16:0)，4%的硬脂酸（18:0)，25%的油酸（18:1)， 52%的亞油酸（18:2)和4%的亞麻酸（18:3) (Fehr，2007)。中國(guó)各地區(qū)的氣候、土壤、水質(zhì) 等自然條件以及品種選育方向均存在差異，為大豆種質(zhì)資源品質(zhì)特性的豐富變異創(chuàng)造了條 件，有利于篩選優(yōu)異脂肪酸組成的大豆種質(zhì)（蓋均鎰等，2001)。不飽和脂肪酸為人體必需 脂肪酸，在人體新陳代謝中具有重要的生理功能，油酸可有效降低血液中總膽固醇和有害 膽固醇含量，營(yíng)養(yǎng)學(xué)家稱之為"安全脂肪酸"，亞油酸具有抑制癌癥，預(yù)防糖尿病和減少體內(nèi) 脂肪，減少血液中膽固醇量，防止動(dòng)脈硬化的作用，亞麻酸具有溶血栓，降血壓防血小板凝 集，健腦抗衰老等作用（陳學(xué)珍，2004)。在大豆油脂中的不飽和脂肪酸具有重要的生理保 健作用，不飽和脂肪酸中油酸的穩(wěn)定性最好，提高其含量可以延長(zhǎng)貯藏期，但由于亞油酸和 亞麻酸分別含有2, 3個(gè)不飽和雙鍵，容易使油脂氧化變質(zhì)，造成豆油及其食品味道不佳，營(yíng) 養(yǎng)價(jià)值降低。另外，由于飽和脂肪酸能量低，不易消化吸收，過(guò)多食用會(huì)導(dǎo)致肥胖病和心血 管疾?。盍?，2006)。因此，提高油酸含量，降亞油酸含量是大豆品質(zhì)育種的重要目標(biāo)之 〇
[0003] 在油脂的合成途徑中，脂肪酸脫氫酶2 (FAD2)在油酸前體向亞油酸前體的轉(zhuǎn)變過(guò) 程中起到了至關(guān)重要的作用（Okuley等，1994 ;Schlueter等，2007)，在發(fā)育的大豆種子中， 2 個(gè)脂肪酸脫飽和酶GmFAD2-lA(Glymal0g42470)和GmFAD2-lB(Glyma20g24530)表達(dá)水平 最高，因此這2個(gè)基因被認(rèn)為是控制大豆油酸含量的候選基因，并且越來(lái)越多的研宄者通 過(guò)改造這2個(gè)目標(biāo)基因來(lái)培育高油酸含量的優(yōu)質(zhì)大豆品種?；蚬こ毯秃蜻x基因分子育種 策略被用來(lái)培育高于80%油酸含量的優(yōu)質(zhì)大豆（Buhr等，2002 ;H〇shin〇等，2010 ;Pham等， 2010)，這些研宄成果證明了在GmFAD2-lA和GmFAD2-lB基因中的突變程度越嚴(yán)重，大豆油 脂中的油酸含量越高，同時(shí)油脂的穩(wěn)定性也越強(qiáng)。
[0004] 我國(guó)作為大豆的發(fā)源地，具有豐富的大豆種質(zhì)資源。目前，我國(guó)作物種質(zhì)資源庫(kù)己 保存的大豆種質(zhì)資源達(dá)3萬(wàn)余份，居世界之首（汪越勝，2002)。然而利用傳統(tǒng)的油分鑒定 方法對(duì)數(shù)目龐大的大豆資源進(jìn)行鑒定工作量大，周期長(zhǎng)，目前尚沒(méi)有一種能夠快速并且準(zhǔn) 確地檢測(cè)控制大豆高油酸含量的B1型突變位點(diǎn)的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)大豆脂肪酸脫氫酶合成基因B1型 突變的引物組，所采取的技術(shù)方案如下：
[0006] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種用于檢測(cè)大豆脂肪酸脫氫酶合成基因B1型突變 的引物組，該引物組的核苷酸如SEQIDNO. 1-SEQIDNO. 5所示。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用所述引物組快檢測(cè)大豆脂肪酸脫氫酶合成 基因B1型突變的方法，該方法是以待測(cè)樣品的DNA為模板，以如SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 2 所述序列為引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，稀釋擴(kuò)增產(chǎn)物后，再以稀釋后的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以 如SEQ ID NO. 3-SEQ ID NO. 5所述序列為引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，最后利用高分辨率熔 解曲線分析儀器對(duì)第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因型突變檢測(cè)。
[0008] 所述方法的步驟如下：
[0009] 1)提取待鑒定材料的DNA ;
[0010] 2)以步驟1)所得的DNA為模板，以如SEQIDNO. 1-SEQIDNO. 2所述序列為引物 進(jìn)行第一輪PCR巢式擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物后，進(jìn)行稀釋處理；
[0011] 3)以步驟2)中稀釋后的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以如SEQIDNO. 3-SEQIDNO. 5所述序 列為引物進(jìn)行第二輪巢式PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后獲得第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0012] 4)利用20礦物油將步驟3)所得的第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物覆蓋成混合樣品，再利用高分 辨率熔解曲線分析儀器對(duì)第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物的基因型突變進(jìn)行檢測(cè)。
[0013] 優(yōu)選地，步驟2)所述第一輪巢式PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94°C預(yù)變性4min，94°C變 性40s，56°C退火30s，72°C延伸15s，共35個(gè)循環(huán)，再72°C延伸4min，4°C保溫；所述稀釋處 理，是利用ddH20稀釋10倍。
[0014] 優(yōu)選地，步驟3)所述第二輪巢式PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94°C預(yù)變性4min，94°C變 性4〇8,56.8°0退火3〇8,72°0延伸1〇8，共15個(gè)循環(huán)，再721：延伸4111111，41：保溫。
[0015] 優(yōu)選地，步驟4)所述利用高分辨率熔解曲線分析儀器對(duì)第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物的基因 型突變進(jìn)行檢測(cè)，是根據(jù)目標(biāo)片段的GC含量的變化在不同熔解溫度出現(xiàn)吸收峰的位置判 定，突變株的GC含量下降，熔解溫度降低，吸收峰在左側(cè)；野生型GC含量增加，熔解溫度升 高，吸收峰在右側(cè)；雜合型的GC含量居中，吸收峰位于中間溫度。
[0016] 所述方法的具體步驟如下：
[0017] 1)提取待鑒定材料的DNA ;
[0018] 2)以步驟1)所得的DNA為模板，以如SEQIDNO. 1-SEQIDNO. 2所述序列為引 物進(jìn)行第一輪PCR巢式擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94°C預(yù)變性4min，94°C變性40s，56°C退火30s， 72°C延伸15s，共35個(gè)循環(huán)，再72°C延伸4min，4°C保溫；所述稀釋處理，是利用ddH20稀釋 10倍；
[0019] 3)以步驟2)中稀釋后的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以如SEQIDNO. 3-SEQIDNO. 5所述序 列為引物進(jìn)行第二輪巢式PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94°C預(yù)變性4min，94°C變性40s，56.8°C退 火30s，72°C延伸10s，共15個(gè)循環(huán)，再72°C延伸4min，4°C保溫，擴(kuò)增結(jié)束后獲得第二輪擴(kuò) 增產(chǎn)物；
[0020] 4)利用20礦物油將步驟3)所得的第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物覆蓋成混合樣品，再利用高分 辨率熔解曲線分析儀器對(duì)第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物的基因型突變進(jìn)行檢測(cè)，并將所得熔解曲線與野 生型和雜合型樣品的熔解曲線進(jìn)行對(duì)比，當(dāng)待測(cè)樣品的熔解溫度降低，熔解曲線位于野生 型和雜合型樣品的左側(cè)時(shí)，該待測(cè)樣品即為B1型突變株。
[0021] 所述任一方法用于大豆的遺傳育種。
[0022] 利用所述引物組制備的檢測(cè)試劑盒。
[0023] 所述試劑盒用于篩選和鑒定大豆脂肪酸脫氫酶合成基因B1型突變體。
[0024] 本發(fā)明獲得的有益效果如下：
[0025] 本發(fā)明是在克隆出的大豆脂肪酸脫氫酶合成基因GmFAD2_lB基礎(chǔ)上，通過(guò)比較高 油酸大豆B1和普通油酸含量大豆BAY的GmFAD2-lB基因序列，首次發(fā)現(xiàn)了位于409bp處的 單堿基突變（C-G)，且該突變導(dǎo)致油酸含量變化。
[0026] 本發(fā)明針對(duì)B1突變位點(diǎn)開(kāi)發(fā)了2套分子標(biāo)記（外部引物和內(nèi)部引物，引物如序列 表表1)進(jìn)行巢式PCR以確保擴(kuò)增的特異性，并利用高分辨率熔解曲線分析儀器進(jìn)行突變位 點(diǎn)檢測(cè)。本發(fā)明開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記的使用方法為：首先利用外部引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，隨 后將PCR產(chǎn)物稀釋10倍作模板，且以內(nèi)部引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，最后將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移 至高分辨率熔解曲線分析儀器中進(jìn)行基因型突變檢測(cè)。該突變位點(diǎn)的分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)對(duì)于高 油酸大豆的分子標(biāo)記輔助選擇具有重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1為大豆脂肪酸脫氫