本發(fā)明涉及微生物菌種及其應(yīng)用的
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體的涉及一種新的鎖擲酵母MI-1及其在溶煤中應(yīng)用的
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：我國常規(guī)能源資源總量為6.23萬億噸標(biāo)準(zhǔn)煤，其中原煤5.57萬億噸，占89.3％。從數(shù)據(jù)可知我國能源結(jié)構(gòu)與其它國家顯著不同，我國的煤炭在能源資源中具有絕對優(yōu)勢地位。其中，新疆煤炭的預(yù)測儲量約2.19萬億噸，占全國總儲量的40％以上，居全國首位。而在這些煤炭資源中，低階煤占了相當(dāng)高的比例。低階煤是處于低變質(zhì)階段的煤，其定義是Qgr.maf<24MJ/kg的煤。在低階煤中風(fēng)化煤儲量十分豐富。風(fēng)化煤是出露于地表或埋藏于淺部的褐煤，煙煤、無煙煤長期經(jīng)受自然環(huán)境以及礦物質(zhì)侵蝕等綜合作用后的產(chǎn)物，風(fēng)化了的煤的化學(xué)和物理性質(zhì)都發(fā)生了極為明顯的改變，氧化嚴(yán)重，含有的脂肪烴和含氧官能團(tuán)較多，其水分增加，顏色變淺，光澤變暗，揮發(fā)分增加，機(jī)械強(qiáng)度、發(fā)熱量、粘結(jié)性、著火點都降低；其元素組分也發(fā)生重大變化：碳和氫的含量減少，羧基、酚羥基、醌基、醇羥基等多種含氧活性官能團(tuán)增加，再生腐殖酸也明顯增加。風(fēng)化煤直接燃燒時熱效率極低，若長期露天堆放，會造成能源的浪費，而且易引起環(huán)境污染。雖然風(fēng)化煤利用率低，但卻是腐植酸的重要來源之一，大部分風(fēng)化煤的總腐植酸含量在40％左右，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。目前對風(fēng)化煤的開發(fā)利用很有限，通常采用的是物理、化學(xué)方法，需要在外加一定的壓力、一定的溫度等條件下來進(jìn)行。從整個過程來看，成本較高、條件苛刻，還會產(chǎn)生一系列的環(huán)境問題。采用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)來處理煤炭，使之轉(zhuǎn)化成另一種產(chǎn)品，或者從中提取化工品，或作為其它類物質(zhì)，具有工藝簡單、低能耗、無污染等許多常規(guī)處理技術(shù)難以比擬的優(yōu)點。因此利用微生物開發(fā)、利用低階煤資源成為國內(nèi)外研究的熱點。目前有許多利用鎖擲酵母進(jìn)行開發(fā)利用的報道，公開號為CN102115716A的中國專利(一種鎖擲酵母菌株及其應(yīng)用)，該專利主要是提供一種鎖擲酵母菌及其在發(fā)酵制備類胡蘿卜素中的應(yīng)用，并提供了制備類胡蘿卜素方法；公開號為CN102766580B的中國專利(一株產(chǎn)生物表面活性劑的酵母菌株及其應(yīng)用)，該專利提供的鮭色鎖擲酵母菌株能夠以C10-C24烷烴和/或多環(huán)芳烴為碳源進(jìn)行生長，在降解含有疏水性有機(jī)污染物廢水方面具有工業(yè)化的前景，風(fēng)化煤成分復(fù)雜，既不屬于C10-C24烷烴，也不屬于多環(huán)芳烴，該專利也沒有披露鮭色鎖擲酵母菌株能夠用于降解風(fēng)化煤?，F(xiàn)有專利或期刊中都沒有披露鎖擲酵母可以降解風(fēng)化煤，也沒有提供一種能夠有效降解風(fēng)化煤的鎖擲酵母菌株，因此需要進(jìn)一步探究鎖擲酵母的特性，提供能夠用于降解風(fēng)化煤的方法，對于微生物利用開發(fā)
技術(shù)領(lǐng)域：
具有現(xiàn)實意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)中尚未記載有關(guān)鎖擲酵母在風(fēng)化煤降解方面應(yīng)用的技術(shù)現(xiàn)狀，且現(xiàn)有風(fēng)化煤開發(fā)方法存在成本高、條件苛刻、污染嚴(yán)重等一系列問題，本發(fā)明旨在為風(fēng)化煤開發(fā)提供具有溶煤效果好且性能穩(wěn)定的新的菌株，提供一種新菌種鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1及其在風(fēng)化煤降解中的應(yīng)用。本發(fā)明通過在新疆克拉瑪依油田附近被污染的土壤中分離篩選出一株鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1CGMCCNo.13159，利用分離出的菌種制備溶煤制劑，應(yīng)用到低階風(fēng)化煤中，具有穩(wěn)定和顯著的降解效果，對于微生物菌種應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
具有廣泛的應(yīng)用價值。本發(fā)明采用的主要技術(shù)方案：本發(fā)明具體提供一種鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1CGMCCNo.13159。通過從新疆克拉瑪依油田附近地下5-10cm被污染的土壤中分離取樣，篩選出一株鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1，該菌對一號風(fēng)化煤的轉(zhuǎn)化率為24.32％，對三號風(fēng)化煤的轉(zhuǎn)化率為28.06％，具有顯著的降解效果穩(wěn)定的特性。本發(fā)明根據(jù)新疆地理環(huán)境的特殊性和新疆煤炭資源富集的特點，通過從新疆克拉瑪依油田附近被污染的土壤中進(jìn)行微生物菌種的培養(yǎng)、分離，篩選一批優(yōu)良菌種，并從中分離篩選出一株編號為MI-1的鎖擲酵母(Sporidiolussp.)，經(jīng)微生物學(xué)分類與鑒定，屬于鎖擲酵母屬，該菌株最適生長條件為：溫度25℃，最高生長溫度為30℃，培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，pH＝7，培養(yǎng)時間為48-72h。參照《真菌鑒定手冊》等對菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化試驗，確定MI-1菌株為鎖擲酵母屬中成員，但是具有與常見的鎖擲酵母屬成員菌種不同的特點，具有一些新菌種的特性。通過對上述菌種基因測序，序列參見附后提供的SEQUENCELISTING，經(jīng)16SRNA同源分析、系統(tǒng)發(fā)育分析，通過BLAST同源比對，確定與實驗菌株親緣關(guān)系最近的種屬。從數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)種屬的序列，并結(jié)合真菌生物多樣性研究中心數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行聚類分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。MI-1菌株歸屬于鎖擲酵母(Sporidiolussp.)菌株MI-1與該屬模式菌株序列比對最高同源性為99％(SporidiobolusmetaroseusKX376263.1)，與該屬其它菌株同源性均低于99％，初步確定其為鎖擲酵母屬(Sporidiolussp.)新種，具有新菌種典型性的特點，從分類學(xué)角度暫命名為鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1。已于申請日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國際保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101。保藏日期2016年10月27日，菌種保藏號為CGMCCNo.13159。經(jīng)微生物學(xué)鑒定暫命名為鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1。菌株在PDA培養(yǎng)基上，菌落表面光滑、濕潤粘稠，邊緣齊整，菌體大小不等，符合酵母菌菌落特征。菌株細(xì)胞呈球形至橢圓形，有明顯的出芽生殖特征。顯微鏡下觀察，該菌株產(chǎn)生了假菌絲。生殖方式主要是不對稱擲孢子、芽殖。同時，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種利用鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1CGMCCNo.13159制備溶煤制劑的方法，具體步驟如下：液體溶煤制劑：篩選出的菌株MI-1接到裝有10mLPDA液體培養(yǎng)基的試管中，在30℃、150r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)24-36h后，試管中加10mL無菌水劇烈振蕩后，經(jīng)適當(dāng)稀釋制備成含有106個孢子懸浮液。吸取上述孢子懸浮液1mL，接種于PDA液體培養(yǎng)基中，25℃、150rpm培養(yǎng)96h，得到種子液。按3％-5％接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在pH＝7、25℃-30℃、150rpm條件下培養(yǎng)4d—5d，收獲菌體及發(fā)酵液。該發(fā)酵液密封包裝，即可獲得溶煤制劑。固體溶煤制劑：篩選出的菌株MI-1接到裝有10mLPDA液體培養(yǎng)基的試管中，在30℃、150r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)24-36h后，試管中加10mL無菌水劇烈振蕩后，經(jīng)適當(dāng)稀釋制備成含有106個孢子懸浮液。吸取上述孢子懸浮液1mL，接種于PDA液體培養(yǎng)基中，25℃、150rpm培養(yǎng)96h，得到種子液。按3％-5％接種量接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基，25℃-30℃，固體發(fā)酵4d—5d，至菌絲長滿固體培養(yǎng)基，上層有大量孢子產(chǎn)生，即可獲得固體溶煤制，密封保存。本發(fā)明進(jìn)一步提供利用鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1CGMCCNo.13159制備風(fēng)化降解煤的方法，具體方法如下：(1)使用本發(fā)明提供的一種鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1CGMCCNo.13159發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液在10000r/min的條件下離心10min，離心后再將發(fā)酵液通過微孔濾膜過濾；(2)過濾后在發(fā)酵液中加入過量濃鹽酸，直到發(fā)酵液的pH一直保持在2以下；(3)將上述步驟獲得的發(fā)酵液在10000r/min的條件下離心10min，離心后再將發(fā)酵液通過微孔濾膜過濾，最終獲得沉淀，沉淀即為降解產(chǎn)物。進(jìn)一步，本發(fā)明提供鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1CGMCCNo.13159制備溶煤制劑在風(fēng)化煤降解中的應(yīng)用，制備的溶煤制劑能有效降解低階風(fēng)化煤，具有廣泛的應(yīng)用價值。通過實施本發(fā)明提供上述具體技術(shù)方案，實施本
發(fā)明內(nèi)容，可以達(dá)到以下有益效果：(1)本發(fā)明提供的鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1CGMCCNo.13159是一種典型的新菌種可在PDA培養(yǎng)基上生長，最適生長溫度為25℃，最高生長溫度為30℃，最適pH＝7，培養(yǎng)時間為48-72h，具有較高的煤降解特性，同時具有培養(yǎng)條件簡單，繁殖快的特點，初步確定其為鎖擲酵母屬(Sporidiolussp.)新種，具有新菌種典型性的特點，從分類學(xué)角度暫命名為鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1。(2)將本發(fā)明分離篩選的鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1CGMCCNo.13159通過發(fā)酵技術(shù)獲得的溶煤制劑，應(yīng)用到一號風(fēng)化煤和三號風(fēng)化煤中，對一號風(fēng)化煤的轉(zhuǎn)化率為24.32％，對三號風(fēng)化煤的轉(zhuǎn)化率為28.06％，具有穩(wěn)定和顯著的降解效果，降解后煤的總腐值酸含量為34.6％，具有廣泛的應(yīng)用價值。附圖說明圖1所示為菌株鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1CGMCCNo.13159的系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖。圖2所示為菌株鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1CGMCCNo.13159為空白組與三號風(fēng)化煤的降解對比效果圖，其中A為空白對照組，B表示添加培養(yǎng)基和煤的試驗組2，C、D、E均表示添加培養(yǎng)基、煤和鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1的試驗組3、試驗組4、試驗組5。圖3所示為菌株鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1CGMCCNo.13159對一號風(fēng)化煤降解后的效果圖。具體實施方式下面，舉實施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實施例。本發(fā)明中選用的所有原輔材料，以及選用的菌種培養(yǎng)方法都為本領(lǐng)域熟知選用的，本發(fā)明中涉及到的％都為重量百分比，除非特別指出除外。本發(fā)明實施例中采用如下基礎(chǔ)培養(yǎng)基：本發(fā)明采用的樣品：克拉瑪依油田附近地下5-10cm被污染的土壤。培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基即馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，包括馬鈴薯浸粉6g、葡萄糖20g、瓊脂20g和蒸餾水1000ml，pH＝5.6±0.2；CZAPECKDOX—medium培養(yǎng)基包括谷氨酸鈉20g、硝酸鈉30g、葡萄糖10g、磷酸氫二鉀2g、硫酸鎂0.5g、氯化鉀0.5g和蒸餾水1000ml，pH＝7.0。主要儀器與試劑：MLS-3020高壓蒸汽滅菌鍋，E360K離心機(jī)，MSSPX-250型生化培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床HWY-100.PCR儀EppendorfNo:5345，SW-CJ-1FB型單人雙面凈化工作臺，電泳儀Bio-RadMode200/2.0，凝膠成像儀United-Bio，GK-330Cplus，其余試劑均為分析純，三號風(fēng)化煤煤粉(從新疆雙龍腐植酸有限公司購買獲得)，一號風(fēng)化煤(從新疆雙龍腐植酸有限公司購買獲得)。實施例一：鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1的分離、篩選及鑒定1、分離、純化：從新疆克拉瑪依油田附近地下5-10cm被污染的土壤中分離得到。稱取5g樣品，用滅菌的研缽磨碎后加入到裝有50mL無菌水的錐形瓶中，于30℃、150r/min的搖床上震蕩搖勻。將處理過的土壤樣品稀釋至10-3、10-4、10-5，將稀釋后的不同梯度的樣品溶液各取200μL，用涂布棒均勻的涂在PDA培養(yǎng)基上，放入培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)2-3d，待菌落長好后，挑取平板上不同形態(tài)且生長良好的單菌落，反復(fù)劃線直到獲得純菌株。經(jīng)過初步篩選，一共獲得61株具有溶煤功能的菌株，用改性的CZAPECKDOX—medium培養(yǎng)基進(jìn)行再次篩選，得到了菌株MI-1。篩選出的菌株MI-1接到裝有10mLCZAPECKDOX—medium培養(yǎng)基的試管中，在30℃、150r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)24-36h后，稱取0.3g三號風(fēng)化煤煤粉加入菌液中，在30℃、150r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)，培養(yǎng)72h后觀察到培養(yǎng)基顏色較發(fā)酵前有所加深，呈紅褐色甚至黑色。該菌株最適生長條件為：溫度25℃，培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，pH＝7，培養(yǎng)時間：48-72h。菌落表面光滑、濕潤、粘稠，容易挑起，菌落質(zhì)地均勻，正反面和邊緣、中央部位的顏色都很均一，菌落為橙紅色。參照《真菌鑒定手冊》進(jìn)行分類鑒定，初步經(jīng)鑒定菌株MI-1屬于鎖擲酵母(Sporidiolussp.)，具有與常見的鎖擲酵母屬成員菌種不同的特點，具有鮮明的新菌種特性。菌株在PDA培養(yǎng)基上，菌落表面光滑、濕潤粘稠，邊緣齊整，菌體大小不等，符合酵母菌菌落特征。菌株細(xì)胞呈球形至橢圓形，有明顯的出芽生殖特征。顯微鏡下觀察，該菌株產(chǎn)生了假菌絲。生殖方式主要是不對稱擲孢子、芽殖。鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1已于申請日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國際保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101。保藏日期2016年10月27日，菌種保藏號為CGMCCNo.13159。經(jīng)微生物學(xué)鑒定暫命名為鎖擲酵母(Sporidiolussp.)。本發(fā)明提供的鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1CGMCCNo.13159能夠在適合其增殖的固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，利用常規(guī)固體斜面培養(yǎng)培養(yǎng)、低溫保藏的方法，每次傳代可保藏3個月以上，以干燥冷凍法制做的長期保藏菌種，可保藏1年以上，或是以甘油管進(jìn)行長期保藏。2、分類、鑒定：通過觀察鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1CGMCCNo.13159菌落形狀和生理生化特點，提取鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1的總DNA，采用ITSPCR擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠純化、測序，其序列參見附后提供的SEQUENCELISTING。(1)鎖擲酵母(Sporidiolussp.)總DNA提取步驟如下:從培養(yǎng)基中刮取菌株，去除瓊脂，加入200ullysisbufA，研磨至粉狀，加入600ullysisbufA，0.8ulβ巰基乙醇，充分混勻，65℃水浴40min，12000rpm，10min離心，去上清，加等體積氯仿抽提，12000rpm，5min離心，加入700ulBindingbufB，上柱靜置5min，12000rpm，2min離心，加入500ul80％乙醇洗2次，12000rpm，1min離心，室溫靜置10min揮發(fā)晾干，加40ulH2O，靜置5-10min，換新管，13000rpm，2min離心，管底即為基因組。采用目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系見表1，PCR反應(yīng)條件見表2。(2)擴(kuò)增的目的片段為：ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGGITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC表1：PCR反應(yīng)體系組成體積/ul2XMix25ITS1(10μM)1ITS4(10μM)1DNA模板2ddH2O補(bǔ)齊50表2：PCR反應(yīng)條件(3)回收PCR產(chǎn)物：2.0％瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片斷，加入回收試劑溶液A300ul/0.1g，60℃水浴至膠完全溶化，加入50ul回收試劑溶液B，混勻；將溶液置于離心柱中，靜置5min，12000rpm，1min，棄液體，加入500ul80％乙醇，12000rpm，離心1min，棄液體，重復(fù)一次；12000rpm，離心5min，甩干余液，棄液體，晾干5-8min，將離心柱置于新的離心管中，加入30ul滅菌雙蒸水，靜置10min，13000rpm，離心3min。管底即為純化產(chǎn)物，取3ul電泳檢測。PCR擴(kuò)增得到基因全長為608bp，進(jìn)行ITSBLAST比較，進(jìn)行聚類分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。所得MI-1的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行BLAST比較，確定與實驗菌株親緣關(guān)系最近的種屬。菌株獲得的序列登錄號為KY041635，通過BLAST同源比對，獲取相關(guān)種屬的基因序列，利用ClustaIX軟件將序列進(jìn)行排列后采用鄰接法構(gòu)建菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹，系統(tǒng)進(jìn)化樹參見附圖1，由系統(tǒng)進(jìn)化樹可知，菌株MI-1與Sporidiobolusmetaroseus聚在同一支上是其近似種，菌株歸屬于鎖擲酵母(Sporidiolussp.)，菌株MI-1與Sporidiobolusmetaroseus(KX376263.1)的序列最大相似性達(dá)到99％，初步確定其為鎖擲酵母(Sporidiolussp.)，具有新菌種典型性的特點，從分類學(xué)角度暫命名為鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1，具有與常見的鎖擲酵母屬成員菌種不同的特點，具有鮮明的新菌種特性。通過上述對于菌種鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1CGMCCNo.13159的菌體形態(tài)、培養(yǎng)特征觀察及分子水平鑒定，即通過菌體形態(tài)觀察、菌株培養(yǎng)特征觀察、生長溫度測定，與常見的鎖擲酵母相比，參照《參照《真菌鑒定手冊》，編號為MI-1的菌種與常見的鎖擲酵母屬真菌菌種相比，盡管具有共性的一些屬性，但是具有新菌種典型性的特點，通過分子水平的差異性和基因序列的分析，表明MI-1菌株是一種典型的新菌種，從菌種分類角度將菌種編號為MI-1的菌株綜合鑒定為鎖擲酵母(Sporidiolussp.)。實施例二：利用鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1CGMCCNo.13159制備溶煤制劑的方法利用鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1CGMCCNo.13159制備溶煤制劑的方法，具體步驟如下：(1)液體溶煤制劑：篩選出的菌株MI-1接到裝有10mLPDA液體培養(yǎng)基的試管中，在30℃、150r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)24-36h后，試管中加10mL無菌水劇烈振蕩后，經(jīng)適當(dāng)稀釋制備成含有106個孢子懸浮液。吸取上述孢子懸浮液1mL，接種于PDA液體培養(yǎng)基中，25℃、150rpm培養(yǎng)96h，得到種子液。按3％-5％接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在pH＝7、25℃-30℃、150rpm條件下培養(yǎng)4d—5d，收獲菌體及發(fā)酵液。該發(fā)酵液密封包裝，即可獲得溶煤制劑。(2)固體溶煤制劑：篩選出的菌株MI-1接到裝有10mLPDA液體培養(yǎng)基的試管中，在30℃、150r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)24-36h后，試管中加10mL無菌水劇烈振蕩后，經(jīng)適當(dāng)稀釋制備成含有106個孢子懸浮液。吸取上述孢子懸浮液1mL，接種于PDA液體培養(yǎng)基中，25℃、150rpm培養(yǎng)96h，得到種子液。按3％-5％接種量接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基，25℃-30℃，固體發(fā)酵4d－5d，至菌絲長滿固體培養(yǎng)基，上層有大量孢子產(chǎn)生，即可獲得固體溶煤制，密封保存。實施例三：鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1CGMCCNo.13159的風(fēng)化煤降解實驗在三號風(fēng)化煤粉降解試驗中，設(shè)置一個空白對照組，添加培養(yǎng)基和煤的試驗組2，添加培養(yǎng)基、煤和鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1的試驗組3、試驗組4、試驗組5；在一號風(fēng)化煤降解試驗中，設(shè)置一個空白對照組，8組添加培養(yǎng)基、煤和鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1的試驗組。量取150mLCZAPECKDOX—medium培養(yǎng)基加到500mL的錐形瓶中。培養(yǎng)基滅菌后，將初步篩選得到的MI-1菌株加入瓶中，在30℃，150r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)24-36h，在試驗組中加入滅菌處理過的三號風(fēng)化煤粉和一號風(fēng)化煤3g，在30℃、150r/min的條件下混合振蕩培養(yǎng)15d。使用本發(fā)明提供的一種鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1CGMCCNo.13159發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液在10000r/min的條件下離心10min，離心后再將發(fā)酵液通過微孔濾膜過濾，以徹底清除發(fā)酵液中的菌絲和剩余的煤。在發(fā)酵液中加入濃鹽酸，直到發(fā)酵液的pH一直保持在2以下。加入酸后發(fā)酵液會產(chǎn)生絮狀沉淀，再通過離心和過濾的方式獲得沉淀，沉淀即為降解產(chǎn)物，用容量法測定降解后煤的總腐值酸含量，為34.6％。將沉淀在60℃的烘箱中烘干至恒重。菌株的降解率是降解產(chǎn)物的質(zhì)量與加入煤樣質(zhì)量之比，即η＝(M1/M0)×100％，M0為煤樣的質(zhì)量(g)，M1為煤降解產(chǎn)物的質(zhì)量(g)。鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1CGMCCNo.13159菌株對三號風(fēng)化煤粉降解效果參見圖2，對一號風(fēng)化煤降解效果參見圖3。表3為菌株MI-1對三號風(fēng)化煤的轉(zhuǎn)化結(jié)果，表4為MI-1對一號風(fēng)化煤的轉(zhuǎn)化結(jié)果。表3：菌株MI-1對三號風(fēng)化煤的轉(zhuǎn)化結(jié)果項目發(fā)酵前pH發(fā)酵后pH轉(zhuǎn)換率(％培養(yǎng)基770培養(yǎng)基+菌760培養(yǎng)基+煤761.4培養(yǎng)基+菌+煤71028.06表4：MI-1對一號風(fēng)化煤的轉(zhuǎn)化結(jié)果項目發(fā)酵前pH發(fā)酵后pH轉(zhuǎn)換率(％)培養(yǎng)基770培養(yǎng)基+菌760培養(yǎng)基+煤761.4培養(yǎng)基+菌+煤79.524.32通過上述試驗可知，本發(fā)明提供的一種鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1CGMCCNo.13159，對一號風(fēng)化煤的轉(zhuǎn)化率為24.32％，對三號風(fēng)化煤的轉(zhuǎn)化率為28.06％，通過對一號風(fēng)化煤和三號風(fēng)化煤的降解試驗，證明該菌株對風(fēng)化煤具有穩(wěn)定和顯著的降解效果。通過上述系列實施例提供的鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1CGMCCNo.13159是一種典型的新菌種，該菌株最適生長條件為：溫度25℃，培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，pH＝7，培養(yǎng)時間：48-72h。該菌株對低階煤具有較高的降解效果，同時具有培養(yǎng)條件簡單，繁殖快的特點。將鎖擲酵母(Sporidiolussp.)MI-1CGMCCNo.13159通過發(fā)酵技術(shù)獲得的溶煤制劑，應(yīng)用到一號風(fēng)化煤和三號風(fēng)化煤等低階煤中，具有穩(wěn)定和顯著的降解效果，對于微生物菌種應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
具有廣泛的應(yīng)用價值。上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所延伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。SEQUENCELISTING<110>新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所（中國新疆—亞美尼亞生物工程研究開發(fā)中心）<120>一種鎖擲酵母MI-1及其在風(fēng)化煤降解中的應(yīng)用<130>MI-1<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>608<212>DNA<213>MI-1<220><221>MI-1<222>(1)..(608)<400>1cttccgtaggggaacctgcggaaggatcattagtgaataaatagggtgtccaatttaact60tggaacccgaccttctcacatctaaccctgtgcatctgtatataatggcgagcaattttc120gaattgtgagccatttcactttataaacactagtctatgaatgtaaaatttttataacaa180taaaaactttcaacaacggatctcttggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgc240gatacgtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcatcttgcgc300tctctggtattccggagagcatgtctgtttgagtgtcatgaattcttcaacccaactgtt360tcttgtaaacagctggtgtttggattctgagcgctgctggcttcgtgcctagctcgttcg420taatacatcagcatccctaatgcaagtctggattgacttggcgtaatagactattcgcta480aggattcaatgttctgcattgagccaacttaattaaggaagcttctaattgaaaagtcta540cctttagattagatctcaaatcaggcaggattacccgctgaacttaagcatatcaataag600cggaggaa608當(dāng)前第1頁1 2 3