本發(fā)明涉及植物病理學(xué)技術(shù)。具體是一種灰霉病菌實(shí)驗(yàn)室材料的常備形態(tài)及其制備與應(yīng)用方法。

背景技術(shù)：

作物灰霉病是葡萄、番茄、黃瓜等作物的重要病害，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)可給生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。防病控害的有關(guān)研究，通常都要使用灰霉病菌(Botrytis cinerea)材料。灰霉病菌在普通培養(yǎng)基上容易生長(zhǎng)，菌絲體發(fā)達(dá)；在實(shí)驗(yàn)室工作中，通常用試管斜面培養(yǎng)基將灰霉病菌培養(yǎng)成斜面菌落，并以菌落的菌絲體材料作為日常工作的常備材料。有關(guān)研究工作的出發(fā)點(diǎn)均以菌絲體材料為起始，通過(guò)移植常備材料菌絲體，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)或進(jìn)入具體項(xiàng)目的研究工作。這種以菌絲體作為日常工作材料的常備形態(tài)，通常較簡(jiǎn)單方便，不過(guò)也存在某些不足，如下：

在與生長(zhǎng)速率(或生長(zhǎng)量)測(cè)定有關(guān)的研究工作(如生長(zhǎng)發(fā)育的影響因素測(cè)定，藥物的抑制作用測(cè)定等)中，往往需要菌絲體的定量移植，而移植培養(yǎng)基中的菌絲體卻很難做到準(zhǔn)確定量，至今的常規(guī)方法是需要先移植菌絲體到培養(yǎng)平板上擴(kuò)大培養(yǎng)，然后用打孔器在擴(kuò)大培養(yǎng)的平板菌落上打取等同直徑的菌絲塊，以此菌絲塊進(jìn)行定量移植；這種定量方式不僅要增加一段擴(kuò)大培養(yǎng)的程序環(huán)節(jié)，而且由于培養(yǎng)平板的厚薄不一致，以及菌落不同部位菌絲體的密集程度、生理狀態(tài)等也有差異，造成不同菌絲塊之間難以達(dá)到較高的一致性。

許多研究工作(如孢子萌發(fā)的影響因素，病害接種等)，使用的直接材料通常是分生孢子，同樣要將常備材料(菌絲體)移植到合適的培養(yǎng)基，先行孢子制備培養(yǎng)工作，獲得孢子后才能實(shí)施相關(guān)工作。這相當(dāng)于相關(guān)工作進(jìn)程需要延后，不能及時(shí)開(kāi)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種灰霉病菌實(shí)驗(yàn)室材料的常備形態(tài)及其制備與應(yīng)用方法。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下：

一種灰霉病菌實(shí)驗(yàn)室材料的常備形態(tài)，是用灰霉病菌的分生孢子作日常工作的常備形態(tài)；分生孢子純凈無(wú)污染；分生孢子存放于無(wú)菌水中；分生孢子暫停生長(zhǎng)發(fā)育，但轉(zhuǎn)到培養(yǎng)基上能馬上恢復(fù)正常生長(zhǎng)發(fā)育。

一種灰霉病菌實(shí)驗(yàn)室材料的常備形態(tài)的制備與應(yīng)用方法，制備與應(yīng)用方法步驟如下：

1.分生孢子的制備培養(yǎng)

用三角瓶作培養(yǎng)器具，裝盛馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基作產(chǎn)孢培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的組分配比為：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、水1000mL；將灰霉病菌的菌絲體移植入三角瓶?jī)?nèi)的產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，在合適的溫度下培養(yǎng)，直到培養(yǎng)基面上形成菌落和分生孢子。

2.灰霉病菌材料常備形態(tài)的制備

取無(wú)菌水注入步驟1培養(yǎng)獲得的產(chǎn)孢菌落上，輕輕洗脫菌落上的孢子，獲得含有菌絲碎段的孢子液；用滅菌紗布過(guò)濾去除該孢子液中的菌絲碎段；將該孢子液進(jìn)行離心沉淀，倒掉上清液，除去孢子液中混雜的菌體代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基組分；剩下的沉淀為純凈的分生孢子；以該純凈分生孢子作為灰霉病菌材料的常備形態(tài)；用無(wú)菌水將沉淀孢子懸浮，攪動(dòng)使孢子充分分散，獲得灰霉病菌材料的常備孢子液。

3.灰霉病菌材料常備形態(tài)的孢子含量標(biāo)定

用無(wú)菌水將步驟2獲得的常備孢子液的孢子濃度，調(diào)配為10⁶孢子/mL。

4.灰霉病菌材料常備形態(tài)的日常存放

在無(wú)菌條件下，將步驟3標(biāo)定的常備孢子液分裝到有蓋密閉的滅菌容器內(nèi)，并轉(zhuǎn)移到20℃的暗環(huán)境中存放備用。

5.灰霉病菌材料常備形態(tài)的應(yīng)用

將步驟4存放的灰霉病菌材料常備孢子液轉(zhuǎn)到超凈工作臺(tái)，振蕩裝存常備孢子液的容器，使分生孢子充分懸浮和分散；開(kāi)蓋后用移液器定量吸取孢子液，移植到相關(guān)的工作環(huán)節(jié)或?qū)嶒?yàn)程序中；吸液移植操作完畢后回蓋密封，將剩余的常備孢子液轉(zhuǎn)回步驟4的存放處存放。

本發(fā)明的特色與優(yōu)點(diǎn)是：

1)常備形態(tài)的分生孢子在純水中暫停生長(zhǎng)但能長(zhǎng)期保持活力，一旦轉(zhuǎn)到培養(yǎng)基，能馬上恢復(fù)正常生長(zhǎng)。

2)可在相關(guān)工作中隨時(shí)應(yīng)用，能為需要分生孢子的試驗(yàn)環(huán)節(jié)直接提供菌體材料，可省去使用菌絲體作為常備材料時(shí)，需要反復(fù)制備培養(yǎng)孢子的工作程序，工作方便快捷。

3)用三角瓶作培養(yǎng)器具，容易獲得無(wú)污染的孢子液，制備獲得的常備形態(tài)質(zhì)量較高。

4)能標(biāo)定常備孢子液的孢子含量，應(yīng)用時(shí)可以準(zhǔn)確定量取用，利于技術(shù)方法標(biāo)準(zhǔn)化。

附圖說(shuō)明

圖1是取本發(fā)明的灰霉病菌常備孢子液5μl，移植并點(diǎn)到培養(yǎng)平板上，培養(yǎng)2.5天后形成的菌落。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖與實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。

在灰霉病的有關(guān)研究中，通常采用灰霉病菌的菌絲體材料作常備形態(tài)，每次需要分生孢子材料時(shí)，均要移植常備菌絲體到新的培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)和制備培養(yǎng)孢子。當(dāng)前還未見(jiàn)有應(yīng)用分生孢子作常備移植體的技術(shù)思想和技術(shù)應(yīng)用。發(fā)明人在研究工作中發(fā)現(xiàn)灰霉病菌的分生孢子在純水中能暫停生長(zhǎng)發(fā)育，但轉(zhuǎn)到培養(yǎng)基上能馬上恢復(fù)正常生長(zhǎng)發(fā)育；利用此有利的的生物學(xué)特性，本發(fā)明設(shè)計(jì)灰霉病菌實(shí)驗(yàn)室材料的另一種常備形態(tài)，就是以灰霉病菌的分生孢子材料作常備形態(tài)，以及該常備形態(tài)的制備與應(yīng)用技術(shù)。

一般病原菌的孢子形成發(fā)育，往往需要良好的通氣條件，培養(yǎng)皿通氣性良好，因而實(shí)驗(yàn)室通常用培養(yǎng)皿作培養(yǎng)器具進(jìn)行產(chǎn)孢培養(yǎng)；但正是由于培養(yǎng)皿通氣良好，造成培養(yǎng)皿內(nèi)材料容易污染。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在相對(duì)封閉的三角瓶?jī)?nèi)，灰霉病菌也能正常產(chǎn)孢，而三角瓶阻止污染的效果非常好，因而采用三角瓶作培養(yǎng)器具進(jìn)行產(chǎn)孢培養(yǎng)。

灰霉病菌可在許多培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并形成分生孢子，本發(fā)明采用實(shí)驗(yàn)室常用的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，其配比為：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、水1000mL?；颐共【谌瞧垦b盛的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上，在溫度為23℃的條件下培養(yǎng)7～9天，可在培養(yǎng)基面上形成和布滿(mǎn)大量產(chǎn)孢的菌落。

產(chǎn)孢菌落上的分生孢子可用無(wú)菌水洗滌收集，用玻棒或小毛刷等工具輕輕抹洗菌落就能將孢子洗滌釋放到無(wú)菌水中。

收集孢子的洗滌操作會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基組分和菌落菌絲體的外泌代謝物溶解在孢子液中，這些物質(zhì)可能容易導(dǎo)致孢子的生長(zhǎng)或失活，因而需要去除；可采用離心沉淀孢子方式去除這些物質(zhì)。

作為灰霉病菌材料常備形態(tài)的孢子液，孢子濃度可高可低，考慮到過(guò)高濃度可能會(huì)影響孢子的活性，以及與后續(xù)應(yīng)用的需要匹配，將常備孢子液的孢子濃度調(diào)整在10⁶孢子/mL較為適宜，孢子的數(shù)量用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定。

裝存灰霉病菌材料常備孢子液的容器應(yīng)采用可滅菌及可蓋封密閉的器具，如普通冷凍管或離心管等，用5mL冷凍管裝存較為實(shí)用方便；需要裝存量較多的，可用三角瓶或大冷凍管(或大離心管)。

存放環(huán)境以室溫為宜，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在溫度為20℃的暗環(huán)境存放效果好。

使用灰霉病菌常備孢子液前，需要將常備孢子液振蕩，使已沉淀的孢子重新懸浮和分散均勻。在無(wú)菌條件下用移液器取出常備孢子液，可直接用于相關(guān)的試驗(yàn)工作環(huán)節(jié)，如灰霉病菌的平板培養(yǎng)，或灰霉病的人工接種等。常備孢子液中的孢子分散性好，菌體液的均勻一致性高，加上液體容易準(zhǔn)確定量吸取，因而，本發(fā)明的常備孢子液特別有利于需要定量移植菌體的培養(yǎng)工作，如測(cè)定灰霉病菌生長(zhǎng)發(fā)育的影響因素，測(cè)定藥物的抑制作用等。定量移植5μL本發(fā)明的常備孢子液于培養(yǎng)平板上培養(yǎng)，3天后灰霉病菌的菌落如圖1所示。

為降低實(shí)驗(yàn)操作導(dǎo)致常備形態(tài)孢子液污染的機(jī)率，應(yīng)盡量減少?gòu)难b存常備孢子液的容器內(nèi)反復(fù)吸取液體的頻率，實(shí)際工作可按試驗(yàn)設(shè)計(jì)的需要，一次性全部吸取夠整次試驗(yàn)用的孢子液量，置于另外的滅菌容器內(nèi)，再?gòu)脑撊萜鲀?nèi)逐一定量吸取孢子液，移植到各個(gè)培養(yǎng)平板、三角瓶培養(yǎng)基、或各個(gè)寄主接種部位、等相關(guān)的工作環(huán)節(jié)或?qū)嶒?yàn)程序中。

實(shí)施例1

應(yīng)用本發(fā)明一種灰霉病菌實(shí)驗(yàn)室材料的常備形態(tài)及其制備與應(yīng)用方法，培養(yǎng)制備獲得番茄灰霉病菌菌株Bc-1以分生孢子為菌體的實(shí)驗(yàn)室常備形態(tài)材料；制備與應(yīng)用菌株Bc-1材料的常備形態(tài)按如下步驟實(shí)施操作：

1.分生孢子的制備培養(yǎng)

用三角瓶作培養(yǎng)器具，裝盛馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基作產(chǎn)孢培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的組分配比為：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、水1000mL；將灰霉病菌菌株Bc-1的菌絲體移植入三角瓶?jī)?nèi)的產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，在23℃溫度下培養(yǎng)7天后，培養(yǎng)基面上的菌落形成大量的分生孢子。

2.灰霉病菌材料常備形態(tài)的制備

取無(wú)菌水注入步驟1培養(yǎng)獲得的產(chǎn)孢菌落上，輕輕洗脫菌落上的孢子，獲得含有菌絲碎段的孢子液；用滅菌紗布過(guò)濾去除該孢子液中的菌絲碎段；將該孢子液進(jìn)行離心沉淀，倒掉上清液，除去孢子液中混雜的菌體代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基組分；剩下的沉淀為純凈的分生孢子；以該純凈分生孢子作為灰霉病菌材料的常備形態(tài)；用無(wú)菌水將沉淀孢子懸浮，攪動(dòng)使孢子充分分散，獲得灰霉病菌菌株Bc-1的常備孢子液。

3.灰霉病菌材料常備形態(tài)的孢子含量標(biāo)定

用無(wú)菌水將步驟2獲得的常備孢子液的孢子濃度，調(diào)配為10⁶孢子/mL。

4.灰霉病菌材料常備形態(tài)的日常存放

在無(wú)菌條件下，將步驟3標(biāo)定的常備孢子液分裝到5mL冷凍管內(nèi)，并轉(zhuǎn)移到20℃的暗環(huán)境中存放備用。

5.灰霉病菌材料常備形態(tài)的應(yīng)用

將步驟4存放的灰霉病菌材料常備孢子液轉(zhuǎn)到超凈工作臺(tái)，振蕩裝存常備孢子液的容器，使分生孢子充分懸浮和分散；開(kāi)蓋后用移液器吸取孢子液使用；吸液操作完畢后回蓋密封，將剩余的常備孢子液轉(zhuǎn)回步驟4的存放處存放。

用移液器定量吸取該常備孢子液5μL，移植到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)平板中部，23℃培養(yǎng)2.5天后，生長(zhǎng)形成如圖1所示的典型菌落。

實(shí)施例2

應(yīng)用本發(fā)明一種灰霉病菌實(shí)驗(yàn)室材料的常備形態(tài)及其制備與應(yīng)用方法，培養(yǎng)制備獲得番茄灰霉病菌菌株Bc-2以分生孢子為菌體的實(shí)驗(yàn)室常備形態(tài)材料；制備與應(yīng)用菌株Bc-2材料的常備形態(tài)按實(shí)施例1的步驟1至步驟5實(shí)施操作，不同的只是步驟1所用的菌株是Bc-2，步驟2獲得的是菌株Bc-2的常備孢子液。

用移液器吸取常備孢子液5μL，移植到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)平板中部，23℃培養(yǎng)2.5天后，生長(zhǎng)形成如圖1所示的典型菌落。