專利名稱：一株絲孢酵母及其在降解苯酚中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，涉及一株苯酚降解菌及其在環(huán)境污染控制中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
苯酚是有機合成的常用原料，酚類化合物廣泛存在于煉焦、制藥、造紙、染料、酚醛樹脂合成以及石油化工等行業(yè)廢水中，苯酚是含酚廢水的主要污染物，據(jù)國家環(huán)保局統(tǒng)計2003年我國酚類物質(zhì)排放量約為3000噸。苯酚屬于原生質(zhì)毒物，對生物具有毒害作用，對人類神經(jīng)系統(tǒng)的危害尤其嚴重(Paula M et al.， Isolation and characterization of phenol-degradingdenitrifying bacteria [J]. Appl. Environ. Microbiol., 1998， 64(7): 2432-2438.)，水中酚類化合物含量達到O. 005 mg/L時就不能飲用，含酚量> 100mg/L的灌溉水將導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)和枯死(李淑彬等.蠟狀芽孢桿菌菌株Jp-A的分離鑒定及其降解苯酚特性[J]，應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2006, 15(2):920-924.)，因此苯酚被列為國家環(huán)保局1989年通過的"水中優(yōu)先控制污染物黑名單"。
當(dāng)苯酚濃度>1000 mg/L時，苯酚的回收成為首選方法，苯酚的回收方法有吸附法(T.Viraraghavan & Flor de Maria Alfaro, Adsorption of phenol from wastewater by peat, fly ash andbentonite[J], J. Hazard. Mater. 57 (1998) 59—70)、溶劑萃取(Hong Jiang et al.， Studies on theextraction of phenol in wastewater [J], J. Hazard. Mater. B 101 (2003) 179—l卯)以及液膜分離(Jinyi Luan & A. Plaisier, Study on treatment of wastewater containing nitrophenol compounds byliquid membrane process[J], J. Membr. Sci. 229 (2004) 235—239)等方法，苯酚的回收率可達90%以上。苯酚污水的處理有物理、化學(xué)氧化及生物降解方法等(張錦等，含酚廢水的危害及處理方法的應(yīng)用特點[J].環(huán)境工程,2001， 83(2): 36-37),對于難于回收的含苯酚廢水，生物降解具有溫和、效率高、應(yīng)用范圍廣、處理能力大、設(shè)備簡單、和不產(chǎn)生二次污染等特性。文獻報道已篩選到可降解苯酚的微生物多種，其中多數(shù)為不動桿菌C4d"柳^c加sp.)(陳明，張維，醋酸鈣不動桿菌PHEA—2對苯酚的降解特性研究[J].中國環(huán)境科學(xué),2001， 21(3): 226-229)、假單胞菌(Psew(iowcwa51 sp.) (Arinjay Kumar et al., Biodegradation kinetics of phenol and catecholusing i^wfitowoww /7W"'cto MTCC1194[J]. Biochem. Eng. J., 2004, 22: 151-159)、紅球菌(i^ocfococc^sp.)(沈錫輝等，苯酚降解菌紅球菌PNAN5菌株的分離鑒定、降解特性及其開環(huán)雙加氧酶性質(zhì)研究[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2004， 24: 482—486)、微球菌(M/crococc^ sp.)(潘利華等，苯酚降解菌的篩選及其降解特性的初步研究[J].微生物學(xué)通報，2003， 30(5): 78-81)、
3皮狀絲孢酉孝母(7WcAcw/ ora" c由we訓(xùn))(Andras Gaal & Halina Y. Neujahr， Metabolism of phenoland resorcinol in TWc/zosjpoto" c由"e調(diào)[J]， J. Bacteriol., 1979， 137(1): 12-31)、假絲酵母(Cawd油sp.) (Jiang Yan et al., The biodegradation of phenol at high initial concentration by theyeast C朋&Wa &op/cafe[J]， Biochem. Eng. J.， 2005， 24: 243-247)以及絲狀真菌(Santos V L &Linardi V R, Biodegradation of phenol by a filamentous fungi isolated from industrialeffluents-identification and degradation potential[J], Process Biochem. 2004， 39: 1001—1006)等，其中假絲酵母耐苯酚濃度可達2000mg/L，投加于活性污泥中可成為處理含酚廢水的優(yōu)勢菌群，苯酚降解率可達95%以上，未投加菌種的活性污泥其對照苯酚降解率低60%(朱永光等，活性污泥系統(tǒng)處理苯酚廢水的生物強化效果[J]，應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報,2006， 12(4): 559-561)，皮狀絲孢酵母(7>7'c/za^oraw cw/朋eww)的耐酚濃度亦可達2000mg/L(Andras Gaal & Halina Y.Neujahr, Metabolism of phenol and resorcinol in 7>/c/w5/ oto cwtowe訓(xùn)[J]， J. Bacteriol" 1979，137(1): 12-31)。
作為一種石油化工衍生產(chǎn)物和化工主要原料之一，苯酚以廢物形式存在于環(huán)境之中時對環(huán)境構(gòu)成威脅，而活性污泥法處理苯酚廢水具有一些限制因素，因為苯酚具有原生質(zhì)毒性，多數(shù)菌種難以耐受高于500mg/L苯酚毒性；其次苯酚廢水如煉焦廢水中往往含有一定濃度的重金屬離子，重金屬濃度高于一定的范圍將對苯酚的生物降解產(chǎn)生抑制作用。所以尋求開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的耐受高濃度苯酚以及重金屬毒性的生物降解菌株具有重要的經(jīng)濟和科學(xué)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株可降解高濃度苯酚的菌株及其應(yīng)用。
該菌株為絲孢酵母屬菌株(7Hc/zo^orawwo"fewWee"w) ， 2009年6月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號CGMCCNo.3144。
該菌株屬于真菌酵母類；在苯酚選擇性固體培養(yǎng)基上生長有大量菌絲，菌落中間突起，邊緣有樹枝狀輻射菌絲，無皺褶，乳白色，于3(TC左右生長。細胞橢球狀、棒狀，有出芽生殖，有棒狀節(jié)孢子。
本發(fā)明的另一個目的是提供該菌株的應(yīng)用方法降解含苯酚污水，該方法具有顯著耐受高濃度苯酚以及耐受重金屬毒性、降解速度快的優(yōu)勢。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明人進行了大量深入細致的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從中國華北油田石油污染土樣中篩選得到的7Wc/zo;ypor(m mcmtev/cfee附e PHE1菌株，與國外報道的可耐受2000mg/L的皮狀絲孢酵母(7Wc/ o^ora" 同屬絲孢酵母屬，在實驗室規(guī)模下可耐
受2500mg/L的苯酚濃度，對1200mg/L的苯酚的降解率24h內(nèi)達99X以上，該菌株降解苯酚后的殘留濃度可低于0.5mg/L，達標(biāo)排放。重金屬錳、鉛、隔、銅、鋅離子濃度2.5mmol/L時，降解率仍可高達98%以上。
本發(fā)明的另外一個方面提供了一種苯酚廢水的處理方法，該方法包括將7Hc/wwww7mo"fewVfewwPHEl菌株接種種子培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)后接種苯酚廢水，通氣進行降解。
本發(fā)明通過利用高效苯酚降解菌7Wc/za^orow wo"fev/cfee"w PHE1，可高效、快速降解含苯酚廢水，并能耐受一定的重金屬濃度。
通過下面的附圖和詳細描述，本發(fā)明這些方面的特征和優(yōu)點將更為清楚。


圖1是7Hc/2asporaw wcw&v/^e似e PHE1的平板培養(yǎng)菌落圖片。圖2是2Wc/zo5^oroM mo"teWcfeewse PHE1的菌絲形態(tài)的顯微圖片。圖3是對不同濃度苯酚的降解情況。圖4是重金屬濃度分別為2.5 mmol/L時對苯酚的降解情況。
本發(fā)明中，除非特別指明，術(shù)語"苯酚降解菌"是指可以苯酚為唯一碳源和能源進行生長的微生物菌株，即菌株在增殖或代謝過程中可將苯酚降解為二氧化碳和水而去除。
本發(fā)明中，除非特別指明，術(shù)語"含酚廢水"或者"苯酚廢水"是指工業(yè)過程中產(chǎn)生的以苯酚為主要有機污染物組成的污水。
本發(fā)明中，除非特別指明，術(shù)語"碳源"是指微生物可利用的含碳物質(zhì)，微生物利用該含碳物質(zhì)合成自身細胞的含碳物質(zhì)。術(shù)語"能源"是微生物細胞可氧化其產(chǎn)生電子，在電子傳遞過程中產(chǎn)生ATP供細胞利用的物質(zhì)。
具體實施例方式
(1)培養(yǎng)基
斜面培養(yǎng)基胰蛋白胨20g/L、酵母膏10g/L、氯化鈉20g/L、瓊脂粉2.0%。種子培養(yǎng)基胰蛋白胨5g/L、酵母膏5g/L、氯化鈉10g/L、葡萄糖10g/L。人工含酚廢水培養(yǎng)基磷酸氫二鈉6g/L、磷酸二氫鉀3g/L、氯化鈉0.5g/L、氯化銨10g/L、 硫酸鎂0.24g/L、無水氯化鈣0.011g/L、苯酚50-3000 mg/L根據(jù)情況調(diào)整，固體培養(yǎng)基中加入 瓊脂粉2.0%。
培養(yǎng)基在12rC高壓蒸汽滅菌器中滅菌15min備用。
(2) 菌株的篩選與分離純化 稱取一定質(zhì)量的華北油田石油嚴重污染土樣加入生理鹽水活化一定時間后取20ml接入
苯酚濃度50mg/L的人工廢水培養(yǎng)基，置于3(TC， 180r/min的搖床中進行振蕩培養(yǎng)2-3天后轉(zhuǎn)接 至苯酚濃度100mg/L的人工廢水，繼續(xù)培養(yǎng)2-3天后轉(zhuǎn)接苯酚濃度200mg/L的人工廢水培養(yǎng)基， 如此逐漸增加苯酚濃度至500mg/L培養(yǎng)2-3天后采用稀釋涂布法涂布于苯酚濃度500mg/L的平 板，30'C培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天后挑取較大的菌落進行劃線分離、純化，最后將純菌株接種在斜面 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后于4'C冰箱冷藏。
(3) 菌株的形態(tài)觀察與分子生物學(xué)鑒定
菌絲采用光學(xué)顯微鏡觀察(如圖2)。 IO倍鏡下可觀察到樹枝狀菌絲呈輻射狀生長，40倍 下可清晰觀察到節(jié)孢子和出芽生殖細胞，IOO倍下觀察到呈橢球狀芽殖細胞和棒狀裂殖節(jié)孢 子。
菌株鑒定采用28SrDNA進行，正向引物5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3',反 向引物5'-GGTCCGTGTTT CAAGACGG-3'， PCR (ABI 9700)條件94。C預(yù)變性2min， 94。C變性10s， 55'C退火5s， 72'C延伸10s, 35個循環(huán)，72X:延伸2min，測序使用ABI 3730 DNA 測序儀。序列如SEQ ID N0.1所示。NCBI BLAST 26S rRNA序列搜索結(jié)果與7h'c/zo5pora" woWeWJee"se菌株同源性99。/。，命名為rn'c/w少onw moWevfcfee"" PHE1 ，于2009年6月26日保 藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號CGMCCNo. 3144。
(4) 苯酚的降解實驗
菌種接種種子培養(yǎng)基，置于3(TC， 180r/min的搖床中進行振蕩培養(yǎng)24hhrs。取一定體積 種子培養(yǎng)液，離心(4000rpm，下同)，菌體采用生理鹽水洗滌離心后轉(zhuǎn)移至上述人工苯酚 廢水中，置于30'C， 180r/min的搖床中進行振蕩培養(yǎng)一定時間后取培養(yǎng)液5ml進行離心，取 上層清液檢測苯酚濃度。
(5) 苯酚濃度測試使用4-氨基安替比林直接光度法(國家環(huán)保局《水和廢水監(jiān)測分 析方法》編委會，《水和廢水監(jiān)測分析方法》[M].北京中國環(huán)境科學(xué)出版社，1997,408-410)。
(6) 細胞干重:培養(yǎng)液5ml進行離心,下層菌體使用去離子水洗滌三次后放置烘箱中8(TC烘干至恒重測細胞干重。
(7)苯酚降解率計算
苯酚降解率(％) =:￡lZ￡lx100% co指的是初始苯酚濃度，"指的是降解結(jié)束時測試苯酚濃度。
本專利采用可高效降解苯酚7Hc/2cw;ww7 woWev/ifemse PHE1菌株降解苯酚，具有耐受高 濃度苯酚、降解速度快以及耐受重金屬毒性等優(yōu)勢。
實施例l菌株種子培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后取10ml菌液離心后水洗接入20ml不同濃度的人 工苯酚廢水中，3(TC通氣培養(yǎng)，24hrs后降解結(jié)果如圖3所示。
其耐苯酚濃度達2500mg/L (如圖3)所示，對1200 mg/L的苯酚的降解率24h內(nèi)達99X以 上，該菌株降解苯酚后的殘留濃度可低于0.5mg/L，達標(biāo)排放。
實施例2菌株種子培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后取10ml離心后水洗接入20ml含2.5mmol/L的不同 重金屬的人工廢水中，3(TC通氣培養(yǎng)，24hrs后降解結(jié)果如圖4所示。
重金屬錳、鉛、隔、銅、鋅離子濃度2.5mmol/L時，降解率仍可高達98%以上，對該菌株 的苯酚降解影響不大。<110>南京師范大學(xué)
<120> —株絲孢酵母及其在降解苯酚中的應(yīng)用
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<160> 1
< 170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 611
<212> DNA
<213> Trichosporon montevideense
<400> 1
tacaggcatt cccctagtac ggcgagtgaa ccgggaaaag ctcaaatttg aaatctggct 60
gtcttcgata gtccgagttg taatctatag aagcgttttc cgtgctgaac tgtgtctaag 120
tcccttggaa cagggtatca aagagggtga taatcccgta cttgacacaa ccatcagtgc 180
tctgtgatac gttctctacg agtcgagttg tttgggaatg cagctcaaaa tgggtggtaa 240
attccatcta aagctaaata ttggcgagag accgatagcg aacaagtacc gtgagggaaa 300
gatgaaaagc actttggaaa gagagttaaa cagtacgtga aattgttgaa agggaaaega 360
ttgaagtcag tcgtgttcat tggattcagc tagttcttct agtctacttc ctttgaacgg 420
gtcaacatca gttttgtccg gtggataaag gatttaggaa tgtgactecc tcgggagtgt 480
tatagcctag gttcacatac actgggtgag actgaggact gcagctcgcc ttttggccgg 540
ggttcgccca cgttcgagct taggatgttg acataatggc tttaaacgac ccgtcttgaa 600
acacggaeca a 61權(quán)利要求
1、一株絲孢酵母菌株(Trichosporon montevideense)，其保藏號為CGMCC No.3144。
2、 如根據(jù)權(quán)利要求l所述的絲孢酵母CGMCCNo.3144，其特征是，它的26S rDNA序列如SEQ ID NO.l所示。
3、 權(quán)利要求l所述的絲孢酵母CGMCCNo. 3144菌株在降解苯酚中的應(yīng)用。
4、 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，具體是將絲孢酵母CGMCC No. 3144菌株接種種子培養(yǎng)基，過 夜培養(yǎng)后接種苯酚廢水，通氣進行降解。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株可以高效降解苯酚的絲孢酵母菌株。本發(fā)明的目的是提供一種苯酚降解菌及利用該苯酚降解菌進行苯酚降解的應(yīng)用。本發(fā)明提供的苯酚降解菌為絲孢酵母Trichosporon montevideense CGMCC No.3144。本發(fā)明提供的方法是利用Trichosporon montevideense CGMCC No.3144進行生物降解苯酚污水。過程包括經(jīng)斜面種子培養(yǎng)以及至少二級種子培養(yǎng)，或者以Trichosporon montevideense保藏號CGMCC No.3144為優(yōu)勢菌種的活性污泥，轉(zhuǎn)接污水進行苯酚降解。本發(fā)明技術(shù)具有可耐受高濃度苯酚、重金屬毒性以及高效快速消除苯酚污染等優(yōu)勢。
文檔編號C12N1/16GK101659927SQ20091018201
公開日2010年3月3日 申請日期2009年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月29日
發(fā)明者惠 劉 申請人:南京師范大學(xué)