大腸桿菌的快速檢驗(yàn)試劑盒及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)菌檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及大腸桿菌的檢測(cè)裝置與方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大腸桿菌是人和許多動(dòng)物腸道中最主要且數(shù)量最多的一種細(xì)菌，周身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，無(wú)芽孢。主要生活在大腸內(nèi)。大腸桿菌是引發(fā)腸道疾病以及系統(tǒng)性疾病的主要病原菌。研究表明，飲用水、食品中大腸桿菌的數(shù)量，可作為其安全程度的重要指標(biāo)。因此，大腸桿菌的檢測(cè)具有重要研究意義。
[0003]傳統(tǒng)大腸桿菌檢測(cè)主要有兩種方法，一種需要進(jìn)過提取分離培養(yǎng)，細(xì)菌形態(tài)鑒定等步驟較為繁瑣。然而，這種技術(shù)具有局限性，多種細(xì)菌并不具可供鑒定的形態(tài)學(xué)特征；細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)本身會(huì)引入很大的誤差，重復(fù)性低。這種傳統(tǒng)大腸桿菌檢測(cè)試劑的種類繁多耗時(shí)較長(zhǎng)，而且試劑大多放在各個(gè)試劑瓶?jī)?nèi)，取用較為麻煩而且還容易搞錯(cuò)試劑，不利于長(zhǎng)期發(fā)展。另外一種，實(shí)時(shí)熒光定量PCR，可將細(xì)菌樣品的特異性DNA進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。但這種方法極易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物，從而形成假陽(yáng)性結(jié)果。
[0004]本方案提出的大腸桿菌的16S rDNA基因鑒定手段可克服以上問題。該手段不需細(xì)菌培養(yǎng)，直接提取樣品基因組，繼而進(jìn)行特異性基因擴(kuò)增檢測(cè)。所需時(shí)間只需數(shù)小時(shí)。本發(fā)明所用的16S rDNA基因片段異性強(qiáng)，能有效地作為目標(biāo)大腸桿菌的鑒定標(biāo)記，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本發(fā)明所用的PCR技術(shù)和電泳技術(shù)靈敏度高，電泳技術(shù)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離/純化檢測(cè)，從很大程度上排除假陽(yáng)性的可能性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于，提供一種大腸桿菌的快速檢驗(yàn)試劑盒，解決以上技術(shù)問題。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于，提供一種大腸桿菌的快速檢測(cè)方法，解決以上技術(shù)問題。
[0007]本發(fā)明所解決的技術(shù)問題可以采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):
[0008]—種大腸桿菌快速檢驗(yàn)的試劑盒，包括試劑盒主體，其特征在于，所述試劑盒主體還設(shè)有至少三個(gè)相對(duì)獨(dú)立的密封腔室，分別為裝有預(yù)處理液的第一腔室，裝有PCR反應(yīng)液的第二腔室和裝有電泳液的第三腔室；
[0009]所述預(yù)處理液是一用于溶解并分散大腸桿菌的處理液；所述PCR反應(yīng)液是一用于對(duì)大腸桿菌的16S rDNA片段進(jìn)行特異性的復(fù)制增殖的PCR反應(yīng)液；所述電泳液是一用于將采用所述PCR反應(yīng)液得到的DNA分子進(jìn)行電泳檢測(cè)的電泳液。
[0010]本發(fā)明通過預(yù)處理液能夠免去提取分離培養(yǎng)等步驟，可以直接得到大腸桿菌基因組，節(jié)省了時(shí)間提高了效率。所述預(yù)處理液能破壞采集到的細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，獲得細(xì)菌細(xì)胞的內(nèi)容物將細(xì)菌的DNA釋放到溶液中的預(yù)處理液。PCR反應(yīng)液提供反應(yīng)引物，反應(yīng)原材料，合成所需要的酶。
[0011]所述第一腔室設(shè)有第一管路，所述第二腔室設(shè)有第二管路，所述第一管路和第二管路設(shè)有至少一個(gè)第一交叉點(diǎn)，所述第一交叉點(diǎn)為所述預(yù)處理液和所述PCR反應(yīng)液進(jìn)行反應(yīng)的第一反應(yīng)點(diǎn)；所述第三腔室設(shè)有第三管路，所述第三管路與所述第二管路設(shè)有至少一個(gè)第二交叉點(diǎn)，所述第二交叉點(diǎn)為所述PCR反應(yīng)液和所述電泳液進(jìn)行反應(yīng)的的第二反應(yīng)點(diǎn)。確保第一腔室，第二腔室導(dǎo)通、第二腔室與第三腔室導(dǎo)通。
[0012]所述第一腔室設(shè)有第一管路，所述第二腔室設(shè)有第二管路，所述第一管路和第二管路設(shè)有至少一個(gè)第一交叉點(diǎn)，所述第一交叉點(diǎn)為所述預(yù)處理液和所述PCR反應(yīng)液進(jìn)行反應(yīng)的第一反應(yīng)點(diǎn)；所述第三腔室設(shè)有第三管路，所述第一反應(yīng)點(diǎn)與所述第三管路設(shè)有至少一個(gè)第二交叉點(diǎn)。確保第一腔室，第二腔室導(dǎo)通，所述預(yù)處理液和所述PCR反應(yīng)液在第一交叉點(diǎn)進(jìn)行反應(yīng)，第二交叉點(diǎn)與第三腔室導(dǎo)通，從而實(shí)現(xiàn)所述預(yù)處理液和所述PCR反應(yīng)液反應(yīng)后的反應(yīng)液與電泳液在第二交叉點(diǎn)反應(yīng)。
[0013]所述第一管路與所述第三管路設(shè)有至少一個(gè)第三交叉點(diǎn)。
[0014]確保第一腔室，第二腔室和第三腔室三者之間兩兩相互導(dǎo)通便于檢測(cè)。
[0015]所述預(yù)處理液是磷酸緩沖鹽溶液。
[0016]所述磷酸緩沖鹽溶液主要成分以質(zhì)量百分比，包括3 O %?4 5 %磷酸二氫鉀、15%?25%磷酸氫二鈉、25%?35%氯化鈉、10%?13%氯化鉀和10%?15%水。磷酸緩沖鹽溶液具有鹽平衡、可調(diào)整的適宜PH緩沖作用。
[0017]所述PCR反應(yīng)液主要成分以容積計(jì)，包括3 μ L-1O μ L三羥甲基氨基甲烷緩沖液，2 μ L-8 μ L脫氧核糖核苷三磷酸，0.2 μ L_0.5 μ L DNA聚合酶和I μ L-2 μ L大腸桿菌細(xì)菌的特異性引物和35 μ L-40 μ L去離子水。三羥甲基氨基甲烷緩沖液用作核酸和蛋白質(zhì)的溶劑，也是蛋白質(zhì)電泳緩沖液的主要成分之一。
[0018]所述大腸桿菌細(xì)菌的特異性引物的濃度在150nmol/L?250nmol/L之間。
[0019]所述脫氧核糖核苷三磷酸的濃度在2nmol/L?3nmol/L之間。
[0020]最適條件可進(jìn)行梯度實(shí)驗(yàn)進(jìn)行調(diào)整。
[0021]所述三羥甲基氨基甲烷緩沖液的PH值在7.8?8.4之間，優(yōu)選為PH = 8。
[0022]弱堿環(huán)境下緩沖液發(fā)揮的功效最大。
[0023]所述電泳液是羥乙基纖維素溶液。對(duì)電介質(zhì)具有異常好的鹽溶性。
[0024]所述特異性引物序列為:
[0025]上游引物:5’ -GGAAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGAC-3 ’
[0026]下游引物:3’-AGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTA-5’。用于對(duì)大腸桿菌細(xì)菌的 16SrDNA片段進(jìn)行特異性的復(fù)制增殖。
[0027]所述試劑盒主體是由聚乙烯制成的試劑盒主體。聚乙烯質(zhì)量輕硬度大，成本低，使用壽命長(zhǎng)。
[0028]所述試劑盒主體保存的條件在-15攝氏度?-30攝氏度，優(yōu)選為-20攝氏度。低溫環(huán)境能保持試劑活性，減慢試劑降解的速度。
[0029]作為一種方案，所述試劑盒主體的體積不超過200 μ L0降低檢測(cè)成本。
[0030]作為另一種方案，所述試劑盒單次使用各試劑的體積均在yL量級(jí)。
[0031]—種大腸桿菌的快速檢測(cè)方法采用所述大腸桿菌快速檢驗(yàn)的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。
[0032]—種大腸桿菌的快速檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0033]步驟一，大腸桿菌待測(cè)樣本液氮研磨，取0.05g?0.07g粉末，浸泡在所述預(yù)處理液中，使得樣本中的大腸桿菌的內(nèi)容物釋放在溶液中；
[0034]步驟二，取步驟一所得到I μ L?20 μ L的溶液，添加到所述PCR反應(yīng)液中，進(jìn)行PCR反應(yīng)，使大腸桿菌的16S rDNA片段進(jìn)行特異性的復(fù)制增殖；
[0035]步驟三，取步驟二所得到的IyL?1yL溶液，使用所述電泳液進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離和檢測(cè)，根據(jù)電泳檢測(cè)到的DNA情況，得出大腸桿菌的陰、陽(yáng)性。
[0036]本發(fā)明減少了多種試劑的使用，從而對(duì)檢測(cè)大腸桿菌的效率進(jìn)行進(jìn)一步的提升，優(yōu)化了檢測(cè)步驟，減少了錯(cuò)誤率。步驟三中若電泳檢測(cè)到544bp的DNA，即表明樣本中含有大腸桿菌，反之則沒有。特異性強(qiáng)，靈敏度高。通過PCR反應(yīng)和特異性引物，樣本中對(duì)應(yīng)于大腸桿菌的特異性DNA序列數(shù)量得到極大增加，其增殖倍數(shù)可達(dá)109，樣本中的少量大腸桿菌細(xì)菌就可被檢測(cè)到。而樣本中其它來(lái)源的DNA數(shù)量則不會(huì)得到增加，不會(huì)干擾目標(biāo)細(xì)菌的檢驗(yàn)。速度快，效率高，每個(gè)PCR產(chǎn)物的電泳檢出時(shí)間通常不超過8分鐘。
[0037]所述步驟三中，若電泳檢測(cè)到來(lái)自于大腸桿菌的544bp的特異性序列，即表明樣本中有大腸桿菌，反之則沒有。
[0038]所述步驟一中，浸泡時(shí)間不少于2分鐘，優(yōu)選為3分鐘。使物質(zhì)充分釋放在溶液中。
[0039]所述步驟二中反應(yīng)條件包括將大腸桿菌待測(cè)樣品放置在常規(guī)PCR儀中，先預(yù)熱5-10分鐘，所述預(yù)熱環(huán)境在90攝氏度?100攝氏度，然后在第一溫度階段和第二溫度階段中反復(fù)循環(huán)10-40次。確保盡可能檢測(cè)到真實(shí)的數(shù)據(jù)。
[0040]所述第一溫度階段為持續(xù)10秒?15秒在95攝氏度?100攝氏度的環(huán)境中；所述第二溫度階段為持續(xù)30秒?40秒在55攝氏度?70攝氏度的環(huán)境中。對(duì)大腸桿菌進(jìn)行特異性的PCR增殖。
[0041]作為一種優(yōu)選方案，所述預(yù)處理液為100 μ L磷酸緩沖鹽溶液，所述PCR反應(yīng)液包括三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH = 8)5 μ L ;脫氧核糖核苷三磷酸0.2mM;DNA聚合酶0.25 μ L，大腸桿菌的特異性引物200ηΜ，上/下游引物各I μ L ;去離子水37.75 μ L ;共49 μ L ;大腸桿菌的特異性引物序列為:
[0042]上游引物:5’ -GGAAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGAC-3 ’
[0043]下游引物:3’ -AGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTA-5 ’ 電泳液:0.5 % 羥乙基纖維素(1300k)溶液，含 Ix SYBR Green I，共 50 μ L0
[0044]作為一種優(yōu)選方案，大腸桿菌的檢測(cè)方法包括:
[0045]步驟一，大腸桿菌待測(cè)樣本液氮研磨，取0.05g?0.07g粉末，浸泡在所述預(yù)處理液中3分鐘，使得樣本中的大腸桿菌的內(nèi)容物釋放在溶液中；
[0046]步驟二，取步驟一所得到I μ L的溶液，添加到所述PCR反應(yīng)液中，將PCR反應(yīng)液置于PCR儀內(nèi)，95°C (預(yù)熱)2分鐘，然后設(shè)置95°C (變性)10秒、64°C (退火和延伸)30秒兩個(gè)溫度階段，循環(huán)40次，最后冷卻至4攝氏度；
[0047]步驟三，取步驟二所得到的溶液置于樣品位置，所述電泳液填充入毛細(xì)管，電場(chǎng)強(qiáng)度lOOV/cm進(jìn)樣2秒；然后以電場(chǎng)強(qiáng)度200V/cm電泳，采用熒光檢測(cè)；若電泳檢測(cè)到來(lái)自于大腸桿菌的544bp的特異性序列，即表明樣本中有大腸桿菌，反之則沒有。
【附圖說明】
[0048]圖1為本發(fā)明的熒光檢測(cè)信號(hào)的一種示意圖；
[0049]圖2為本發(fā)明大腸桿菌的檢測(cè)方法的流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0050]為了使本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體圖示，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0051]參照?qǐng)D1、圖2，一種大腸桿菌快速檢驗(yàn)的試劑盒，包括試劑盒主體，試劑盒主體還設(shè)有至少三個(gè)相對(duì)獨(dú)立的密封腔室，分別為裝有預(yù)處理液的第一腔室，裝有PCR反應(yīng)液的第二腔室和裝有電泳液的第三腔室；預(yù)處理液是一用于溶解并分散大腸桿菌的處理液；PCR反應(yīng)液是一用于對(duì)大腸桿菌的16SrDNA片段進(jìn)行特異性的復(fù)制增殖的PCR反應(yīng)液；電泳液是一用于將采用PCR反應(yīng)液得到的DNA分子進(jìn)行電泳檢測(cè)的電泳液。本發(fā)明通過預(yù)處理液能夠